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요약

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

초록

신경 세포 변성 전에, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 / 또는 전측두엽 치매 (FTLD) 환자의 운동 및인지 결핍의 원인은 뉴런과 운동 뉴런과 근육 사이의 의사 소통의 기능 장애입니다. 시냅스 전달의 기본 과정은 막 탈분극 의존성 시냅스 소포 융합과 신경 전달 물질의 시냅스 방출을 포함합니다. 이 과정은 시냅스 소포가 상주하는 시냅스 전 말단으로 국부적 인 칼슘 유입을 통해 발생합니다. 여기서, 상기 프로토콜은 배양된 뉴런에서 탈분극-매개 시냅스 소포 엑소사이토시스 및 시냅스 전 말단 칼슘 유입 역학을 안정적으로 보고하는 형광 기반 라이브 이미징 방법론을 기술한다.

시냅스 소포 막에 혼입되는 스티릴 염료를 사용하여, 시냅스 소포 방출이 해명된다. 한편, 칼슘 유입을 연구하기 위해 Gcamp6m은 유전적으로 인코딩 된 형광 리포터로 사용됩니다. 우리는 높은 염화칼륨 매개 탈분극을 사용하여 신경 활동을 모방합니다. 시냅스 소포 엑소사이토시스를 명확하게 정량하기 위해, 우리는 시간의 함수로서 정규화된 스티릴 염료 형광의 손실을 측정한다. 유사한 자극 조건 하에서, 칼슘 유입의 경우, Gcamp6m 형광이 증가한다. 이러한 형광 변화의 정규화 및 정량화는 스티릴 염료 프로토콜과 유사한 방식으로 수행된다. 이들 방법은 형광 태깅된 돌연변이체 단백질의 형질감염-기반 과발현으로 다중화될 수 있다. 이러한 프로토콜은 일차 설치류 피질 및 운동 뉴런을 활용하여 FUS-ALS 및 C9ORF72-ALS 모델에서 시냅스 기능 장애를 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 이러한 프로토콜은 뉴런 통신을 개선할 수 있는 화합물의 신속한 스크리닝을 쉽게 허용한다. 따라서 이러한 방법은 ALS 연구뿐만 아니라 신경 퇴행성 및 발달 신경 과학 연구의 모든 분야에 유용합니다.

서문

실험실에서 근위축성 측삭경화증(ALS)을 모델링하는 것은 80% 이상의 사례1의 압도적으로 산발적인 특성으로 인해 질병 원인으로 알려진 방대한 수의 유전 돌연변이와 결합되어 독특하게 도전적으로 이루어집니다2. 그럼에도 불구하고, ALS의 모든 사례는 철저한 신경 변성 전에 시냅스 전 운동 뉴런과 시냅스 후 근육 세포 사이에 기능 장애 통신이 있다는 통일 된 특징을 공유합니다3,4. 임 상적으로, 환자들이 남아있는 상부 및 하부 운동 뉴런의 연결성을 상실함에 따라, 그들은 질병 전반에 걸쳐 뉴런 하이퍼 및 저흥분성의 특징을 가지고 있습니다.5,6,7,8,9, ALS 연구원으로서 우리가 이해하고자하는 이러한 시냅스에 대한 복잡한 기본 분자 변화를 반영합니다.

다중 트랜스제닉 모델은 SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 및 TDP4317,18,19를 포함하는 ALS 원인 유전자 돌연변이의 발현과 함께 신경근 접합부의 악화 및 해체가 발생한다는 것을 예시하였다. 시냅스 부톤, 척추 밀도 및 시냅스 전/후 조직의 평가를 포함한 형태학적 평가를 통해. 기계론적으로, 1930년대 콜, 호지킨, 헉슬리의 획기적인 논문 이후, 시험관내 세포 배양 또는 조직 슬라이스 제제20에서 전기생리학적 기술을 통해 시냅스 반응을 평가하는 것도 가능해졌다. 이러한 전략을 통해 ALS의 많은 모델은 시냅스 전달 결핍을 입증했습니다. 예를 들어, TDP43의 돌연변이 변이체는 향상된 발사 주파수를 야기하고 NSC-34 (척수 x 신경모세포종 하이브리드 세포주 34) 전동-뉴런-유사 세포21에서 작용 전위 역치를 감소시킨다. 이 동일한 변이체는 또한 마우스 모델에서 행동 운동 결핍이 발병하기 전에 신경근 접합부 (NMJ)에서 기능 장애 시냅스 전달을 일으킨다22. 이전에 FUS 발현 돌연변이체가 운동 결함 전에 FUS-ALS의 초파리 모델에서 NMJ에서 감소된 시냅스 전달을 초래한다는 것을 보여주었다11. C9orf72-확장 담체로부터 유래된 유도된 만능 줄기 세포를 사용한 최근의 보고는 시냅스 소포의 쉽게 분리가능한 풀의 감소를 밝혀냈다23. 전체적으로, 이러한 연구와 다른 연구들은 ALS의 질병 관련 모델에서 시냅스 신호전달의 기초가 되는 메커니즘에 대한 보다 포괄적인 이해를 구축하는 것의 중요성을 강조한다. 이것은 ALS의 병리학을 이해하고 환자를위한 잠재적 인 치료 목표를 개발하는 데 중추적 인 역할을 할 것입니다.

전류 및 전압 클램핑 셀의 방법은 컨덕턴스, 휴지 막 전위 및 개별 시냅스의 양자 함량과 같은 멤브레인 특성을 결정하는 데 매우 중요합니다20,24. 그러나 전기 생리학의 중요한 한계 중 하나는 기술적으로 도전적이며 한 번에 하나의 뉴런에서만 통찰력을 제공한다는 것입니다. 특정 형광 프로브와 결합 된 살아있는 세포 공초점 현미경 검사는 시공간 방식으로 뉴런의 시냅스 전달을 조사 할 수있는 기회를 제공합니다.25,26,27. 신경 흥분성의 직접적인 측정은 아니지만,이 형광 접근법은 시냅스 기능의 두 분자 상관 관계, 즉 시냅스 소포 방출과 시냅스 말단에서의 칼슘 과도 상태의 상대적 측정을 제공 할 수 있습니다.

작용 전위가 뉴런의 시냅스 전 말단 영역에 도달하면, 칼슘 과도 상태가 트리거되어 전기 신호에서 신경 전달 물질 방출 과정으로의 전환을 촉진합니다28. 이 영역에 국한된 전압 게이트 칼슘 채널은 칼슘 신호 전달을 엄격하게 조절하여 신경 전달 물질 방출의 동역학을 조절합니다29. 칼슘 과도 물질의 첫 번째보고 된 형광 기반 기록은 이중 파장 표시기 Fura-2 AM 또는 단일 파장 염료 Fluo-3 AM30,31,32를 사용하여 수행되었습니다. 이러한 염료는 당시에 큰 새로운 통찰력을 제공했지만, 세포 내 비특이적 구획화, 표지 된 세포로부터의 활성 또는 수동 염료 손실, 광표백 및 장기간에 걸쳐 이미징 된 경우 독성과 같은 몇 가지 한계로 고통 받고 있습니다33. 지난 수십 년 동안 유전적으로 인코딩 된 칼슘 지표는 다양한 형태의 신경 활동을 이미징하는 데 효과적이었습니다. 이 지표는 변형된 형광 단백질과 칼슘 킬레이터 단백질을 결합하여 Ca2+ 이온34의 결합 후 형광 강도를 빠르게 전환합니다. 이러한 새로운 지표의 적용은 광대하며, 시험관내 및 생체내 설정 모두에서 세포 내 칼슘 과도 상태를 훨씬 쉽게 시각화할 수 있습니다. GCaMP로 알려진 이러한 유전적으로 인코딩 된 기자의 한 가족은 현재 광범위하게 활용되고 있습니다. 이들 지표는 C 말단 칼모듈린 도메인을 함유하고, 이어서 녹색 형광 단백질(GFP)을 함유하고, N 말단 칼모듈린 결합 영역35,36에 의해 캡핑된다. 칼슘-도메인이 칼모듈린 결합 영역과의 상호작용을 촉발시켜, 전체 단백질 구조의 형태적 변화 및 GFP 모이어티35,36의 형광의 실질적인 증가를 초래한다. 수년에 걸쳐,이 기자 가족은 특정 동역학 (느리고, 중간, 빠름)을 가진 특정 칼슘 과도 상태에 대한 뚜렷한 판독을 가능하게하기 위해 몇 가지 진화를 거쳤으며, 각각은 약간 다른 특성을 가지고 있습니다37,38. 여기서, GcaMP6 리포터의 용도가 강조되었으며, 이는 생체내 및 시험관내 둘 다에서 뉴런에서 단일 작용 전위 및 수지상 칼슘 과도기를 검출하는 것으로 이전에 보여졌다37.

시냅스 전 영역의 칼슘 과도 상태는 시냅스 소포 융합 이벤트를 유발하여 시냅스 내로 신경 전달 물질 방출을 유발하고 시냅스 후 세포에서 신호 전달 이벤트를 시작합니다28,39. 시냅스 소포는 세포가 동종 정적으로 안정적인 세포막 표면적을 유지하고 융합 가능한 막 결합 소포의 쉽게 분리 가능한 풀을 유지하기 때문에 빠르게 방출되고 재활용됩니다40. 여기서 사용되는 스티릴 염료는 지질막에 대한 친화력을 가지며, 특히 주변 지질 환경의 순서에 따라 방출 특성을 변화시킨다41,42. 따라서, 그것은 시냅스 소포를 재활용하고 신경 자극 후 나중에 방출되는 이러한 소포의 후속 추적에 이상적인 도구입니다41,42. 생성되고 최적화 된 프로토콜은 Gaffield와 동료들에 의해 초기에 설명 된 개념의 적응이며, 이는 시간이 지남에 따라 스티릴 염료 표지 시냅스 베시클 누자를 지속적으로 시각화 할 수있게 해줍니다41.

여기에서, 두 개의 관련 형광-기반 방법론이 설명되고, 시냅스 전달에 관여하는 특정 세포 사건을 확실하게 보고한다. 프로토콜은 배양된 뉴런에서 탈분극 매개 시냅스 전 말단 칼슘 유입 및 시냅스 소포 외세포증의 역학을 조사하기 위해 정의되었다. 여기서, 방법 및 대표적인 결과는 일차 설치류 피질 또는 운동 뉴런을 시험관내 모델 시스템으로서 사용하는 것에 초점을 맞추고 있으며, 이들 세포 유형43,44을 이용한 발표된 연구가 있다. 그러나 이러한 방법은 분화 된 인간 i3 피질 유사 뉴런에도 적용 할 수 있습니다.45 우리 실험실에서 현재 진행중인 실험에서 두 프로토콜 모두에서 성공을 거두었습니다. 일반 프로토콜은 그림 1에 표시된 단계적 선형 형식으로 요약되어 있습니다. 간단히 말해서, 뉴라이트에서 칼슘 역학을 연구하기 위해, 성숙한 뉴런은 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 37,46 하에 형광 리포터 GCaMP6m을 발현하기 위해 플라스미드 DNA로 형질감염된다. 형질감염된 세포는 낮은 수준의 기저 녹색 형광을 가지며, 이는 칼슘의 존재 하에서 증가한다. 관심 영역은 우리의 조작 전반에 걸쳐 형광 변화를 모니터링하기 위해 지정됩니다. 이를 통해 칼슘의 고도로 공간적, 시간적으로 국소화된 변동을 측정할 수 있습니다37,46. 시냅스 소포 융합 및 방출을 평가하기 위해, 성숙한 뉴런은 시냅스 전 세포에서 신경 전달 물질로 재활용, 변형 및 재장전됨에 따라 시냅스 소포막에 통합 된 스티릴 염료가 로딩됩니다41,42,43,47,48. 이 목적을 위해 사용되는 현재 염료는 신경돌기를 따라 시냅스 소포를 라벨링하고 Kraszewski와 동료49에 의해 스티릴 염료와 시냅토타민의 공동 염색에 의해 나타난 바와 같이 라이브 이미징 실험에서 이들 영역에 대한 프록시로 사용된다. 여기에는 유사한 염색이 또한 수행되었던 대표적인 이미지들이 포함된다(도 2A). 이전의 연구자들은 신경근 접합부와 해마 뉴런에서 시냅스 소포 역학을보고하기 위해 이러한 염료를 광범위하게 사용했습니다.48,49,50,51,52,53,54,55,56 . 염료가 로딩된 소포의 펑크 영역을 선택하고 소포 방출 후 형광 강도의 감소를 모니터링함으로써, 자극 후 기능적 시냅스 전달 능력 및 방출의 시간적 역학을 연구할 수 있다43. 두 방법 모두에 대해, 고농도의 염화칼륨을 함유하는 배지가 뉴런 활성을 모방하기 위해 세포를 탈분극시키기 위해 사용된다. 이미징 파라미터는 기준선 정규화에 걸친 서브초 간격을 캡처하고 자극 캡처 기간을 따르도록 지정됩니다. 각 시점에서의 형광 측정은 결정되고, 배경으로 정규화되고, 실험 기간에 걸쳐 정량화된다. 칼슘-매개 GCaMP6m 형광 증가 또는 효과적인 시냅스 베시클 엑소사이토시스 스티릴 염료 방출 형광 감소는 이러한 전략을 통해 검출될 수 있다. 이 두 프로토콜에 대한 자세한 방법론적 설정 및 매개 변수와 그 장점과 한계에 대한 논의는 아래에 설명되어 있습니다.

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그림 1: 전체 일반 프로토콜 프로세스의 시각적 렌더링. (1) 1차 설치류 뉴런을 시험관 내에서 분리하고 배양하여 선택된 성숙 시점으로 한다. (2) GCaMP DNA 또는 스티릴 염료를 시냅스 활성의 리포터로 도입한다. (3) 라이브 이미징이 장착 된 공초점 현미경 및 관련 소프트웨어를 사용하여 이미징 패러다임을 설정합니다. 초기 계획 기록 기간을 시작합니다. (4) 세포가 여전히 라이브 이미지 캡처를 겪고있는 동안, 높은 KCl 목욕 관류를 통해 뉴런을 자극하십시오. (5) 칼슘 과도 상태 또는 시냅스 소포 융합을 측정하기 위해 시간에 따른 형광 강도 측정을 평가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

이 연구에서 수행 된 모든 동물 절차는 제퍼슨 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.

1. 배아 쥐 피질에서 뉴런의 1차 배양

참고: 일차 피질 뉴런은 앞서 기술한 바와 같이 E17.5 래트 배아로부터 분리된다57,58. 이 배양 프로토콜의 성공으로 균주 편향이 존재하지 않는 것으로 보입니다. 이 방법은 아래에 간략하게 설명되어 있습니다. 표시된 이전 문서는 전체 세부 정보를 참조해야 합니다.

  1. CO2 흡입으로 임신 한 암컷 쥐를 안락사시킨 다음 자궁 경부 탈구에 의한 2 차 확인.
  2. 배아를 수확하고 얼음처럼 차가운 20mM HEPES 완충 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)에서 뇌를 분리하십시오. 외부 피질 껍질에서 분리한 다음 선조체와 해마를 버립니다. 코르티크를 수집하십시오.
  3. 미세한 포셉을 사용하여 코르티크에서 수막을 제거하십시오. 이렇게하려면 부드러운 압력을 사용하여 한 쌍의 밀폐 된 포셉으로 피질을 제자리에 고정하십시오.
    참고 : 두 번째 포셉 쌍을 두 번째 손에 넣으면 수막이 핀치됩니다. 꼬집은 쌍으로 롤링 모션을 사용하여 수막을 벗겨냅니다. 닫힌 포셉으로 재배치하고 수막이 완전히 제거 될 때까지 필요에 따라 반복하십시오.
  4. 피질을 HBSS에서 10 μg/mL의 파파인으로 37°C에서 4분 동안 인큐베이션한다.
  5. HBSS에서 3회 세척한 다음, 불 광택 유리 파스퇴르 피펫으로 5-10회 부드럽게 트리투레이트하여 균질한 세포 현탁액을 얻었다.
    참고 : 거품을 피하십시오. 세포 현탁액 내에서 피펫을 유지하십시오.
  6. 100 μg/mL 폴리-D-라이신에 플레이트 뉴런은 B27 보충제(2%)와 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 뉴로베이스 배지에서 75,000 세포/접시의 밀도로 35mm 유리 바닥 접시를 코팅했습니다.

2. 배아 쥐 척수에서 운동 뉴런의 일차 배양

참고: 일차 운동 뉴런은 앞서 기술한 바와 같이 E13.5 래트 배아로부터 제조되며, 거의 수정되지 않았다59,60. 이 배양 프로토콜의 성공으로 균주 편향이 존재하지 않는 것으로 보입니다. 이 방법은 아래에 간략하게 설명되어 있습니다. 앞의 문서는 전체 세부 정보를 참조해야 합니다.

  1. 단계 1.1에서와 같이 임신한 암컷 쥐를 안락사시킨다.
  2. 배아에서 10-20 척수를 해부하고 각각 꼬집고 당기기 위해 두 쌍의 포셉을 사용하여 기계적으로 작은 조각으로 분해하십시오.
  3. 8분 동안 0.025% 트립신에서 인큐베이션하고, 1mg/mL에서 DNase를 첨가하였다.
  4. 470 x g 에서 4% w/v BSA 쿠션을 4°C에서 5분 동안 휴식 없이 원심분리한다.
  5. 세포를 10.4% (v/v) 밀도 구배 배지 (재료 표 참조) 쿠션을 통해 브레이크 없이 4°C에서 830 x g에서 55분 동안 펠릿화하였다. 시각적 인터페이스에서 모터 뉴런 밴드를 앞으로 운반하십시오.
    참고: 모든 세포의 포획을 보장하려면 밀도 구배 단계에는 페놀이 없는 배지를 사용하고 다른 모든 단계에는 페놀 함유 배지를 사용하십시오. 밀도 구배 및 해리 매체의 인터페이스는 색상 차이에 따라 쉽게 식별 할 수 있습니다.
  6. 스핀은 휴식 없이 4°C에서 5분 동안 470 x g 에서 또 다른 4% w/v BSA 쿠션을 통해 밴드를 수집했습니다.
  7. 정제된 운동 뉴런을 B27 보충제(2%), 글루타민(0.25%), 2-메르캅토에탄올(0.1%), 말 혈청(2%), 페니실린-스트렙토마이신으로 완전한 신경기저 배지에 재현탁시킨다.
  8. 100 μg/mL의 폴리라이신과 3 μg/mL의 라미닌 코팅 커버슬립에 50,000 세포/35 mm 유리 바닥 접시의 밀도로 뉴런을 플레이트합니다.

3. 뉴런 트랜스펙션

참고: 이 단계는 GCaMP 칼슘 이미징 및/또는 시냅스 평가 전에 관심 있는 외인성 DNA 플라스미드 또는 RNA가 도입되는 뉴런을 겪을 뉴런에 대해 수행됩니다. 대조적으로, 스티릴 염료는 이미징 세션 직전에 로딩되고 섹션 6에서 다루어진다. 아래의 요약은 제시된 예에서 일차 설치류 뉴런에 사용되는 형질감염 프로토콜이지만, 사용자의 요구에 쉽게 적응하고 최적화할 수 있다.

  1. 배양된 일차 피질 뉴런에 대한 형질감염은 시험관내 12일째(DIV 12)에 발생하는 반면, 운동 뉴런은 시험관내 7일째 에 형질감염된다(DIV 7).
    참고: 다음 단계는 모두 무균 생물 안전 캐비닛 내에서 발생합니다.
  2. 500 ng의 GCaMP6m을 1:2 부피의 비율로 형질감염 시약을 사용하여 형질감염시킨다. 공동 형질감염의 경우, 총 1.25μg의 총 DNA/접시를 첨가하여 이 DNA와 시약 비율을 유지하십시오.
    참고: 도시된 실험예에서, 관심있는 ALS/FTD 관련 플라스미드 750ng이 C9orf72-ALS 연결된 디펩타이드, 돌연변이 FUS 단백질 등을 발현하도록 형질감염되었다. 공동-형질감염된 플라스미드의 형광 태그가 GCaMP 영상화의 FITC 채널과 충돌하지 않는지 확인하십시오. 마찬가지로, 스티릴 염료 이미징을 수행하는 경우, 공동-트랜스펙션된 플라스미드가 영상화의 TRITC 채널과 충돌하지 않도록 보장한다. 시냅토피신-GCaMP3의 사용은 이 프로토콜에서도 똑같이 효과적이다. 따라서, 동일한 양의 플라스미드를 형질감염시키고 섹션 7에서 평소와 같이 모든 단계를 따르십시오.
  3. DNA-형질감염 시약 복합체를 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
  4. 소용돌이 치면서 뉴런에 배양 된 복합체를 부드럽게 적가하십시오. 접시를 37°C의 CO2 인큐베이터로 45-60분 동안 반납하십시오.
  5. DNA-형질감염 시약 복합체를 함유하는 전체 배양 배지를 제거하고, 이를 사전 컨디셔닝된 신선한 뉴런 배지의 50-50 부피 제제로 교체한다. 그런 다음 이미징 될 때까지 세포를 CO2 인큐베이터에 48 시간 동안 다시 넣으십시오.

4. 완충용액 및 스티릴염료 원액의 제조

  1. 표 1에 열거된 성분을 사용하여 이미징하기 전에 낮고 높은 aCSF 용액을 신선하게 만드십시오. 사용하기 전에 두 버퍼 솔루션을 모두 필터링하십시오.
    참고: CaCl2 이수화물은 저장 시 Ca(OH)2를 형성할 수 있습니다. 최대한의 효능을 얻으려면 항상 최근에 열린 컨테이너를 사용하십시오. 이것이 가능하지 않은 경우, 외부 표면에서 Ca(OH)2를 제거하고 최대 용해도를 보장하기 위해, 용액은 CaCl2 첨가 전에 5분 동안 기체 CO2로 탄산될 수 있다. 이 단계를 수행하면 과도한 탄산화로 인해 Ca(HCO3)2가 형성되므로 생성 용액의 pH를 7.4의 pH 값을 유지하도록 조정하십시오.
낮은 KCL aCSF 완충액 (pH 7.40 내지 7.45)
시약농도
헤페스10 밀리지미터
나클140 밀리지미터
증권 시세 표시기5 밀리지미터
포도당10 밀리지미터
CaCl2 2H2O2 밀리지미터
MgCl2 4H2O1 밀리지미터
높은 KCL aCSF 완충액 (pH 7.40 내지 7.45)
시약농도
헤페스10 밀리지미터
나클95 밀리가바이트
증권 시세 표시기50 밀리지미터
포도당10 밀리지미터
CaCl2 2H2O2 밀리지미터
MgCl2 4H2O1 밀리지미터

표 1: 인공 뇌척수액(aCSF) 완충액의 조성. 이 표에는 뉴런을 이미징하고 자극하는 동안 사용되는 저용량 및 고 KCl 인공 뇌척수액 버퍼를 준비하기위한 성분이 포함되어 있습니다. 준비 지침은 섹션 4를 참조하십시오.

  1. 스티릴 염료 원액을 준비하여 염료 100 μg 바이알을 취하여 증류수 또는 뉴로베이스 배지로 10 mM의 스톡 농도로 재구성하십시오.

5. 현미경 및 관류 시스템 설정

참고: 유리 바닥 페트리 접시를 이미징하는 경우, 관류의 유연성과 높은 수치 조리개 오일 침지 목표의 사용으로 인해 거꾸로 된 공초점 형광 현미경이 선호됩니다. 공초점 현미경, 카메라 및 주요 결과 섹션에 자세히 설명된 예제의 이미징에 사용되는 목적에 대한 재료 표를 참조하십시오.

  1. 인큐베이터 시스템 결합 스테이지 마운트를 사용하여 일정한 5% CO2 수준으로 37°C에서 모든 실험을 수행합니다.
  2. 공초점 소프트웨어를 사용하여 이미지 수집을 제어합니다. 이미징 세션이 시작될 때 수집 설정을 최적화하여 여기 파워와 게인을 선택하여 광표백 없이 신호를 최적으로 시각화할 수 있습니다.
    1. 여기력, 노출 시간, 검출기 게인 및 프레임 속도를 모든 샘플에서 일정하게 유지하십시오. 염료 표백을 최소화하기 위해 512 x 512의 종횡비와 2 이미지/s의 프레임 속도를 사용하여 타임랩스 이미징을 수행합니다.
      참고: 누점은 명확하게 볼 수 있어야 하지만, 표백 및 광독성을 피하기 위해 레이저 강도를 가능한 최소한으로 설정해야 합니다. 공초점 조리개를 가장 좁은 설정으로 설정하여 신경돌기 내의 형광 누자의 최적 분해능을 달성하십시오. 노출 시간은 200ms 이하로 설정되며, 샘플 간에 일관됩니다. 사용된 카메라의 최대 이미징 속도는 2 이미지/초였습니다. 더 빠른 카메라를 사용하면 더 많은 이미지를 찍을 수 있습니다. 가능한 경우 임시 이미징 설정을 선택해야 합니다.
  3. 공초점 소프트웨어를 사용한 이미징을 위한 형광 여기/이색성/방출 필터 조합을 선택합니다: Gcamp6m/Gcamp3(FITC가 있는 Gcamp6m/Gcamp3 및 TRITC가 있는 스티릴 염료).
  4. 타임랩스 이미징 중에 공초점 이미징 수집 소프트웨어의 완벽한 초점 기능을 사용하여 z-드리프트를 피하십시오.
    참고: 빠른 이미징 속도로 인해 단일 평면이 이미지화됩니다. 실험 중에 z-드리프트의 부족을 보장하는 것은 매우 중요합니다.
  5. 이미지 수집 패널에서 시간 탭을 선택하여 녹화 기간과 간격을 설정합니다.
    1. 단계 #1을 간격 500ms, 지속 시간 3 - 5분으로 설정합니다.
    2. 단계 #2를 간격 500ms, 지속 시간 5분으로 설정합니다.
      참고: 단계 #1은 기준선 기록에 해당하고, 단계 #2는 자극 기간에 각각 대응한다.
  6. 밸브 제어 시스템과 채널 매니폴드를 사용하는 aCSF용 중력 관류 장치를 조립한다.
    1. 높은 KCl( 표 1 참조)을 장치 상단의 50 mL 주사기에 넣고 튜브가 시스템을 통해 실행되도록 합니다. 유속을 1 mL/분으로 설정합니다.
  7. 공초점 이미징 단계에 뉴런이 들어있는 35mm 유리 접시를로드하고 관류 튜브의 끝을 접시 가장자리에 놓습니다. 이미징 필드를 선택합니다.

6. 시냅스 소포 방출의 스티릴 염료 이미징

  1. 세포를 형질감염 후 37°C, 48시간 동안 낮은 KCl aCSF ( 표 1 참조)에서 인큐베이션한다.
  2. 스티릴 염료로 유리 바닥 페트리 접시에 일차 피질 또는 운동 뉴런을로드하십시오.
    1. 흡인에 의해 낮은 KCl aCSF를 제거하십시오.
    2. 피펫을 사용하여 5분 동안 50 mM KCl을 함유하는 aCSF에 10 μM의 스티릴 염료로 어둠 속에서 뉴런을 로딩한다.
    3. 로딩 용액을 제거하고 10분 동안 낮은 KCl aCSF에서 뉴런을 목욕시켜 비특이적 염료 로딩을 제거한다.
  3. 35mm 유리 바닥 접시를 이미징 스테이지에 놓은 다음 거꾸로 된 공초점 현미경의 20x 공기 목표 또는 40x 오일 침지 목표 아래에서 관찰하십시오.
    참고: GFP 형광을 사용하여 GFP 태깅된 플라스미드로 공동 형질감염된 세포의 경우 형질감염된 세포를 찾습니다.
  4. 546 nm 레이저를 사용하여 스티릴 염료를 여기시키고, 630-730 nm (TRITC) 대역 통과 필터를 사용하여 방출을 수집한다.
  5. 이미징 분야를 선택하고 완벽한 초점을 맞춥니다. 다음으로, 브라이트필드, TRITC 및 형광 마커 채널이 있는 단일 스틸 이미지를 촬영하여 뉴런 경계를 표시합니다.
  6. 획득 소프트웨어에서 지금 실행 을 시작합니다. 3-5 분 동안 기본 기록을 수행하여 염료 강도의 변화를 배제하십시오 (단계 # 1).
    참고 : 염료 강도의 감소가 시냅스 소포 방출로 인한 것이며 수동 염료 확산이나 광표백이 아닌지 확인하는 것이 중요합니다. 이러한 3-5분 사전-자극 기간은 꾸준하고 유지된 염료 강도 수준을 초래한다. 이 기록의 최종 30초는 각 ROI에 대한 평균 기준선 형광 값을 결정하는 데 사용됩니다. 실험 조건을 평가하기 전에, 의도된 획득 설정을 사용하여 약 10분의 연속 기록의 추가적인 비자극 조건이 또한 장기간 동안 레이저 세팅을 사용하여 꾸준한 형광 값을 보장하기 위해 수행될 수 있다.
  7. 단계 #2로 전환할 때, 관류 시스템의 버튼 에서 트리거합니다. 그런 다음 50 mM KCl을 뉴런에 지속적으로 관류하여 염료 언로딩을 용이하게합니다 (단계 #2).
    1. KCl 추가 후 300초 동안 녹음을 수행합니다. 그 후에 인수가 중지됩니다. 관류 시스템의 꺼짐 스위치를 트리거합니다.
  8. 아래 섹션 8에 설명된 대로 공초점 소프트웨어를 사용하여 실험을 저장하고 데이터를 분석합니다.
    참고: 이 시점에서 실험을 중지할 수 있으며 나중에 분석을 수행할 수 있습니다. 세포가 관심있는 단백질의 발현을 위해 형질감염을 필요로 하지 않는 경우에, 이러한 프로토콜은 시냅스 언로딩의 기능성을 조사하고자 할 때 시험관내 임의의 시점에서 수행될 수 있다. 적절한 시냅스 언로딩을 보장하기 위해 대조군 세포를 시험한 후, 실험자는 편향을 최소화하기 위해 시험된 각 접시의 유전적 또는 약리학적 조건에 눈을 멀게 해야 한다.

7. Gcamp6m 칼슘 과도 상태의 형광 이미징

  1. 섹션 3에 표시된 대로 Gcamp6m의 500 ng을 가진 35mm 유리 바닥 접시에서 배양된 일차 설치류 피질 뉴런을 형질감염시킨다.
    참고: 원하는 경우, 적색 또는 원-적색 범위의 형광 태그를 함유하는 관심있는 플라스미드로 뉴런을 공동-형질감염시킨다.
  2. 형질감염 후 15분 동안 낮은 KCl aCSF로 뉴런을 인큐베이션한 다음 이미징 플랫폼에 접시를 장착합니다.
  3. FITC 필터 (488nm)와 20x 또는 40x 목표를 사용하여 GCaMP6m 형광을 시각화하십시오.
  4. 이미징 분야를 선택하고 완벽한 초점을 맞춥니다. 다음으로, 브라이트필드, FITC 및 형광 마커 채널이 있는 단일 스틸 이미지를 촬영하여 뉴런 경계를 표시합니다.
  5. 획득 소프트웨어에서 지금 실행 을 시작합니다. 5분 동안 기준선 기록을 수행하고, 이어서 스티릴 염료 실험을 위해 섹션 6에 기재된 것과 동일한 방식으로 50 mM KCL을 함유하는 aCSF로 관류한다.
    참고: 이 영상의 목표는 유발된 칼슘 과도 상태를 측정하는 것입니다. 뉴런이 사전 자극 기간 동안 기저 발사 활성과 칼슘 플럭스를 갖는 경우, 데이터 분석에 사용되지 않습니다. 대신, 안정한 배경 형광을 갖는 세포만이 사용된다. 자극 후 기간은 또한 칼슘 과도 상태에 대해, 추가적인 연속 높은 KCl 관류의 유무에 관계없이 60분까지 연장될 수 있다.
  6. 아래 섹션 8에 설명된 대로 공초점 소프트웨어를 사용하여 실험을 저장하고 데이터를 분석합니다. 이 시점에서 실험을 중지할 수 있으며 나중에 분석을 수행할 수 있습니다.
    참고: 세포가 관심있는 단백질의 발현을 위해 형질감염을 필요로 하지 않는 경우, 이 프로토콜은 칼슘 과도기를 검사하고자 할 때 시험관내 임의의 시점에서 수행될 수 있다. 칼슘 과도 상태의 측정을 보장하기 위해 대조군 세포를 테스트 한 후, 실험자는 편향을 최소화하기 위해 테스트 된 각 접시의 유전 적 또는 약리학 적 조건에 눈이 멀어야합니다.

8. 이미지 분석

  1. 공초점 소프트웨어로 타임랩스 이미지를 엽니다.
  2. 명령 시리즈에 의해 타임랩스 시리즈에서 이미지 정렬 : 이미지 | 처리 | 현재 문서를 정렬합니다. 첫 번째 프레임에 정렬을 선택합니다.
  3. 이미지 프레임 오른쪽에 있는 빈 모양의 아이콘인 ROI 선택 도구를 사용하여 신경돌기를 따라 관심 영역(ROI)을 선택합니다(그림 3B). 또한 배경 형광 강도를 나타내는 ROI를 표시하십시오.
    참고: ROI는 밝은 필드 정지 이미지로 표시된 뉴런 트랙을 따라 뚜렷하게 분리된 누점 영역을 선택하여 선택합니다. 분석을 위해 뉴런 당 적어도 다섯 개의 ROI가 선택됩니다. 배경 ROI는 신경돌기를 포함하지 않는 시야의 영역에서 선택됩니다.
  4. 다음 명령 시리즈를 사용하여 선택한 ROI에 대해 시간에 따른 원시 형광 측정: | 측정 시간 측정.
    1. 시간 측정 패널의 위쪽 부분에서 측정 기능을 시작합니다. 시간에 따른 원시 형광의 그래픽 표현(그림 3C)과 정량적 데이터가 모두 생성됩니다.
      참고: 각 데이터 포인트는 특정 측정 시점과 연관된 프레임에 대한 ROI에 대한 원시 형광을 나타냅니다.
  5. 원시 형광 강도를 스프레드시트 소프트웨어로 내보냅니다.
  6. 각 ROI를 독립적으로 분석합니다. 먼저 각 시점의 관심 강도의 ROI에서 배경 ROI 강도를 빼서 데이터를 정규화합니다.
    1. 각 특정 시점의 배경 ROI에서 원시 형광 값을 가져와 해당 시점의 관심 있는 원시 강도 값의 ROI에서 뺍니다.
      참고: 이것은 전체 기록 기간, 기저 및 자극 단계 모두에 대해 수행됩니다.
  7. 기준선의 마지막 30초에 대한 관심 강도의 평균 ROI를 결정합니다.
    1. 단계 8.6에서 생성된 정규화된 미가공 기저 값을 3-5분 기저 기록 기간의 최종 30초로부터 평균화한다.
      참고: 기본 기록의 전체 기간을 사용하여 이 값을 생성할 수 있습니다. 그러나, 이 값이 안정화되고 유지됨에 따라, 최종 30초의 60-시간 포인트들은 전체를 나타내기에 충분한 샘플링 크기를 갖는다.
  8. 이 기준선 값을 각 시점에서의 정규화된 강도 값과 비교하여, 형광(ΔF) 값의 변화를 생성한다.
    1. 단계 8.7에서 값을 취하여 평균 기준선 형광 값을 뺍니다. 전체 기록 기간 동안이 단계와 후속 단계, 기본 및 자극 단계 모두를 수행하십시오.
  9. 기준선 형광 값에 관한이 변화를 계산하여 형광 / 기준선 형광 (ΔF / F)의 변화를 생성합니다. 이렇게하려면 8.8 단계의 값을 가져 와서 평균 기준선 형광 값으로 나눕니다.
  10. 마지막으로, 시간이 지남에 따라 증가 또는 감소를 그래픽으로 쉽게 시각화할 수 있도록 시작점 값을 1로 설정합니다.
    1. 8.9단계에서 생성된 값을 가져와 1을 추가합니다.
      참고: 이 작업을 올바르게 수행하면 기준 기간 값의 30초가 값 1 근처에 마우스를 가져와야 합니다. 시냅스 함량을 효과적으로 방출하는 세포에서, 이 값은 자극의 개시 후에 1에서 0으로 추세되어야 한다. 단계 6-9의 예가 도 3E에 제시되어 있다.

9. 데이터 분석

참고: 실험자는 분석을 위해 데이터를 적절하게 풀링하기 위해 실험 조건에 눈이 멀지 않을 수 있습니다. 세 가지 독립적 인 실험 각각에서 조건 당 적어도 10 뉴런의 샘플 크기를 사용하십시오. 적어도 다섯 개의 ROI 영역을 지정할 수 있는 경우에만 뉴런을 포함시킬 것을 고려하십시오. 이러한 수준의 실험적 복제는 GFP 대조군 대 ALS 관련 폴리GA 함유 세포에서 시냅스 언로딩의 심오한 손실을 입증하기에 충분한 발표된 연구에서 충분했다( 대표적인 결과 참조). 그러나, 보다 미묘한 표현형이 관찰되는 경우, 생물학적 및/또는 기술적 반복실험의 수는 사용자에 의한 최적화를 필요로 할 수 있다.

  1. 주어진 실험 조건의 ROI로부터 시간에 따라 계산된 모든 ΔF/F 값을 사용하여 SEM과 함께 각 시점의 평균 ΔF/F 값을 결정하십시오.
  2. xy 형식의 그래프 및 통계 소프트웨어 프로그램을 사용하여 데이터를 플로팅합니다. 여기서 x는 경과 시간이고 y는 9.1단계에서 계산된 ΔF/F 값입니다. 모든 값을 평균 ± SEM으로 제시하십시오.
  3. 통계적 유의성을 결정하려면 스튜던트 t-검정을 사용하여 두 그룹을 비교하고 분산의 단방향 분석(ANOVA)을 수행한 다음 세 개 이상의 그룹을 비교하기 위한 Tukey의 사후 분석을 사용합니다.

결과

상기 프로토콜의 성공적인 구현에 이어서, 전형적인 스티릴 염료 시냅스 베시클 방출 실험에 대한 대표적인 결과가 제시된다. 배양된 래트 일차 피질 뉴런은 섹션 6에 기재된 방법을 사용하여 염료를 로딩하였다. 염료 로딩의 특이성은 시냅스 소포 마커 시냅토피신과의 공동 표지에 의해 결정되었다. 스티릴 염료 양성 펑타의 대다수는 이 마커에 대해 공동-양성이다(도 2A). ?...

토론

설명 된 두 가지 방법에 공통적 인 세 단계는 실험 성공과 정량화 가능한 결과에 매우 중요합니다. 첫째, 각 실험 라운드 전에 신선한 aCSF를 준비하는 것이 첨부 된 지침에 따라 필수적입니다. 그렇게하지 않으면 적절한 신경 세포 탈분극을 예방할 수 있습니다. 처리되지 않은 대조군 뉴런의 샘플은 적절한 세포 탈분극을 보장하고 해당 이미징 세션에서 얻은 긍정적 인 결과에 대한 벤치 마크를 제?...

공개

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 말

우리는 Jefferson Weinberg ALS Center의 현재 및 이전 회원들이 이러한 기술과 분석을 최적화하기위한 중요한 피드백과 제안을 인정하고자합니다. 이 연구는 NIH (RF1-AG057882-01 및 R21-NS0103118에서 D.T), NINDS (R56-NS092572 및 R01-NS109150에서 P.P), 근육 이영양증 협회 (D.T.), ALS 연구를위한 로버트 패커드 센터 (D.T.), 가족 스트롱 4 ALS 재단 및 파버 가족 재단 (B.K.J., K.K 및 P.P)의 기금으로 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
20x air objectiveNikonFor imaging
40x oil immersion objectiveNikonFor imaging
B27 supplementThermo Scientific17504044Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mLThermo Scientific13-689-8Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hoodBakerSterilGARD III SG403AAsceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-MercaptoethanolMillipore SigmaM3148For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9418For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrateMillipore Sigma223506Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubatorThermo Scientific13-998-123For culturing and maintenance of neurons
CentrifugeEppendorf5810RFor neuronal culture preparation
Confocal microscopeNikonEclipse Ti +A1R coreFor fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD cameraPhotometricsFor image acquisition
D-GlucoseMillipore SigmaG8270Component of aCSF solutions
DNaseMillipore SigmaD5025For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley ratsCharles river400SASSDFor preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cubeNikon77032509For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dyeInvitrogenT13320For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)CellVisD35-10-1.5-NFor growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipetteGrainger52NK56For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Millipore SigmaH6648For preparing neuronal cultures
HEPESMillipore SigmaH3375Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
horse serumMillipore SigmaH1138For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hoodNUAIRENU-301-630For preparing neuronal cultures
LamininThermo Scientific23017015For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 MediumThermo Scientific11415064For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol redThermo Scientific21083027For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM)Thermo Scientific25030149Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Scientific11668019For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
Magnesium chlorideMillipore Sigma208337Component of aCSF solutions
Microsoft ExcelMicrosoftSoftware for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PESThermo Scientific565-0020Filter unit for aCSF solution
Neurobasal mediumThermo Scientific21103049For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced ResearchNikonSoftware for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubesThermo Scientific339650For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubesThermo Scientific339652For preparing neuronal culture and buffer solutions
OptiprepMillipore SigmaD1556For preparing neuronal cultures
PapainMillipore SigmaP4762For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Scientific15140122To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion systemWarner InstrumentsSF-77BFor exchange of aCSF
Perfusion tubingCole-ParmerUX-30526-14Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmidAddgene40754For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromideMillipore SigmaP7886Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chlorideMillipore SigmaP3911Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonateMillipore SigmaS5761Component of aCSF solutions
Sodium ChlorideMillipore SigmaS9888Component of aCSF solutions
Stage Top IncubatorTokai HitFor incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cubeNikon77032809For imaging FM4-64
Trypsin InhibitorMillipore SigmaT6414For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Scientific25200056For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation tableNew PortVIP320X2430-135520Table/stand for microscope

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