근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

요약

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

초록

신경 세포 변성 전에, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 / 또는 전측두엽 치매 (FTLD) 환자의 운동 및인지 결핍의 원인은 뉴런과 운동 뉴런과 근육 사이의 의사 소통의 기능 장애입니다. 시냅스 전달의 기본 과정은 막 탈분극 의존성 시냅스 소포 융합과 신경 전달 물질의 시냅스 방출을 포함합니다. 이 과정은 시냅스 소포가 상주하는 시냅스 전 말단으로 국부적 인 칼슘 유입을 통해 발생합니다. 여기서, 상기 프로토콜은 배양된 뉴런에서 탈분극-매개 시냅스 소포 엑소사이토시스 및 시냅스 전 말단 칼슘 유입 역학을 안정적으로 보고하는 형광 기반 라이브 이미징 방법론을 기술한다.

시냅스 소포 막에 혼입되는 스티릴 염료를 사용하여, 시냅스 소포 방출이 해명된다. 한편, 칼슘 유입을 연구하기 위해 Gcamp6m은 유전적으로 인코딩 된 형광 리포터로 사용됩니다. 우리는 높은 염화칼륨 매개 탈분극을 사용하여 신경 활동을 모방합니다. 시냅스 소포 엑소사이토시스를 명확하게 정량하기 위해, 우리는 시간의 함수로서 정규화된 스티릴 염료 형광의 손실을 측정한다. 유사한 자극 조건 하에서, 칼슘 유입의 경우, Gcamp6m 형광이 증가한다. 이러한 형광 변화의 정규화 및 정량화는 스티릴 염료 프로토콜과 유사한 방식으로 수행된다. 이들 방법은 형광 태깅된 돌연변이체 단백질의 형질감염-기반 과발현으로 다중화될 수 있다. 이러한 프로토콜은 일차 설치류 피질 및 운동 뉴런을 활용하여 FUS-ALS 및 C9ORF72-ALS 모델에서 시냅스 기능 장애를 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 이러한 프로토콜은 뉴런 통신을 개선할 수 있는 화합물의 신속한 스크리닝을 쉽게 허용한다. 따라서 이러한 방법은 ALS 연구뿐만 아니라 신경 퇴행성 및 발달 신경 과학 연구의 모든 분야에 유용합니다.

서문

실험실에서 근위축성 측삭경화증(ALS)을 모델링하는 것은 80% 이상의 사례¹의 압도적으로 산발적인 특성으로 인해 질병 원인으로 알려진 방대한 수의 유전 돌연변이와 결합되어 독특하게 도전적으로 이루어집니다². 그럼에도 불구하고, ALS의 모든 사례는 철저한 신경 변성 전에 시냅스 전 운동 뉴런과 시냅스 후 근육 세포 사이에 기능 장애 통신이 있다는 통일 된 특징^{을 공유합니다3,4}. 임 상적으로, 환자들이 남아있는 상부 및 하부 운동 뉴런의 연결성을 상실함에 따라, 그들은 질병 전반에 걸쳐 뉴런 하이퍼 및 저흥분성의 특징을 가지고 있습니다.5,6,7,8,9^, ALS 연구원으로서 우리가 이해하고자하는 이러한 시냅스에 대한 복잡한 기본 분자 변화를 반영합니다.

다중 트랜....

프로토콜

이 연구에서 수행 된 모든 동물 절차는 제퍼슨 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.

1. 배아 쥐 피질에서 뉴런의 1차 배양

참고: 일차 피질 뉴런은 앞서 기술한 바와 같이 E17.5 래트 배아로부터 분리된다^57,58. 이 배양 프로토콜의 성공으로 균주 편향이 존재하지 않는 것으로 보입니다. 이 방법은 아래에 간략하게 설명되어 있습니다. 표시된 이전 문서는 전체 세부 정보를 참조해야 합니다.

1. CO2 흡입으로 임신 한 암컷 쥐를 안락사시킨 다음 자궁 경부 탈구에 의한 2 차 확인.
2. 배아를 수확하고 얼음처럼 차가운 20mM HEPES 완충 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)에서 뇌를 분리하십시오. 외부 피질 껍질에서 분리한 다음 선조체와 해마를 버립니다. 코르티크를 수집하십시오.
3. 미세한 포셉을 사용하여 코르티크에서 수막을 제거하십시오. 이렇게하려면 부드러운 압력을 사용하여 한 쌍의 밀폐 된 포셉으로 피질을 제자리에 고정하십시오.
   참고 : 두 번째 포셉 쌍을 두 번째 손에 넣으면 수막이 핀치됩....

결과

상기 프로토콜의 성공적인 구현에 이어서, 전형적인 스티릴 염료 시냅스 베시클 방출 실험에 대한 대표적인 결과가 제시된다. 배양된 래트 일차 피질 뉴런은 섹션 6에 기재된 방법을 사용하여 염료를 로딩하였다. 염료 로딩의 특이성은 시냅스 소포 마커 시냅토피신과의 공동 표지에 의해 결정되었다. 스티릴 염료 양성 펑타의 대다수는 이 마커에 대해 공동-양성이다(도 2A). ?.......

토론

설명 된 두 가지 방법에 공통적 인 세 단계는 실험 성공과 정량화 가능한 결과에 매우 중요합니다. 첫째, 각 실험 라운드 전에 신선한 aCSF를 준비하는 것이 첨부 된 지침에 따라 필수적입니다. 그렇게하지 않으면 적절한 신경 세포 탈분극을 예방할 수 있습니다. 처리되지 않은 대조군 뉴런의 샘플은 적절한 세포 탈분극을 보장하고 해당 이미징 세션에서 얻은 긍정적 인 결과에 대한 벤치 마크를 제?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
20x air objective	Nikon		For imaging
40x oil immersion objective	Nikon		For imaging
B27 supplement	Thermo Scientific	17504044	Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL	Thermo Scientific	13-689-8	Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood	Baker	SterilGARD III SG403A	Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol	Millipore Sigma	M3148	For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418	For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate	Millipore Sigma	223506	Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator	Thermo Scientific	13-998-123	For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge	Eppendorf	5810R	For neuronal culture preparation
Confocal microscope	Nikon	Eclipse Ti +A1R core	For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera	Photometrics		For image acquisition
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270	Component of aCSF solutions
DNase	Millipore Sigma	D5025	For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats	Charles river	400SASSD	For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube	Nikon	77032509	For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye	Invitrogen	T13320	For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)	CellVis	D35-10-1.5-N	For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette	Grainger	52NK56	For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Millipore Sigma	H6648	For preparing neuronal cultures
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)			For imaging. Please see recipes*
horse serum	Millipore Sigma	H1138	For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood	NUAIRE	NU-301-630	For preparing neuronal cultures
Laminin	Thermo Scientific	23017015	For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium	Thermo Scientific	11415064	For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Thermo Scientific	21083027	For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Scientific	25030149	Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Scientific	11668019	For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)			For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride	Millipore Sigma	208337	Component of aCSF solutions
Microsoft Excel	Microsoft		Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES	Thermo Scientific	565-0020	Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium	Thermo Scientific	21103049	For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research	Nikon		Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes	Thermo Scientific	339650	For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339652	For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep	Millipore Sigma	D1556	For preparing neuronal cultures
Papain	Millipore Sigma	P4762	For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Scientific	15140122	To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system	Warner Instruments	SF-77B	For exchange of aCSF
Perfusion tubing	Cole-Parmer	UX-30526-14	Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid	Addgene	40754	For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide	Millipore Sigma	P7886	Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate	Millipore Sigma	S5761	Component of aCSF solutions
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S9888	Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator	Tokai Hit		For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube	Nikon	77032809	For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor	Millipore Sigma	T6414	For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200056	For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table	New Port	VIP320X2430-135520	Table/stand for microscope