JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Özet

Nöronal dejenerasyondan önce, amiyotrofik lateral skleroz (ALS) ve/veya frontotemporal lob demansı (FTLD) olan hastalarda motor ve kognitif defisitlerin nedeni, nöronlar ile motor nöronlar ve kas arasındaki iletişimin bozulmasıdır. Sinaptik iletimin altında yatan süreç, membran depolarizasyonuna bağımlı sinaptik vezikül füzyonunu ve nörotransmitterlerin sinapsa salınmasını içerir. Bu süreç, sinaptik veziküllerin bulunduğu presinaptik terminallere lokalize kalsiyum akışı yoluyla gerçekleşir. Burada protokol, kültürlü nöronlarda depolarizasyon aracılı sinaptik vezikül ekzositozu ve presinaptik terminal kalsiyum akışı dinamiklerini güvenilir bir şekilde bildiren floresan bazlı canlı görüntüleme metodolojilerini açıklamaktadır.

Sinaptik vezikül membranlarına dahil edilen bir stiril boya kullanılarak, sinaptik vezikül salınımı aydınlatılır. Öte yandan, kalsiyum girişini incelemek için, genetik olarak kodlanmış bir floresan muhabiri olan Gcamp6m kullanılır. Nöronal aktiviteyi taklit etmek için yüksek potasyum klorür aracılı depolarizasyon kullanıyoruz. Sinaptik vezikül ekzositozunu kesin olarak ölçmek için, normalize edilmiş stiril boya floresansının kaybını zamanın bir fonksiyonu olarak ölçüyoruz. Benzer stimülasyon koşulları altında, kalsiyum akışı durumunda, Gcamp6m floresan artar. Bu floresan değişiminin normalleştirilmesi ve miktarının belirlenmesi, stiril boya protokolüne benzer şekilde gerçekleştirilir. Bu yöntemler, floresan olarak etiketlenmiş mutant proteinlerin transfeksiyon bazlı aşırı ekspresyonu ile çoğaltılabilir. Bu protokoller, primer kemirgen kortikal ve motor nöronları kullanarak, FUS-ALS ve C9ORF72-ALS modellerinde sinaptik disfonksiyonu incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu protokoller, nöronal iletişimi geliştirebilecek bileşiklerin hızlı bir şekilde taranmasına kolayca izin verir. Bu nedenle, bu yöntemler sadece ALS çalışması için değil, nörodejeneratif ve gelişimsel sinirbilim araştırmalarının tüm alanları için değerlidir.

Giriş

Laboratuvarda amiyotrofik lateral sklerozun (ALS) modellenmesi, vakaların %80'inden fazlasının1 ezici bir şekilde sporadik doğası ve hastalığa bağlı olduğu bilinen çok sayıda genetik mutasyon nedeniyle2 benzersiz bir şekilde zorlaştırılmıştır. Buna rağmen, tüm ALS vakaları, doğrudan nöronal dejenerasyondan önce, presinaptik motor nöronlar ve postsinaptik kas hücreleri arasında işlevsiz bir iletişim olduğu birleştirici özelliği paylaşır3,4. Klinik olarak, hastalar kalan üst ve alt motor nöronların bağlantılarını kaybettikçe, hastalık boyunca nöronal hiper ve hipoeksitabilite özellikleri ile ortaya çıkarlar5,6,7,8,9, ALS araştırmacıları olarak anlamaya çalıştığımız bu sinapslardaki karmaşık altta yatan moleküler değişiklikleri yansıtırlar.

Çoklu transgenik modeller, nöromüsküler kavşağın bozulmasının ve düzensizliğinin, SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 ve TDP4317,18,19 dahil olmak üzere ALS-nedensel genetik mutasyonların ekspresyonuyla meydana geldiğini göstermiştir. sinaptik butonların, omurga yoğunluklarının ve sinaptik öncesi / sonrası organizasyonun değerlendirilmesi de dahil olmak üzere morfolojik değerlendirmeler yoluyla. Mekanik olarak, 1930'larda Cole, Hodgkin ve Huxley'nin dönüm noktası niteliğindeki makalelerinden bu yana, in vitro hücre kültüründe veya doku dilimi preparatlarında elektrofizyolojik tekniklerle sinaptik yanıtları değerlendirmek de mümkün olmuştur20. Bu stratejiler sayesinde, birçok ALS modeli sinaptik iletim açıklarını göstermiştir. Örneğin, TDP43'ün mutant bir varyantı, NSC-34 (omurilik x nöroblastom hibrid hücre hattı 34) motor nöron benzeri hücrelerde gelişmiş ateşleme sıklığına neden olur ve aksiyon potansiyeli eşiğini azaltır21. Aynı varyant aynı zamanda bir fare modelinde davranışsal motor eksikliklerin başlamasından önce nöromüsküler kavşakta (NMJ) işlevsiz sinaptik iletime neden olur22. Daha önce, mutant FUS ekspresyonunun, lokomotor kusurlardan önce FUS-ALS'nin drosophila modelinde NMJ'de sinaptik iletimin azalmasına neden olduğu gösterilmiştir11. C9orf72 genleşme taşıyıcılarından türetilen indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin kullanıldığı yeni bir rapor, kolayca devredilebilen sinaptik vezikül havuzunda bir azalma olduğunu ortaya koymuştur23. Toplamda, bu çalışmalar ve diğerleri, ALS'nin hastalıkla ilgili modellerinde sinaptik sinyallemenin altında yatan mekanizmaların daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasının önemini vurgulamaktadır. Bu, ALS'nin patobiyolojisini anlamada ve hastalar için potansiyel terapötik hedefler geliştirmede çok önemli olacaktır.

Akım ve gerilim sıkıştırma hücreleri yöntemleri, iletkenlik, dinlenme membranı potansiyeli ve bireysel sinapsların kantial içeriği gibi membran özelliklerinin belirlenmesinde paha biçilmez olmuştur20,24. Bununla birlikte, elektrofizyolojinin önemli sınırlamalarından biri, teknik olarak zor olması ve bir seferde yalnızca tek bir nörondan içgörü sağlamasıdır. Canlı hücre konfokal mikroskopisi, spesifik floresan problarla birleştiğinde, nöronların sinaptik iletimini mekansal zamansal bir şekilde araştırma fırsatı sunar25,26,27. Nöronal uyarılabilirliğin doğrudan bir ölçüsü olmasa da, bu floresan yaklaşımı, sinaptik fonksiyonun iki moleküler korelasyonunun göreceli bir ölçümünü sağlayabilir: sinaptik vezikül salınımı ve sinaptik terminallerde kalsiyum geçicileri.

Bir aksiyon potansiyeli nöronların presinaptik terminal bölgesine ulaştığında, kalsiyum geçicileri tetiklenir ve bir elektrik sinyalinden nörotransmitter salınım sürecine geçişi kolaylaştırır28. Bu alanlara lokalize olan voltaj kapılı kalsiyum kanalları, nörotransmitter salınımının kinetiğini modüle etmek için kalsiyum sinyalini sıkı bir şekilde düzenler29. Kalsiyum geçicilerinin ilk bildirilen floresan bazlı kayıtları, çift dalga boyu göstergesi Fura-2 veya tek dalga boyu boyası Fluo-3 AM30,31,32 kullanılarak gerçekleştirildi. Bu boyalar o zamanlar harika yeni bilgiler sunarken, hücreler içinde spesifik olmayan bölümlere ayırma, etiketli hücrelerden aktif veya pasif boya kaybı, fotobeyazlatma ve uzun süre boyunca görüntülendiğinde toksisite gibi çeşitli sınırlamalardan muzdariptirler33. Son on yılda, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, çeşitli nöronal aktivite formlarını görüntülemek için iş gücü haline gelmiştir. Bu göstergeler, modifiye edilmiş bir floresan proteinini, Ca2+ iyonlarının bağlanmasından sonra floresan yoğunluğunu hızla değiştiren bir kalsiyum şelatör proteini ile birleştirir34. Bu yeni göstergelerin uygulanması çok geniştir ve hücre içi kalsiyum geçicilerinin hem in vitro hem de in vivo ortamlarda çok daha kolay görselleştirilmesini sağlar. GCaMP olarak bilinen bu genetik olarak kodlanmış muhabirlerin bir ailesi şimdi yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu göstergeler bir C-terminal kalmodülin alanı, ardından yeşil floresan proteini (GFP) içerir ve bir N-terminal kalmodülin bağlama bölgesi ile sınırlıdır35,36. Kalmodülin alanına kalsiyum bağlanması, kalmodulin bağlanma bölgesi ile bir etkileşimi tetikler, bu da genel protein yapısında konformasyonel bir değişikliğe ve GFP moiety35,36'nın floresansında önemli bir artışa neden olur. Yıllar geçtikçe, bu muhabir ailesi, her biri biraz farklı özelliklere sahip olan spesifik kinetiklere (yavaş, orta ve hızlı) sahip belirli kalsiyum geçicileri için farklı okumalar sağlamak için çeşitli evrimler geçirmiştir37,38. Burada, daha önce nöronlarda hem in vivo hem de in vitro37'de tek aksiyon potansiyellerini ve dendritik kalsiyum geçicilerini tespit ettiği gösterilen muhabir GcaMP6'nın kullanımı vurgulanmıştır.

Presinaptik bölgedeki kalsiyum geçicileri sinaptik vezikül füzyon olaylarını tetikleyerek sinapsa nörotransmitter salınımına ve postsinaptik hücrede sinyal olaylarının başlamasına neden olur28,39. Sinaptik veziküller hem hızlı bir şekilde salınır hem de geri dönüştürülür, çünkü hücre homeostatik olarak stabil bir hücre zarı yüzey alanını ve füzyon yeteneğine sahip membrana bağlı veziküllerin kolayca kirlenebilir havuzunu korur40. Burada kullanılan stiril boya, lipit membranlarına karşı bir afiniteye sahiptir ve özellikle çevredeki lipit ortamının sırasına bağlı olarak emisyon özelliklerini değiştirir41,42. Bu nedenle, geri dönüşüm sinaptik veziküllerinin etiketlenmesi ve daha sonra nöronal stimülasyonun ardından serbest bırakıldıkları için bu veziküllerin izlenmesi için ideal bir araçtır41,42. Oluşturulan ve optimize edilen protokol, başlangıçta Gaffield ve meslektaşları tarafından açıklanan kavramların bir uyarlamasıdır ve bu da zaman içinde sürekli olarak stiril boya etiketli sinaptik vezikül punktasını görselleştirmemizi sağlar41.

Burada, sinaptik iletimde yer alan spesifik hücresel olayları güvenilir bir şekilde bildiren iki ilgili floresan tabanlı metodoloji tanımlanmıştır. Kültürlü nöronlarda depolarizasyon aracılı presinaptik terminal kalsiyum inakımı ve sinaptik vezikül ekzositozunun dinamiklerini araştırmak için protokoller tanımlanmıştır. Burada, yöntemler ve temsili sonuçlar, primer kemirgen kortikal veya motor nöronların in vitro model sistemi olarak kullanılmasına odaklanmıştır, çünkü bu hücre tiplerini kullanan yayınlanmış çalışmalar vardır43,44. Bununla birlikte, bu yöntemler farklılaşmış insan i3 kortikal benzeri nöronlar için de geçerlidir45, çünkü laboratuvarımızda halen devam eden deneylerde her iki protokolle de başarı elde ettik. Genel protokol, Şekil 1'de gösterilen kademeli doğrusal bir biçimde özetlenmiştir. Kısacası, nöritlerde kalsiyum dinamiklerini incelemek için, olgun nöronlar, floresan muhabir GCaMP6m'yi bir Sitomegalovirüs (CMV) promotörü37,46 altında eksprese etmek için plazmid DNA'sı ile transfekte edilir. Transfekte hücreler, kalsiyum varlığında artan düşük bir bazal yeşil floresan seviyesine sahiptir. İlgilenilen bölgeler, manipülasyonumuz boyunca floresan değişikliklerini izlemek için belirtilmiştir. Bu, kalsiyumdaki yüksek uzamsal ve geçici olarak lokalize dalgalanmaların ölçülmesini sağlar37,46. Sinaptik vezikül füzyonunu ve salınımını değerlendirmek için, olgun nöronlar, presinaptik hücrelerdeki nörotransmiterlerle geri dönüştürüldükleri, reforme edildikleri ve yeniden yüklendikleri için sinaptik vezikül zarlarına dahil edilen stiril boya ile yüklenir41,42,43,47,48. Bu amaçla kullanılan mevcut boyalar, nöritler boyunca sinaptik vezikülleri etiketlemektedir ve Kraszewski ve meslektaşları tarafından stiril boya ve sinaptotagminin birlikte boyanmasıyla gösterildiği gibi, canlı görüntüleme deneylerinde bu bölgeler için bir vekil olarak kullanılmaktadır49. Burada, benzer boyama işleminin de gerçekleştirilmiş temsili görüntüleri yer almaktadır (Şekil 2A). Önceki araştırmacılar, nöromüsküler kavşaktaki sinaptik vezikül dinamiklerini ve hipokampal nöronları48,49,50,51,52,53,54,55,56'yı bildirmek için bu tür boyaları yaygın olarak kullanmışlardır. . Boya yüklü veziküllerin noktalama bölgelerini seçerek ve vezikül salınımını takiben floresan yoğunluğundaki düşüşleri izleyerek, fonksiyonel sinaptik iletim kapasitesi ve salınımın zamansal dinamikleri stimülasyonu takiben incelenebilir43. Her iki yöntem için, nöronal aktiviteyi taklit etmek için hücreleri depolarize etmek için yüksek konsantrasyonda potasyum klorür içeren bir ortam kullanılır. Görüntüleme parametreleri, bir temel normalizasyonu ve ardından stimülasyon yakalama süremizi kapsayan saniyenin altındaki aralıkları yakalamak için belirtilir. Her zaman noktasındaki floresan ölçümleri belirlenir, arka plana normalleştirilir ve deneysel zaman periyodu boyunca nicelleştirilir. Kalsiyum akışı aracılı GCaMP6m floresan artışı veya etkili sinaptik vezikül ekzositozu stiril boya salınımlı floresan azalması bu strateji ile tespit edilebilir. Bu iki protokol için ayrıntılı metodolojik kurulum ve parametreler ile avantajları ve sınırlamaları hakkında bir tartışma aşağıda açıklanmıştır.

figure-introduction-12317
Şekil 1: Genel genel protokol sürecinin görsel olarak işlenmesi. (1) Birincil kemirgen nöronlarını in vitro olarak seçilen olgunlaşma zaman noktasına izole edin ve kültürleyin. (2) GCaMP DNA veya stiril boyasını sinaptik aktivitenin muhabirleri olarak tanıtın. (3) Canlı görüntüleme donanımlı konfokal mikroskop ve ilgili yazılımları kullanarak görüntüleme paradigmasını kurmak. Temel kayıt dönemine başlayın. (4) Hücreler hala canlı görüntü yakalama sürecindeyken, yüksek KCl banyo perfüzyonu yoluyla nöronları uyarın. (5) Kalsiyum geçicilerini veya sinaptik vezikül füzyonunu ölçmek için zaman içindeki floresan yoğunluğu ölçümlerini değerlendirin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm hayvan prosedürleri, Jefferson Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Embriyonik sıçan korteksinden nöronların birincil kültürü

NOT: Primer kortikal nöronlar, daha önce tarif edildiği gibi E17.5 sıçan embriyolarından izole edilmiştir57,58. Bu kültürleme protokolünün başarısıyla hiçbir gerinim önyargısı yok gibi görünmektedir. Bu yöntem aşağıda kısaca açıklanmıştır. Tüm detaylar için belirtilen önceki makalelere atıfta bulunulmalıdır.

  1. Gebe dişi sıçanları CO2 inhalasyonu ile ötenazileştirin, ardından servikal çıkık ile ikincil doğrulama ile takip edin.
  2. Embriyoları toplayın ve beyinleri buz gibi soğuk 20 mM HEPES tamponlu Hank'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) izole edin. Dış korteks kabuğundan, striatum ve hipokampiyi ayırın ve atın. Kortikleri toplayın.
  3. Meninksleri kortekslerden çıkarmak için ince forseps kullanın. Bunu yapmak için, korteksi hafif basınç kullanarak bir çift kapalı forseps ile yerinde tutun.
    NOT: İkinci eldeki ikinci forseps çifti ile meninksleri sıkıştırın. Sıkışmış çift ile yuvarlanma hareketini kullanarak meninksleri soyun. Kapalı forseps ile tekrar pozisyonlayın ve meninksler tamamen çıkarılana kadar gerektiği gibi tekrarlayın.
  4. HBSS'de 10 μg / mL papain içeren korteksleri 37 ° C'de 4 dakika boyunca inkübe edin.
  5. HBSS'de üç kez yıkayın ve homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için ateşle parlatılmış cam Pasteur pipetle 5-10 kez hafifçe tritüre edin.
    NOT: Kabarcıklardan kaçının; pipeti hücre süspansiyonu içinde tutun.
  6. 100 μg / mL poli-D-lizin üzerindeki plaka nöronları, B27 takviyesi (% 2) ve penisilin-streptomisin ile nörobazal ortamda 75.000 hücre / çanak yoğunluğunda 35 mm cam tabanlı tabakları kapladı.

2. Embriyonik sıçan omuriliğinden motor nöronların birincil kültürü

NOT: Primer motor nöronlar, daha önce tarif edildiği gibi E13.5 sıçan embriyolarından birkaç değişiklikle hazırlanır59,60. Bu kültürleme protokolünün başarısıyla hiçbir gerinim önyargısı yok gibi görünmektedir. Bu yöntem aşağıda kısaca açıklanmıştır. Tüm ayrıntılar için belirtilen önceki makalelere atıfta bulunulmalıdır.

  1. Hamile dişi fareleri adım 1.1'de olduğu gibi ötenazileştirin.
  2. Embriyolardan 10-20 omuriliği disseke edin ve sırasıyla sıkıştırmak ve çekmek için iki çift forseps kullanarak mekanik olarak küçük parçalara bölün.
  3. 8 dakika boyunca% 0.025 tripsin içinde inkübe edin, ardından 1 mg / mL'de DNaz ilavesi yapın.
  4. 470 x g'de %4'lük bir BSA yastığı ile 4 °C'de 5 dakika boyunca kesintisiz santrifüj yapın.
  5. Pelet edilmiş hücreleri 4 °C'de 830 x g'de 55 dakika boyunca frensiz olarak %10,4 (v/d) yoğunluklu gradyan ortamından geçirin (bkz. Motor nöron bandını görsel arayüzde ileriye taşıyın.
    NOT: Tüm hücrelerin yakalanmasını sağlamak için, yoğunluk gradyanı adımı için fenol içermeyen ortam ve diğer tüm adımlar için fenol içeren ortam kullanın. Yoğunluk gradyanı ve ayrışma ortamının arayüzü, renk farkına göre kolayca tanımlanabilir.
  6. Spin bantları 470 x g'de 4 x g'de başka bir %4 w / v BSA yastığından 4 ° C'de 5 dakika boyunca kesintisiz olarak topladı.
  7. Saflaştırılmış motor nöronları tam nörobazal ortamda B27 takviyesi (% 2), glutamin (% 0.25), 2-merkaptoetanol (% 0.1), at serumu (% 2) ve penisilin-streptomisin ile yeniden askıya alın.
  8. 100 μg / mL polilizin ve 3 μg / mL laminin kaplı kapaklar üzerindeki plaka nöronları, 50.000 hücre / 35 mm cam tabanlı çanak yoğunluğunda kayar.

3. Nöronal transfeksiyonlar

NOT: Bu adım, GCaMP kalsiyum görüntülemeye tabi tutulacak nöronlar ve / veya sinaptik değerlendirmeden önce eksojen bir DNA plazmidi veya ilgili RNA'nın tanıtıldığı nöronlar için gerçekleştirilir. Buna karşılık, stiril boya görüntüleme seansından hemen önce yüklenir ve bölüm 6'da ele alınır. Aşağıdaki özet, sunulan örneklerde birincil kemirgen nöronları için kullanılan transfeksiyon protokolüdür, ancak kullanıcının ihtiyaçlarına kolayca uyarlanabilir ve optimize edilebilir.

  1. Kültürlenmiş primer kortikal nöronlar için transfeksiyonlar in vitro (DIV 12) 12. günde meydana gelirken, motor nöronlar in vitro (DIV 7) 7 . günde transfekte edilir.
    NOT: Aşağıdaki adımların tümü bir aseptik biyogüvenlik kabini içinde gerçekleşir.
  2. Transfeksiyon reaktifi kullanılarak hacimce 1:2 oranında GCaMP6m'nin 500 ng'sini transfektleyin. Ko-transfeksiyonlar için, bu DNA'nın reaktif oranını koruyarak toplam 1.25 μg toplam DNA / çanak ekleyin.
    NOT: Gösterilen deneysel örneklerde, 750 ng ALS / FTD ile ilişkili plazmid, C9orf72-ALS bağlantılı dipeptitleri, mutant FUS proteinini vb. İfade etmek için transfekte edilmiştir. Ko-transfekte plazmidin floresan etiketinin GCaMP görüntülemenin FITC kanalı ile çakışmayacağından emin olun. Aynı şekilde, stiril boya görüntüleme yapıyorsanız, ko-transfekte plazmidin görüntülemenin TRITC kanalı ile çakışmayacağından emin olun. Sinaptofizin-GCaMP3 kullanımı bu protokolde eşit derecede etkilidir. Bu nedenle, bu plazmidin aynı miktarını transfekte edin ve bölüm 7'de her zamanki gibi tüm adımları izleyin.
  3. DNA transfeksiyon reaktif kompleksini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Kuluçkaya yatırılan kompleksi, dönen nöronlara damla damla yavaşça ekleyin. Çanağı 45-60 dakika boyunca 37 ° C'de CO2 inkübatörüne geri koyun.
  5. DNA-transfeksiyon reaktif kompleksini içeren tüm kültür ortamını çıkarın ve önceden şartlandırılmış ve taze nöronal ortamın hacimce hazırlanmasıyla 50-50 ile değiştirin. Ardından, hücreleri görüntülemeye kadar 48 saat boyunca CO2 inkübatörüne geri koyun.

4. Tampon çözeltilerinin ve stiril boya stok çözeltisinin hazırlanması

  1. Tablo 1'de listelenen bileşenleri kullanarak görüntülemeden önce düşük ve yüksek aCSF çözeltilerini taze hale getirin. Kullanmadan önce her iki tampon çözeltisini de filtreleyin.
    NOT: CaCl2 dihidrat, depolandıktan sonra Ca(OH)2 oluşturabilir. Maksimum etkinlik için, her zaman yakın zamanda açılmış bir kap kullanın. Bu mümkün değilse, Ca(OH)2'yi dış yüzeyden çıkarmak ve maksimum çözünürlüğü sağlamak için, çözeltiler CaCl2 ilavesinden önce 5 dakika boyunca gaz halindeki CO2 ile karbonatlanabilir. Bu adım atılırsa, elde edilen çözeltinin pH'ını 7.4'lük bir pH değerini koruyacak şekilde ayarlayın, çünkü aşırı karbonasyon Ca (HCO3) 2 oluşumuna neden olur.
Düşük KCL aCSF tamponu (pH 7,40 ila 7,45)
ReaktifKonsantrasyon
HEPES10 mM
Arjantin140 mM
Kartal5 mM
Glikoz10 mM
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM
Yüksek KCL aCSF tamponu (pH 7,40 ila 7,45)
ReaktifKonsantrasyon
HEPES10 mM
Arjantin95 mM
Kartal50 mM
Glikoz10 mM
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM

Tablo 1: Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) tamponlarının bileşimi. Bu tablo, nöronları görüntülerken ve uyarırken kullanılan düşük ve yüksek KCl yapay beyin omurilik sıvısı tamponlarının hazırlanması için kullanılan bileşenleri içerir. Hazırlık talimatları için bölüm 4'e bakın.

  1. 100 μg'lık bir şişe boya alarak ve damıtılmış su veya nörobazal ortam ile 10 mM'lik bir stok konsantrasyonuna yeniden yapılandırarak stiril boya stok çözeltisi hazırlayın.

5. Mikroskop ve perfüzyon sistemi kurulumu

NOT: Cam tabanlı Petri kaplarını görüntülemek için, perfüzyonun esnekliği ve yüksek sayısal açıklıklı yağ daldırma hedefinin kullanılması nedeniyle ters çevrilmiş bir konfokal floresan mikroskobu tercih edilir. Temsili Sonuçlar bölümünde ayrıntılı olarak açıklanan örneklerin görüntülenmesinde kullanılan konfokal mikroskop, kamera ve hedefler için Malzeme Tablosuna bakın.

  1. Tüm deneyleri 37 °C'de sabit %5 CO2 seviyeleri ile inkübatör sistemine bağlı bir aşama montajı kullanarak gerçekleştirin.
  2. Konfokal yazılımı kullanarak görüntü yakalamayı kontrol edin. Uyarma gücünü seçmek için görüntüleme oturumunun başlangıcında alma ayarlarını optimize edin ve fotobeyazlatma olmadan sinyallerin en iyi şekilde görselleştirilmesini sağlamak için kazanın.
    1. Tüm numunelerde uyarma gücünü, pozlama süresini, dedektör kazancını ve kare hızını sabit tutun. Boya ağartmasını en aza indirmek için 512 x 512 en boy oranını ve 2 görüntü/sn kare hızını kullanarak hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin.
      NOT: Puntta açıkça görülebilmeli olsa da, ağartma ve fototoksisiteyi önlemek için lazer yoğunluğu mümkün olan en aza indirilmelidir. Nöritler içinde floresan punktanın optimum çözünürlüğünü elde etmek için konfokal diyaframı en dar ayara ayarlayın. Pozlama süresi, numuneler arasında tutarlı olarak 200 ms veya daha kısa bir süreye ayarlanır. Kullanılan kameranın maksimum görüntüleme hızı 2 görüntü/sn idi. Daha hızlı bir kamera kullanıyorsanız, daha fazla görüntü / s çekilebilir. Mümkünse zamansal görüntüleme ayarları seçilmelidir.
  3. Konfokal yazılım kullanarak görüntüleme için aşağıdaki floresan uyarma/dikroik/emisyon filtresi kombinasyonlarını seçin: sırasıyla FITC ile Gcamp6m/Gcamp3 ve TRITC ile stiril boya.
  4. Z-driftini önlemek için hızlandırılmış görüntüleme sırasında konfokal görüntüleme alma yazılımının mükemmel odak özelliğini kullanın.
    NOT: Hızlı görüntüleme hızı nedeniyle, tek bir düzlem görüntülenir. Deney sırasında z-drift eksikliğinin sağlanması çok önemlidir.
  5. Kayıt dönemlerini ve aralıklarını ayarlamak için görüntü alma panelinde Zaman sekmesini seçin.
    1. Faz #1'i Aralık 500 ms, Süre 3 - 5 dakika olarak ayarlayın.
    2. Faz #2'yi Aralık 500 ms, Süre 5 dakika olarak ayarlayın.
      NOT: Faz #1 sırasıyla temel kayda, Faz #2 stimülasyon periyoduna karşılık gelir.
  6. Bir valf kontrol sistemi ve bir kanal manifoldu kullanarak aCSF için yerçekimi perfüzyon aparatını monte edin.
    1. Yüksek KCl'yi (bakınız Tablo 1) aparatın üst kısmındaki 50 mL'lik bir şırıngaya yerleştirin ve boru sistemden geçin. Akış hızını 1 mL/dk olarak ayarlayın.
  7. Nöronlar içeren 35 mm'lik bir cam kabı, perfüzyon borusunun ucu çanak kenarına yerleştirilecek şekilde konfokal görüntüleme aşamasına yükleyin. Görüntüleme için alanı seçin.

6. Sinaptik vezikül salınımının stiril boya görüntülemesi

  1. Düşük KCl aCSF'deki hücreleri (bakınız Tablo 1) 37 °C'de 10 dakika, transfeksiyon sonrası 48 saat boyunca inkübe edin.
  2. Birincil kortikal veya motor nöronları cam tabanlı Petri kaplarına stiril boya ile yükleyin.
    1. Düşük KCl aCSF'yi aspirasyonla çıkarın.
    2. 5 dakika boyunca 50 mM KCl içeren aCSF'de 10 μM stiril boya ile karanlıkta nöronları yüklemek için bir pipet kullanın.
    3. Spesifik olmayan boya yüklemesini ortadan kaldırmak için yükleme solüsyonunu çıkarın ve nöronları düşük KCl aCSF'de 10 dakika boyunca yıkayın.
  3. 35 mm'lik cam tabanlı kabı görüntüleme aşamasına yerleştirin ve ardından ters çevrilmiş bir konfokal mikroskobun 20x hava hedefi veya 40x yağ daldırma hedefi altında gözlemleyin.
    NOT: GFP etiketli plazmidle birlikte transfekte edilen hücreler söz konusu olduğunda transfekte hücreleri bulmak için GFP floresansını kullanın.
  4. 546 nm lazer kullanarak stiril boyayı uyarın, 630-730 nm (TRITC) bandpass filtresi kullanarak emisyon toplayın.
  5. Görüntüleme alanını seçin ve mükemmel odaklama yapın. Ardından, nöronal sınırları işaretlemek için parlak alan, TRITC ve floresan işaretleyici kanallarıyla tek bir hareketsiz görüntü alın.
  6. Edinme yazılımında Şimdi Çalıştır'ı başlatın. Varsa boya yoğunluğundaki değişimleri dışlamak için bazal kaydı 3-5 dakika boyunca gerçekleştirin (Faz #1).
    NOT: Boya yoğunluğundaki herhangi bir azalmanın, pasif boya difüzyonu veya fotobeyazlatma değil, sinaptik vezikül salınımından kaynaklandığından emin olmak önemlidir. Bu 3-5 dakikalık ön stimülasyon süresi, sabit ve korunmuş bir boya yoğunluğu seviyesi ile sonuçlanmalıdır. Bu kaydın son 30 saniyesi, her bir yatırım getirisi için ortalama bir temel floresan değeri belirlemek için kullanılacaktır. Deneysel koşulları değerlendirmeden önce, lazer ayarlarını uzun süre kullanarak sabit floresan değerleri sağlamak için amaçlanan edinme ayarlarını kullanarak yaklaşık 10 dakikalık sürekli kayıttan oluşan ek bir uyarılmama koşulu da gerçekleştirilebilir.
  7. Faz #2'ye geçişte, perfüzyon sistemi için düğmede düğmesine basın. Daha sonra, boya boşaltmayı kolaylaştırmak için nöronlara sürekli olarak 50 mM KCl perfüze edin (Faz #2).
    1. KCl ilavesinden sonra 300 sn için kayıtlar yapın. Bundan sonra, satın alma durur; perfüzyon sistemi için Kapalı düğmesini tetikleyin.
  8. Denemeyi kaydedin ve aşağıdaki bölüm 8'de açıklandığı gibi konfokal yazılımı kullanarak verileri analiz edin.
    NOT: Deney bu noktada durdurulabilir ve analiz daha sonra yapılabilir. Hücrelerin ilgilenilen proteinlerin ekspresyonu için transfeksiyona ihtiyaç duymadığı durumlarda, bu protokol, sinaptik boşaltmanın işlevselliğini incelemeye çalışırken in vitro olarak herhangi bir zaman noktasında gerçekleştirilebilir. Uygun sinaptik boşaltmayı sağlamak için kontrol hücrelerinin bir testini takiben, deneyci, önyargıyı en aza indirmek için test edilen her bir kabın genetik veya farmakolojik koşullarına kör edilmelidir.

7. Gcamp6m kalsiyum geçicilerinin floresan görüntülemesi

  1. Transfect primer kemirgen kortikal nöronları, bölüm 3'te belirtildiği gibi 500 ng Gcamp6m ile 35 mm cam tabanlı kaplarda kültürlenmiştir.
    NOT: İstenirse, kırmızı veya uzak kırmızı aralıkta bir floresan etiketi içeren bir plazmid ile birlikte transfekt nöronlar.
  2. Transfeksiyon sonrası 15 dakika 48 saat boyunca düşük KCl aCSF'li nöronları inkübe edin ve ardından çanağı görüntüleme platformuna monte edin.
  3. GCaMP6m floresansını bir FITC filtresi (488 nm) ve 20x veya 40x hedefi kullanarak görselleştirin.
  4. Görüntüleme alanını seçin ve mükemmel odaklama yapın. Ardından, nöronal sınırları işaretlemek için parlak alan, FITC ve floresan işaretleyici kanallarıyla tek bir hareketsiz görüntü alın.
  5. Edinme yazılımında Şimdi Çalıştır'ı başlatın. Temel kaydı 5 dakika boyunca gerçekleştirin ve ardından stiril boya deneyleri için bölüm 6'da açıklandığı gibi 50 mM KCL içeren aCSF ile perfüze edin.
    NOT: Bu görüntülemenin amacı, uyarılmış kalsiyum geçicilerini ölçmektir. Bir nöronun ön stimülasyon döneminde bazal ateşleme aktivitesi ve kalsiyum akıları varsa, veri analizinde kullanılmaz. Bunun yerine, sadece stabil arka plan floresansına sahip hücreler kullanılır. Stimülasyon sonrası süreler, ilave sürekli yüksek KCl perfüzyonu olsun veya olmasın, kalsiyum geçicileri için 60 dakikaya kadar uzatılabilir.
  6. Denemeyi kaydedin ve aşağıdaki bölüm 8'de açıklandığı gibi konfokal yazılımı kullanarak verileri analiz edin. Deney bu noktada durdurulabilir ve analiz daha sonra yapılabilir.
    NOT: Hücreler, ilgilenilen proteinlerin ekspresyonu için transfeksiyona ihtiyaç duymuyorsa, kalsiyum geçicilerini incelemek için bu protokol in vitro olarak herhangi bir zaman noktasında gerçekleştirilebilir. Kalsiyum geçicilerinin ölçümünü sağlamak için kontrol hücrelerinin test edilmesinin ardından, deneyci, önyargıyı en aza indirmek için test edilen her bir kabın genetik veya farmakolojik koşullarına kör edilmelidir.

8. Görüntü analizi

  1. Hızlandırılmış görüntüleri konfokal yazılımla açın.
  2. Hızlandırılmış serideki görüntüleri komut serisiyle hizalayın: Görüntü | İşleme | Geçerli Belgeyi Hizalayın. İlk kareye hizala'yı seçin.
  3. Görüntü çerçevesinin sağındaki fasulye şeklindeki bir simge olan ROI seçim aracını kullanarak nöritler boyunca ilgi çekici bölgeleri (ROI) seçin (Şekil 3B). Ayrıca, arka plan floresan yoğunluğunu temsil eden bir yatırım getirisini işaretleyin.
    NOT: ROI'ler, parlak alan hareketsiz görüntüsü tarafından gösterilen nöronal izler boyunca belirgin şekilde ayrılmış puncta alanları seçilerek seçilir. Analiz için nöron başına en az beş ROI seçilir. Arka plan yatırım getirisi, görüş alanının nörit içermeyen bir bölgesinde seçilir.
  4. Aşağıdaki komut serisini kullanarak seçilen yatırım getirilerinde zaman içinde ham floresan ölçümü: | ölçün Zaman Ölçümü.
    1. Zaman Ölçümü panelinin üst kısmındaki Ölçüm işlevini başlatın. Zaman içinde ham floresanın grafiksel bir temsili (Şekil 3C) ve nicel verilerin her ikisi de üretilir.
      NOT: Her veri noktası, ölçülen belirli zaman noktasıyla ilişkili çerçeve için söz konusu YG'nin ham floresansını temsil eder.
  5. Ham floresan yoğunluklarını elektronik tablo yazılımına aktarın.
  6. Her yatırım getirisini bağımsız olarak analiz edin. İlk olarak, arka plan yatırım getirisi yoğunluğunu her zaman noktasında faiz yoğunluğunun yatırım getirisinden çıkararak verileri normalleştirin.
    1. Her belirli zaman noktasında arka plan yatırım getirisinden ham floresan değerini alın ve bunu o zaman noktasındaki faiz ham yoğunluk değerinin YG'sinden çıkarın.
      NOT: Bu, hem bazal hem de stimülasyon aşamaları olmak üzere tüm kayıt süresi boyunca yapılır.
  7. Taban çizgisinin son 30 saniyesi için faiz yoğunluğunun ortalama yatırım getirisini belirleyin.
    1. 3-5 dakikalık bazal kayıt periyodunun son 30 saniyesinden 8.6. adımda üretilen normalleştirilmiş ham bazal değerlerin ortalaması.
      NOT: Bu değeri üretmek için bazal kayıt periyodunun tamamı kullanılabilir. Bununla birlikte, bu değer stabilize edildiğinden ve korunduğundan, son 30 s'nin 60 zaman noktası, bütünü temsil etmek için yeterli örnekleme boyutuna sahiptir.
  8. Bu temel değeri, floresan (ΔF) değerinde bir değişiklik yaratarak her zaman noktasındaki normalleştirilmiş yoğunluk değeriyle karşılaştırın.
    1. Adım 8.7'deki değeri alın ve ortalama temel floresan değerini çıkarın. Bunu ve sonraki adımları tüm kayıt dönemi boyunca, hem bazal hem de stimülasyon fazları için yapın.
  9. Bu değişikliği temel floresan değeri ile ilgili olarak hesaplayın ve floresan/bazal floresanda (ΔF/F) bir değişiklik yaratın. Bunu yapmak için, adım 8.8'deki değeri alın ve ortalama temel floresan değerine bölün.
  10. Son olarak, başlangıç noktası değerini 1 olarak ayarlayın, böylece artışlar veya azalmalar zaman içinde grafiksel olarak kolayca görselleştirilebilir.
    1. Adım 8.9'da üretilen değeri alın ve 1 ekleyin.
      NOT: Bu doğru yapıldığında, 30 sn'lik temel dönem değerleri 1 değerinin üzerine gelmelidir. Sinaptik içeriği etkili bir şekilde serbest bırakan hücrelerde, bu değer stimülasyonun başlamasından sonra 1'den 0'a doğru eğilim göstermelidir. Adım 6-9'a bir örnek Şekil 3E'de sunulmuştur.

9. Veri analizi

NOT: Deneyci, analiz için verileri uygun şekilde bir araya getirmek için deneysel koşullara kör olmayabilir. Üç bağımsız deneyin her birinden koşul başına en az 10 nöron örneklem büyüklüğü kullanın. Nöronları yalnızca en az beş ROI bölgesi belirlenebiliyorsa dahil etmek için düşünün. Bu deneysel replikasyon seviyesi, yayınlanmış çalışmalarda, GFP kontrollerine karşı ALS ile ilişkili poli-GA içeren hücrelerde derin bir sinaptik boşaltma kaybını göstermek için yeterliydi (bkz. Bununla birlikte, daha ince bir fenotip gözlenirse, biyolojik ve / veya teknik kopyaların sayısı kullanıcı tarafından optimizasyon gerektirebilir.

  1. Belirli bir deneysel koşulun YG'lerinden zaman içinde hesaplanan tüm ΔF / F değerlerini kullanarak, bir SEM ile birlikte her zaman noktası için ortalama bir ΔF / F değeri belirleyin.
  2. xy biçiminde bir grafik ve istatistik yazılımı programı kullanarak verileri çizin, burada x geçen süredir ve y, adım 9.1'de hesaplanan ΔF / F değeridir. Tüm değerleri ortalama SEM ± olarak sunun.
  3. İstatistiksel anlamlılığı belirlemek için, iki grubu karşılaştırmak için Öğrencinin t-testini ve tek yönlü varyans analizini (ANOVA) ve ardından üç veya daha fazla grubu karşılaştırmak için Tukey'in posthoc analizini kullanın.

Sonuçlar

Yukarıdaki protokolün başarılı bir şekilde uygulanmasını takiben, tipik bir stiril boya sinaptik vezikül salınım deneyi için temsili sonuçlar gösterilmiştir. Kültürlenmiş sıçan primer kortikal nöronları, bölüm 6'da açıklanan yöntem kullanılarak boya ile yüklendi. Boya yüklemesinin özgüllüğü, sinaptik vezikül marker sinaptophysin ile birlikte etiketlenerek belirlendi. Steril boya pozitif puncta'nın çoğunluğu bu belirteç için eş pozitiftir (Şekil 2A)...

Tartışmalar

Açıklanan her iki yöntemde de ortak olan üç adım, deneysel başarı ve ölçülebilir sonuçlar için çok önemlidir. İlk olarak, ekteki talimatları izleyerek, her deney turundan önce taze aCSF'nin hazırlanması esastır. Bunun yapılmaması, uygun nöronal depolarizasyonu önleyebilir. Tedavi edilmemiş kontrol nöronlarının bir örneği, uygun hücresel depolarizasyonu sağlamak ve bu görüntüleme seansında elde edilen olumlu sonuçlar için bir ölçüt sağlamak için herhangi bir deney grubunun uyar?...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Jefferson Weinberg ALS Merkezi'nin mevcut ve eski üyelerine, bu teknikleri ve analizlerini optimize etmek için eleştirel geri bildirim ve öneriler için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH (RF1-AG057882-01 ve R21-NS0103118'den D.T.'ye), NINDS (R56-NS092572 ve R01-NS109150'den P.P.'ye), Kas Distrofisi Derneği (DT), Robert Packard ALS Araştırma Merkezi (D.T.), Family Strong 4 ALS vakfı ve Farber Family Foundation (B.K.J., K.K ve P.P.) tarafından finanse edildi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
20x air objectiveNikonFor imaging
40x oil immersion objectiveNikonFor imaging
B27 supplementThermo Scientific17504044Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mLThermo Scientific13-689-8Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hoodBakerSterilGARD III SG403AAsceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-MercaptoethanolMillipore SigmaM3148For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9418For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrateMillipore Sigma223506Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubatorThermo Scientific13-998-123For culturing and maintenance of neurons
CentrifugeEppendorf5810RFor neuronal culture preparation
Confocal microscopeNikonEclipse Ti +A1R coreFor fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD cameraPhotometricsFor image acquisition
D-GlucoseMillipore SigmaG8270Component of aCSF solutions
DNaseMillipore SigmaD5025For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley ratsCharles river400SASSDFor preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cubeNikon77032509For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dyeInvitrogenT13320For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)CellVisD35-10-1.5-NFor growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipetteGrainger52NK56For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Millipore SigmaH6648For preparing neuronal cultures
HEPESMillipore SigmaH3375Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
horse serumMillipore SigmaH1138For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hoodNUAIRENU-301-630For preparing neuronal cultures
LamininThermo Scientific23017015For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 MediumThermo Scientific11415064For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol redThermo Scientific21083027For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM)Thermo Scientific25030149Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Scientific11668019For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
Magnesium chlorideMillipore Sigma208337Component of aCSF solutions
Microsoft ExcelMicrosoftSoftware for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PESThermo Scientific565-0020Filter unit for aCSF solution
Neurobasal mediumThermo Scientific21103049For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced ResearchNikonSoftware for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubesThermo Scientific339650For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubesThermo Scientific339652For preparing neuronal culture and buffer solutions
OptiprepMillipore SigmaD1556For preparing neuronal cultures
PapainMillipore SigmaP4762For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Scientific15140122To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion systemWarner InstrumentsSF-77BFor exchange of aCSF
Perfusion tubingCole-ParmerUX-30526-14Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmidAddgene40754For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromideMillipore SigmaP7886Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chlorideMillipore SigmaP3911Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonateMillipore SigmaS5761Component of aCSF solutions
Sodium ChlorideMillipore SigmaS9888Component of aCSF solutions
Stage Top IncubatorTokai HitFor incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cubeNikon77032809For imaging FM4-64
Trypsin InhibitorMillipore SigmaT6414For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Scientific25200056For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation tableNew PortVIP320X2430-135520Table/stand for microscope

Referanslar

  1. Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16 (2015).
  5. Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
  6. Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
  7. Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
  8. Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, 1540-1550 (2008).
  9. Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
  10. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  11. Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
  12. Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
  13. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  14. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  15. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  16. Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
  17. Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
  18. Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
  19. Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
  20. Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
  21. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  22. Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
  23. Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13 (2021).
  24. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
  27. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  28. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
  29. Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
  30. Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
  31. Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle's loop. American Journal of Physiology. 268 (6), 1148-1153 (1995).
  32. Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
  33. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  34. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  37. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  38. Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
  39. Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
  40. Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
  41. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  42. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
  43. Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722 (2020).
  44. Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
  45. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  46. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113 (2017).
  47. Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
  48. Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  49. Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
  50. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  51. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  52. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
  53. Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
  54. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  55. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
  56. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  57. Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
  58. Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570 (2020).
  59. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  60. Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583 (2019).
  61. Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
  62. Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
  63. Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
  64. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  65. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427 (2017).
  66. Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
  67. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
  68. Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır