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Resumo

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Resumo

Antes da degeneração neuronal, a causa dos déficits motores e cognitivos em pacientes com esclerose lateral amiotrófica (ELA) e/ou demência do lobo frontotemporal (FTLD) é a disfunção da comunicação entre neurônios e neurônios motores e músculos. O processo subjacente da transmissão sináptica envolve a fusão de vesícula sináptica dependente da despolarização da membrana e a liberação de neurotransmissores na sinapse. Esse processo ocorre através do influxo localizado de cálcio nos terminais pré-sinápticos onde residem vesículas sinápticas. Aqui, o protocolo descreve metodologias de imagem ao vivo baseadas em fluorescência que relatam de forma confiável exocitose sintárquica mediada pela despolarização e dinâmicas de influxo de cálcio terminal pré-sináptico em neurônios cultivados.

Usando um corante de estilingues que é incorporado em membranas vesículas sinápticas, a liberação de vesícula sináptica é elucidada. Por outro lado, para estudar a entrada de cálcio, o Gcamp6m é usado, um repórter fluorescente geneticamente codificado. Empregamos alta despolarização mediada por cloreto de potássio para imitar a atividade neuronal. Para quantificar a exocistose de vesícula sináptica de forma inequívoca, medimos a perda de fluorescência de corante styryl normalizada em função do tempo. Em condições de estimulação semelhantes, no caso do influxo de cálcio, a fluorescência Gcamp6m aumenta. A normalização e quantificação dessa mudança de fluorescência são realizadas de forma semelhante ao protocolo de corante styryl. Esses métodos podem ser multiplexados com a superexpressão baseada em transfecção de proteínas mutantes fluorescentes marcadas. Esses protocolos têm sido amplamente utilizados para estudar disfunção sináptica em modelos de FUS-ALS e C9ORF72-ALS, utilizando neurônios cortical e motor primários. Esses protocolos permitem facilmente uma triagem rápida de compostos que podem melhorar a comunicação neuronal. Como tal, esses métodos são valiosos não apenas para o estudo da ELA, mas para todas as áreas de pesquisa neurociência neurodegenerativa e de desenvolvimento.

Introdução

A modelagem da esclerose lateral amiotrófica (ELA) em laboratório é feita de forma singularmente desafiadora devido à natureza esmagadoramente esporádica de mais de 80% dos casos1, juntamente com o grande número de mutações genéticas conhecidas como causagens da doença2. Apesar disso, todos os casos de ELA compartilham a característica unificadora de que antes da degeneração neuronal total, há comunicação disfuncional entre neurônios motores pré-sinápticos e células musculares postsináspticas3,4. Clinicamente, à medida que os pacientes perdem a conectividade dos neurônios motores superiores e inferiores restantes, eles apresentam características de hiperexcitabilidade neuronal ao longo da doença5,6,7,8,9, refletindo complexas mudanças moleculares subjacentes a essas sinapses, que nós, como pesquisadores da ALS, buscamos entender.

Múltiplos modelos transgênicos ilustraram que a deterioração e a desorganização da junção neuromuscular ocorrem com a expressão de mutações genéticas causagens causal da ELA, incluindo SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 e TDP4317,18,19 através de avaliações morfológicas, incluindo avaliação de boutons sinápticos, densidades da coluna vertebral e organização pré/postiática. Mecanicamente, desde os trabalhos marcantes de Cole, Hodgkin e Huxley na década de 1930, também foi possível avaliar respostas sinápticas através de técnicas eletrofisiológicas na cultura celular in vitro ou preparações de fatias de tecido20. Por meio dessas estratégias, muitos modelos de ELA têm demonstrado déficits de transmissão sináptica. Por exemplo, uma variante mutante do TDP43 causa maior frequência de disparo e diminui o limiar potencial de ação em NSC-34 (medula espinhal x neuroblastoma célula híbrida linha 34) células semelhantes a neurônios motores21. Esta mesma variante também causa transmissão sináptica disfuncional na junção neuromuscular (NMJ) antes do início de déficits motores comportamentais em um modelo de mouse22. Foi mostrado anteriormente que a expressão de FUS mutante resulta em transmissão sináptica reduzida no NMJ em um modelo de drosophila de FUS-ALS antes de defeitos locomotor11. Um relatório recente usando células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de portadores de expansão C9orf72 revelou uma redução no pool facilmente liberado de vesículas sináptica23. Ao todo, esses estudos e outros destacam a importância de construir uma compreensão mais abrangente dos mecanismos subjacentes à sinalização sináptica em modelos relevantes para doenças da ELA. Isso será fundamental na compreensão da trajetória da ELA e no desenvolvimento de potenciais alvos terapêuticos para os pacientes.

Métodos de células de fixação de corrente e tensão têm sido inestimáveis na determinação de propriedades de membrana, como conduance, potencial de membrana de repouso e teor de sinapses individuais20,24. No entanto, uma das limitações significativas da eletrofisiologia é que ela é tecnicamente desafiadora e só fornece insights de um único neurônio de cada vez. A microscopia confocal de células vivas, juntamente com sondas fluorescentes específicas, oferece a oportunidade de investigar a transmissão sináptica de neurônios de forma espesso25,26,27. Embora não seja uma medida direta de excitabilidade neuronal, essa abordagem de fluorescência pode fornecer uma medição relativa de duas correlações moleculares da função sináptica: liberação de vesícula sináptica e transitórios de cálcio em terminais sinápticos.

Quando um potencial de ação atinge a região terminal pré-sináptica dos neurônios, os transitórios de cálcio são acionados, facilitando a transição de um sinal elétrico para o processo de liberação de neurotransmissores28. Canais de cálcio fechados de tensão localizados nessas áreas regulam fortemente a sinalização de cálcio para modular a cinética da liberação de neurotransmissores29. As primeiras gravações relatadas baseadas em fluorescência de transitórios de cálcio foram realizadas utilizando-se o indicador de comprimento de onda dupla Fura-2 AM ou o único corante de comprimento de onda Fluo-3 AM30,31,32. Embora esses corantes tenham oferecido uma nova visão na época, eles sofrem de várias limitações, como compartimentação não específica dentro das células, perda de corante ativo ou passivo de células rotuladas, fotobleaching e toxicidade se imagens por longos períodos de tempo33. Na última década, indicadores de cálcio geneticamente codificados tornaram-se os cavalos de trabalho para a imagem de várias formas de atividade neuronal. Esses indicadores combinam uma proteína fluorescente modificada com uma proteína querador de cálcio que muda rapidamente a intensidade da fluorescência após a ligação de íons ca2+34. A aplicação desses novos indicadores é vasta, permitindo uma visualização muito mais fácil de transintes intracelulares de cálcio tanto em configurações in vitro quanto in vivo. Uma família desses repórteres geneticamente codificados, conhecido como GCaMP, agora são amplamente utilizados. Esses indicadores contêm domínio de calmodulina terminal C, seguidos de proteína fluorescente verde (GFP), e são limitados por uma região de ligação de autodulina terminal N35,36. A ligação de cálcio ao domínio calmodulin desencadeia uma interação com a região de ligação de calmodulin, resultando em uma mudança conformacional na estrutura geral da proteína e um aumento substancial na fluorescência da moiety35,36 gfp. Ao longo dos anos, essa família de repórteres passou por várias evoluções para permitir leituras distintas para transitórios de cálcio específicos com cinética específica (lenta, média e rápida), cada uma com propriedades ligeiramente diferentes37,38. Aqui, foi destacado o uso do repórter GcaMP6, que já foi demonstrado anteriormente para detectar potenciais de ação única e transitórios de cálcio dendráticos em neurônios tanto in vivo quanto in vitro37.

Transitórios de cálcio na região pré-sináptica desencadeiam eventos de fusão de vesícula sináptica, causando liberação de neurotransmissores na sinapse e início de eventos de sinalização na célula postsinásptica28,39. As vesículas sinápticas são rapidamente liberadas e recicladas, já que a célula homeostaticamente mantém uma área de superfície de membrana celular estável e uma piscina prontamente liberada de vesículas ligadas à membrana 40. O corante de estirida usado aqui tem afinidade com membranas lipídicas e altera especificamente suas propriedades de emissão com base no ordenamento do ambiente lipídemo circundante41,42. Assim, é uma ferramenta ideal para rotular vesículas sinápticas de reciclagem e posterior rastreamento dessas vesículas, pois elas são posteriormente liberadas após estimulação neuronal41,42. O protocolo que foi gerado e otimizado é uma adaptação dos conceitos descritos inicialmente por Gaffield e colegas, o que nos permite visualizar puncta styryl com tinta styryl ao longo do tempo continuamente41.

Aqui, são descritas duas metodologias relacionadas baseadas em fluorescência, relatando de forma confiável eventos celulares específicos envolvidos na transmissão sináptica. Protocolos foram definidos para sondar a dinâmica do influxo de cálcio terminal pré-sináptico mediado pela despolarização e excitose de vesícula sináptica em neurônios cultivados. Aqui, métodos e resultados representativos estão focados no uso de neurônios cortical ou motor primários como o sistema de modelo in vitro, pois há estudos publicados utilizando esses tipos de células43,44. No entanto, esses métodos também são aplicáveis a neurônios humanos diferenciados como i3 cortical45, pois também tivemos sucesso com ambos os protocolos em experimentação atualmente em curso em nosso laboratório. O protocolo geral é delineado em um formato linear stepwise, mostrado na Figura 1. Resumindo, para estudar a dinâmica do cálcio em neurites, os neurônios maduros são transfectados com DNA plasmídeo para expressar o repórter fluorescente GCaMP6m sob um promotor de Cytomegalovirus (CMV)37,46. As células transfeinadas têm um baixo nível de fluorescência verde basal, o que aumenta na presença de cálcio. Regiões de interesse são especificadas para monitorar as mudanças de fluorescência ao longo de nossa manipulação. Isso permite que flutuações altamente espacial e temporalmente localizadas no cálcio sejam medidas37,46. Para avaliar a fusão e liberação de vesículas sinápticas, os neurônios maduros são carregados com corante estilístico incorporado em membranas vesículas sinápticas à medida que são reciclados, reformados e recarregados com neurotransmissores em células pré-sinápticas41,42,43,47,48. Os corantes atuais utilizados para este fim rotulam vesículas sinápticas ao longo de neurites e são usados como proxy para essas regiões em experimentos de imagem ao vivo, como foi mostrado pela co-coloração de corante e sinaptomin por Kraszewski e colegas49. Aqui estão incluídas imagens representativas de manchas semelhantes que também foram realizadas (Figura 2A). Pesquisadores anteriores usaram extensivamente tais corantes para relatar a dinâmica da vesícula sináptica na junção neuromuscular e neurônios hipocampais48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Selecionando regiões pontuadas de vesículas carregadas de corante e monitorando a diminuição da intensidade da fluorescência após a liberação da vesícula, a capacidade de transmissão sináptica funcional e a dinâmica temporal de liberação podem ser estudadas após a estimulação43. Para ambos os métodos, um meio contendo uma alta concentração de cloreto de potássio é empregado para despolarizar células para imitar a atividade neuronal. Os parâmetros de imagem são especificados para capturar intervalos sub-segundos que abrangem uma normalização da linha de base seguida pelo nosso período de captura de estimulação. As medidas de fluorescência em cada ponto de tempo são determinadas, normalizadas ao fundo e quantificadas ao longo do período experimental. O aumento da fluorescência GCaMP6m mediada por influxo de cálcio ou o aumento efetivo da excitose styísica styryl de isca de isca podem ser detectados através desta estratégia. Configuração metodológica detalhada e parâmetros para esses dois protocolos e uma discussão sobre suas vantagens e limitações são descritos abaixo.

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Figura 1: Renderização visual do processo geral de protocolo geral. (1) Isolados e cultura neurônios roedores primários in vitro ao ponto de tempo de maturação escolhido. (2) Introduzir o DNA GCaMP ou o corante de estilílico como repórteres de atividade sináptica. (3) Configuração de paradigma de imagem usando microscópio confocal equipado de imagem ao vivo e software associado. Inicie o período de gravação da linha de base. (4) Enquanto as células ainda estão em captura de imagem ao vivo, estimule os neurônios através da perfusão de banho KCl alto. (5) Avalie as medidas de intensidade de fluorescência ao longo do tempo para medir transitórios de cálcio ou fusão de vesícula sináptica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Todos os procedimentos animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Jefferson.

1. Cultura primária de neurônios a partir de córtex de rato embrionário

NOTA: Os neurônios corticais primários são isolados dos embriões de ratos E17,5 como descrito anteriormente57,58. Nenhum viés de tensão parece existir com o sucesso deste protocolo de cultivo. Este método é descrito brevemente abaixo. Os artigos anteriores indicados devem ser referenciados para detalhes completos.

  1. Eutanize as fêmeas grávidas por inalação de CO2 seguida de confirmação secundária por luxação cervical.
  2. Colher embriões e isolar cérebros em solução de sal balanceada de 20 mM hepes tampão de 20 mM da Hank (HBSS). Da casca do córtex exterior, separe e depois descarte estriado e hipocampi. Coleciona cortices.
  3. Use fórceps finos para remover meninges de cortices. Para isso, mantenha o córtex no lugar com um par de fórceps fechados usando pressão suave.
    NOTA: Com o segundo par de fórceps na segunda mão, belisque meninges. Descasque meninges usando movimento de rolamento com par apertado. Reposicione-se com os fórceps fechados e repita conforme necessário até que as meninges sejam totalmente removidas.
  4. Incubar cortices com 10 μg/mL de papain no HBSS por 4 min a 37 °C.
  5. Lave três vezes no HBSS e, em seguida, triturar suavemente 5-10 vezes com uma pipeta Pasteur de vidro polido de fogo para obter uma suspensão celular homogênea.
    NOTA: Evite bolhas; manter a pipeta dentro da suspensão da célula.
  6. Neurônios de placa em 100 μg/mL poli-D-lysine revestidos 35 mm de vidro-inferior a uma densidade de 75.000 células/prato em meio neurobásio com suplemento B27 (2%) e penicilina-estreptomicina.

2. Cultura primária de neurônios motores da medula espinhal de rato embrionário

NOTA: Os neurônios motores primários são preparados a partir de embriões de ratos E13.5 como descrito anteriormente, com poucas modificações59,60. Nenhum viés de tensão parece existir com o sucesso deste protocolo de cultivo. Este método é descrito brevemente abaixo. Os artigos anteriores indicados devem ser referenciados para detalhes completos.

  1. Eutanize ratos fêmeas grávidas como no passo 1.1.
  2. Disseque 10-20 medulas espinhais de embriões e quebre pequenos fragmentos mecanicamente usando dois pares de fórceps para beliscar e puxar, respectivamente.
  3. Incubar em 0,025% trypsin por 8 min, seguido pela adição de DNase a 1 mg/mL.
  4. Centrifugar através de uma almofada BSA de 4% a 470 x g por 5 min a 4 °C sem quebra.
  5. Células de pelotização centrífuga por 55 min a 830 x g a 4 °C sem freio através de uma almofada de gradiente de densidade de 10,4% (v/v) (ver Tabela de Materiais). Leve para a frente a banda de neurônio motor na interface visual.
    NOTA: Para garantir a captura de todas as células, use mídia livre de fenol para a etapa de gradiente de densidade e mídia contendo fenol para todas as outras etapas. A interface da mídia de gradiente de densidade e dissociação é facilmente identificável com base na diferença de cor.
  6. Gire bandas coletadas através de outra almofada BSA de 4% a 470 x g por 5 min a 4 °C sem quebra.
  7. Resuspend neurônios motores purificados em meio neurobásal completo com suplemento B27 (2%), glutamina (0,25%), 2-mercaptoetanol (0,1%), soro de cavalo (2%) e penicilina-estreptomicina.
  8. Neurônios de placa em 100 μg/mL de poli-lisina e 3 μg/mL de tampas revestidas de laminina a uma densidade de 50.000 células /35 mm de prato de fundo de vidro.

3. Transfecções neuronais

NOTA: Este passo é realizado para neurônios que serão submetidos a imagens de cálcio GCaMP e/ou neurônios nos quais um plasmídeo de DNA exógeno ou RNA de interesse é introduzido antes da avaliação sináptica. Em contraste, o corante de estilingues é carregado pouco antes da sessão de imagem e é abordado na seção 6. O resumo abaixo é o protocolo de transfecção usado para neurônios de roedores primários nos exemplos apresentados, mas pode ser facilmente adaptado e otimizado às necessidades do usuário.

  1. Transfeções para neurônios corticais primários cultivados ocorrem no dia 12 in vitro (DIV 12), enquanto os neurônios motores são transfectados no dia 7 in vitro (DIV 7).
    NOTA: Todas as seguintes etapas ocorrem dentro de um gabinete de biossegurança asséptica.
  2. Transfeito 500 ng de GCaMP6m usando reagente de transfecção a uma razão de 1:2 em volume. Para as co-transfecções, adicione um total de 1,25 μg de DNA/prato total, mantendo este DNA para a razão reagente.
    NOTA: Nos exemplos experimentais mostrados, 750 ng de plasmídeo de interesse relacionado à ALS/FTD foram transfectados para expressar dipeptídeos ligados ao C9orf72-ALS, proteína fus mutante, etc. Certifique-se de que a tag fluorescente do plasmídeo co-transfectado não entrará em conflito com o canal FITC de imagens GCaMP. Da mesma forma, se fizer imagens de corante de estirida, certifique-se de que o plasmídeo co-transfectado não entrará em conflito com o canal TRITC de imagem. O uso de sinápcisina-GCaMP3 é igualmente eficaz neste protocolo. Portanto, transfem a mesma quantidade deste plasmídeo e siga todos os passos como de costume na seção 7.
  3. Incubar o complexo de reagente de transfecção de DNA à temperatura ambiente por 10 minutos.
  4. Adicione suavemente o complexo incubado aos neurônios em gota com o redemoinho. Volte o prato para a incubadora de CO2 a 37 °C por 45-60 min.
  5. Remova toda a mídia cultural contendo o complexo de reagentes de transfecção de DNA e substitua-o por um 50-50 por volume de preparação de mídia neuronal pré-condicionada e fresca. Em seguida, coloque as células de volta na incubadora de CO2 por 48 h até a imagem.

4. Preparação de soluções tampão e solução de estoque de corantes de styryl

  1. Faça soluções aCSF baixas e altas frescas antes de fotografar usando os ingredientes listados na Tabela 1. Filtre ambas as soluções de buffer antes de usar.
    NOTA: O dihidrato caCl2 pode formar Ca(OH)2 no armazenamento. Para máxima eficácia, use sempre um recipiente recém-aberto. Se isso não for possível, para remover o Ca(OH)2 da superfície externa e garantir a solubilidade máxima, as soluções podem ser carbonadas com CO2 gasoso por 5 minutos antes da adição de CaCl2 . Se esse passo for dado, ajuste o pH da solução resultante para manter um valor de pH de 7,4, pois a carbonação excessiva resultará na formação de Ca(HCO3)2 .
Baixo amortecedor ACSF da KCL (pH 7,40 a 7,45)
ReagenteConcentração
HEPES10 mM
NaCl140 mM
Kcl5 mM
Glicose10 mM
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM
Tampão ACSF de KCL alto (pH 7,40 a 7,45)
ReagenteConcentração
HEPES10 mM
NaCl95 mM
Kcl50 mM
Glicose10 mM
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM

Tabela 1: Composição de tampões artificiais de fluido cefalorraquidiano (aCSF). Esta tabela inclui os ingredientes para preparar tampões de fluido cerebrospinal artificiais kcl baixos e altos usados durante a imagem e estimulando neurônios. Consulte a seção 4 para obter instruções de preparação.

  1. Prepare a solução de estoque de corante de estirida, tomando um frasco de 100 μg de corante e reconstituindo-o a uma concentração de estoque de 10 mM com água destilada ou meio neurobásal.

5. Configuração do sistema de microscópio e perfusão

NOTA: Para placas de Petri com fundo de vidro de imagem, um microscópio de fluorescência confocal invertido é preferido devido à flexibilidade da perfusão e ao uso de um objetivo de imersão de óleo de alta abertura numérica. Consulte a Tabela de Materiais para o microscópio confocal, câmera e objetivos utilizados para imagens de exemplos detalhados na seção Resultados Representativos .

  1. Realize todos os experimentos a 37 °C com níveis constantes de CO2 de 5% usando uma montagem de estágio acoplado ao sistema de incubadora.
  2. Controle a aquisição de imagens usando software confocal. Otimize as configurações de aquisição no início da sessão de imagem para escolher o poder de excitação e obter ganhos para garantir a visualização ideal de sinais sem fotobleaching.
    1. Mantenha a energia de excitação, o tempo de exposição, o ganho do detector e a taxa de quadros constantes em todas as amostras. Realize imagens de lapso de tempo usando uma proporção de 512 x 512 e taxa de quadros de 2 imagens/s para minimizar o branqueamento de corantes.
      NOTA: Embora o puncta deva ser claramente visível, a intensidade do laser deve ser definida ao mínimo possível para evitar branqueamento e fototoxicidade. Defina a abertura confocal para o ajuste mais estreito para obter a resolução ideal de puncta fluorescente dentro de neurites. O tempo de exposição é definido para 200 ms ou menos, consistente entre as amostras. A velocidade máxima de imagem da câmera utilizada foi de 2 imagens/s. Se usar uma câmera mais rápida, mais imagens/s podem ser tiradas. As configurações de imagem temporal devem ser escolhidas, se possível.
  3. Selecione as seguintes combinações de filtro de fluorescência/dicroica/emissão para imagens usando software confocal: Gcamp6m/Gcamp3 com FITC e corante de estria com TRITC, respectivamente.
  4. Use o recurso de foco perfeito do software de aquisição de imagens confocal durante a imagem de lapso de tempo para evitar o z-drift.
    NOTA: Devido à velocidade rápida da imagem, um único plano é imageado. Garantir a falta de z-drift durante o experimento é muito importante.
  5. Selecione a guia Tempo no painel de aquisição de imagens para definir os períodos e intervalos de gravação.
    1. Definir fase #1 para intervalo 500 ms, Duração 3 - 5 min.
    2. Definir fase #2 para intervalo 500 ms, Duração 5 min.
      NOTA: A fase #1 corresponde à gravação da linha de base, fase #2 ao período de estimulação, respectivamente.
  6. Monte o aparelho de perfusão de gravidade para aCSF usando um sistema de controle de válvula e um coletor de canal.
    1. Carregue kcl alto (ver Tabela 1) em uma seringa de 50 mL na parte superior do aparelho, com tubos passando pelo sistema. Defina a vazão para 1 mL/min.
  7. Carregue uma antena de vidro de 35 mm contendo neurônios no estágio de imagem confocal, com a extremidade da tubulação de perfusão colocada na borda do prato. Escolha o campo para imagens.

6. Imagem de corante de styryl da liberação de vesícula sináptica

  1. Incubar células em KCl aCSF baixo (ver Tabela 1) por 10 min a 37 °C, 48 h pós-transfecção.
  2. Carregue neurônios cortical primários ou motores em placas de Petri com corante de estirico.
    1. Remova o ACSF kcl baixo por aspiração.
    2. Use uma pipeta para carregar neurônios no escuro com 10 μM de corante de estirpe em aCSF contendo 50 mM KCl por 5 min.
    3. Remova a solução de carregamento e os neurônios do banho em baixo KCl aCSF por 10 minutos para eliminar o carregamento de corante não específico.
  3. Coloque o prato de fundo de vidro de 35 mm sobre o estágio de imagem e, em seguida, observe sob um objetivo de ar de 20x ou 40x objetivo de imersão de óleo de um microscópio confocal invertido.
    NOTA: Use fluorescência GFP para localizar células transfeminadas no caso de células co-transfeminadas com um plasmídeo marcado por GFP.
  4. Excite o corante de estiris usando um laser de 546 nm, colete emissões usando um filtro de bandpass de 630-730 nm (TRITC).
  5. Selecione o campo de imagem e engaje o foco perfeito. Em seguida, pegue uma única imagem parada com canais de marcadores de campo brilhante, TRITC e fluorescência para marcar limites neuronais.
  6. Inicie o Run Now no software de aquisição. Realize a gravação basal por 3-5 min para excluir variações na intensidade do corante, se houver (Fase #1).
    NOTA: É essencial garantir que qualquer diminuição na intensidade do corante seja devido à liberação de vesícula sináptica e não à difusão passiva de corante ou fotobleaching. Este período pré-estimulação de 3-5 min deve resultar em um nível de intensidade de corante estável e mantido. Os 30 s finais desta gravação serão usados para determinar um valor médio de fluorescência da linha de base para cada ROI. Antes de avaliar as condições experimentais, uma condição adicional de não estimulação de aproximadamente 10 minutos de gravação contínua usando as configurações de aquisição pretendidas também pode ser realizada para garantir valores de fluorescência constantes usando as configurações de laser por um período prolongado.
  7. Na mudança para a fase #2, acione no botão para o sistema de perfusão. Em seguida, perduse constantemente 50 mM KCL aos neurônios para facilitar o descarregamento de corante (Fase #2).
    1. Realize gravações para 300 s após a adição de KCl. Depois disso, a aquisição pára; acione o interruptor Off para o sistema de perfusão.
  8. Salve o experimento e analise os dados usando software confocal, conforme descrito na seção 8 abaixo.
    NOTA: O experimento pode ser interrompido neste momento, e a análise pode ser realizada posteriormente. No caso em que as células não requerem transfecção para a expressão de proteínas de interesse, este protocolo pode ser realizado a qualquer ponto de tempo in vitro ao procurar examinar a funcionalidade do descarregamento sináptico. Após um teste de células de controle para garantir o descarregamento sináptico adequado, o experimentador deve ser cego às condições genéticas ou farmacológicas de cada prato testado para minimizar o viés.

7. Imagens de fluorescência de transintes de cálcio Gcamp6m

  1. Transfect primary roedor cortical neurônios cultivados em pratos de fundo de vidro de 35 mm com 500 ng de Gcamp6m como indicado na seção 3.
    NOTA: Se desejar, os neurônios co-transfectos com um plasmid de interesse contendo uma etiqueta fluorescente na faixa vermelha ou vermelha.
  2. Incubar neurônios com baixo KCl aCSF por 15 min 48 h após a transfecção e, em seguida, montar o prato na plataforma de imagem.
  3. Visualize a fluorescência GCaMP6m usando um filtro FITC (488 nm) e um objetivo de 20x ou 40x.
  4. Selecione o campo de imagem e engaje o foco perfeito. Em seguida, pegue uma única imagem parada com canais marcadores de campo brilhante, FITC e fluorescência para marcar limites neuronais.
  5. Inicie o Run Now no software de aquisição. Realize a gravação da linha de base por 5 minutos e, em seguida, perfuse com aCSF contendo 50 mM KCL da mesma maneira descrita na seção 6 para experimentos de corante de estítil.
    NOTA: O objetivo desta imagem é medir os transitórios de cálcio evocados. Caso um neurônio tenha atividade de disparo basal e fluxos de cálcio durante o período de pré-estimulação, ele não é usado na análise de dados. Em vez disso, apenas células com fluorescência de fundo estável são usadas. Os períodos pós-estimulação também podem ser estendidos para 60 minutos para transitórios de cálcio, com ou sem perfusão adicional contínua de LCA.
  6. Salve o experimento e analise os dados usando software confocal, conforme descrito na seção 8 abaixo. O experimento pode ser interrompido neste momento, e a análise pode ser realizada mais tarde.
    NOTA: Se as células não necessitarem de transfecção para expressão de proteínas de interesse, este protocolo pode ser realizado a qualquer ponto de tempo in vitro na tentativa de examinar os transitórios de cálcio. Após um teste de células de controle para garantir a medição dos transitórios de cálcio, o experimentador deve ser cego às condições genéticas ou farmacológicas de cada prato testado para minimizar o viés.

8. Análise de imagem

  1. Abra imagens de lapso de tempo com software confocal.
  2. Alinhe imagens em série de lapso de tempo pela série de comando : Imagem | | de processamento Alinhe o documento atual. Selecione Alinhar ao Primeiro Quadro.
  3. Selecione regiões de interesse (ROIs) ao longo de neurites usando a ferramenta de seleção de ROI, um ícone em forma de feijão à direita do quadro de imagem (Figura 3B). Além disso, marque um ROI representando a intensidade de fluorescência de fundo.
    NOTA: Os ROIs são selecionados escolhendo áreas de puncta distintamente separada ao longo das faixas neuronais indicadas pela imagem ainda de campo brilhante. Pelo menos cinco ROIs por neurônio são escolhidos para análise. O ROI de fundo é escolhido em uma região do campo de visão que não contém neurites.
  4. Meça fluorescência bruta ao longo do tempo para ROIs selecionados usando as seguintes séries de comando: Medir | Medição de tempo.
    1. Inicie a função Medida na porção superior do painel De medição de tempo . Uma representação gráfica de fluorescência bruta ao longo do tempo (Figura 3C) e dados quantitativos são gerados.
      NOTA: Cada ponto de dados representa a fluorescência bruta para esse ROI para o quadro associado a esse ponto de tempo medido específico.
  5. Exporte intensidades de fluorescência bruta para o software de planilha.
  6. Analise cada ROI de forma independente. Primeiro, normalizar os dados subtraindo a intensidade do ROI de fundo do ROI de intensidade de interesse em cada ponto de tempo.
    1. Pegue o valor de fluorescência bruta do ROI de fundo em cada ponto de tempo específico e subtraia isso do ROI de valor de intensidade bruta de juros naquele ponto de tempo.
      NOTA: Isso é feito durante todo o período de gravação, tanto em fases basais quanto de estimulação.
  7. Determine o ROI médio de intensidade de juros para os últimos 30 s da linha de base.
    1. Em média, os valores basais crus normalizados gerados na etapa 8,6 dos 30 s finais do período de gravação basal de 3-5 min.
      NOTA: Todo o período de gravação basal poderia ser usado para gerar esse valor. No entanto, à medida que esse valor se estabiliza e é mantido, os 60 pontos dos 30 finais são de tamanho amostral suficiente para representar o todo.
  8. Compare este valor de linha de base com o valor de intensidade normalizado em cada ponto de tempo, gerando uma mudança no valor da fluorescência (ΔF).
    1. Pegue o valor da etapa 8.7 e subtraia o valor fluorescente médio da linha de base. Faça isso e etapas subsequentes durante todo o período de gravação, tanto em fases basais quanto de estimulação.
  9. Calcule esta alteração em relação ao valor da fluorescência da linha de base, gerando uma mudança na fluorescência/fluorescência da linha de base (ΔF/F). Para isso, pegue o valor da etapa 8.8 e divida-o pelo valor fluorescente médio da linha de base.
  10. Finalmente, defina o valor do ponto de partida para 1 para que os aumentos ou reduções possam ser facilmente visualizados graficamente ao longo do tempo.
    1. Pegue o valor gerado na etapa 8.9 e adicione 1.
      NOTA: Quando isso for feito corretamente, os 30 s dos valores do período de base devem pairar perto do valor de 1. Nas células que liberam efetivamente o conteúdo sináptico, esse valor deve variar de 1 para 0 após o início da estimulação. Um exemplo de passos 6-9 é apresentado na Figura 3E.

9. Análise de dados

NOTA: O experimentador pode não ser cego para condições experimentais para reunir dados para análise adequadamente. Use um tamanho amostral de pelo menos 10 neurônios por condição de cada um dos três experimentos independentes. Considere apenas neurônios para inclusão se pelo menos cinco regiões do ROI puderem ser designadas. Esse nível de replicação experimental foi suficiente em estudos publicados para demonstrar uma profunda perda de descarga sináptica em células contendo poli-GA relacionadas à ALS versus controles GFP (ver Resultados Representativos). No entanto, se um fenótipo mais sutil for observado, o número de réplicas biológicas e/ou técnicas pode exigir otimização pelo usuário.

  1. Utilizando todos os valores ΔF/F calculados ao longo do tempo a partir de ROIs de uma determinada condição experimental, determine um valor médio de ΔF/F para cada ponto de tempo, juntamente com um SEM.
  2. Plotar dados usando um programa de software de gráficos e estatísticas em formato xy, onde x é o tempo decorrido, e y é o valor ΔF/F calculado na etapa 9.1. Apresentar todos os valores como média ± SEM.
  3. Para determinar a significância estatística, utilize o teste t do Aluno para comparar dois grupos e análise unidirecional de variância (ANOVA) seguido da análise pós-octo de Tukey para comparação de três ou mais grupos.

Resultados

Após a implementação bem-sucedida do protocolo acima, os resultados representativos são mostrados para um típico experimento de liberação de vesícula styryl. Os neurônios cortical primários do rato cultivado foram carregados com corante usando o método descrito na seção 6. A especificidade do carregamento de tingimento foi determinada pela co-rotulagem com sináptica de marcador de vesícula sináptica. A maioria dos punctas positivos de corante styryl são co-positivos para este marcador (

Discussão

Três passos comuns a ambos os métodos descritos são de importância crucial para o sucesso experimental e resultados quantificáveis. Primeiro, a preparação de um novo ACSF antes de cada rodada de experimentos é essencial, seguindo as instruções anexadas. Caso contrário, pode evitar a despolarização neuronal adequada. Uma amostra de neurônios de controle não tratados deve ser constantemente testada antes da estimulação de quaisquer grupos experimentais para garantir a despolarização celular adequada e fo...

Divulgações

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Gostaríamos de reconhecer os atuais e antigos membros do Jefferson Weinberg ALS Center para feedback crítico e sugestões para otimizar essas técnicas e suas análises. Este trabalho foi apoiado por financiamento do NIH (RF1-AG057882-01 e R21-NS0103118 para D.T), o NINDS (R56-NS092572 e R01-NS109150 a P.P), a Associação de Distrofia Muscular (D.T.), o Centro Robert Packard de Pesquisa da ALS (D.T.), a Fundação Família Strong 4 ALS e a Fundação Da Família Farber (B.K.J., K.K.K, e P.P).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
20x air objectiveNikonFor imaging
40x oil immersion objectiveNikonFor imaging
B27 supplementThermo Scientific17504044Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mLThermo Scientific13-689-8Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hoodBakerSterilGARD III SG403AAsceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-MercaptoethanolMillipore SigmaM3148For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9418For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrateMillipore Sigma223506Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubatorThermo Scientific13-998-123For culturing and maintenance of neurons
CentrifugeEppendorf5810RFor neuronal culture preparation
Confocal microscopeNikonEclipse Ti +A1R coreFor fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD cameraPhotometricsFor image acquisition
D-GlucoseMillipore SigmaG8270Component of aCSF solutions
DNaseMillipore SigmaD5025For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley ratsCharles river400SASSDFor preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cubeNikon77032509For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dyeInvitrogenT13320For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)CellVisD35-10-1.5-NFor growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipetteGrainger52NK56For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Millipore SigmaH6648For preparing neuronal cultures
HEPESMillipore SigmaH3375Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
horse serumMillipore SigmaH1138For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hoodNUAIRENU-301-630For preparing neuronal cultures
LamininThermo Scientific23017015For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 MediumThermo Scientific11415064For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol redThermo Scientific21083027For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM)Thermo Scientific25030149Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Scientific11668019For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
Magnesium chlorideMillipore Sigma208337Component of aCSF solutions
Microsoft ExcelMicrosoftSoftware for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PESThermo Scientific565-0020Filter unit for aCSF solution
Neurobasal mediumThermo Scientific21103049For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced ResearchNikonSoftware for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubesThermo Scientific339650For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubesThermo Scientific339652For preparing neuronal culture and buffer solutions
OptiprepMillipore SigmaD1556For preparing neuronal cultures
PapainMillipore SigmaP4762For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Scientific15140122To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion systemWarner InstrumentsSF-77BFor exchange of aCSF
Perfusion tubingCole-ParmerUX-30526-14Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmidAddgene40754For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromideMillipore SigmaP7886Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chlorideMillipore SigmaP3911Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonateMillipore SigmaS5761Component of aCSF solutions
Sodium ChlorideMillipore SigmaS9888Component of aCSF solutions
Stage Top IncubatorTokai HitFor incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cubeNikon77032809For imaging FM4-64
Trypsin InhibitorMillipore SigmaT6414For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Scientific25200056For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation tableNew PortVIP320X2430-135520Table/stand for microscope

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