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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Zusammenfassung

Vor der neuronalen Degeneration ist die Ursache für motorische und kognitive Defizite bei Patienten mit amyotropher Lateralsklerose (ALS) und/oder Frontotemporallappendemenz (FTLD) eine Dysfunktion der Kommunikation zwischen Neuronen und Motoneuronen und Muskeln. Der zugrunde liegende Prozess der synaptischen Übertragung beinhaltet die membrandepolarisationsabhängige synaptische Vesikelfusion und die Freisetzung von Neurotransmittern in die Synapse. Dieser Prozess geschieht durch lokalisierten Kalziumeinstrom in die präsynaptischen Terminals, in denen sich synaptische Vesikel befinden. Hier beschreibt das Protokoll fluoreszenzbasierte Live-Imaging-Methoden, die zuverlässig depolarisationsvermittelte synaptische Vesikelexozytose und präsynaptische terminale Kalziumeinflussdynamik in kultivierten Neuronen melden.

Mit einem Styrylfarbstoff, der in synaptische Vesikelmembranen eingearbeitet wird, wird die synaptische Vesikelfreisetzung aufgeklärt. Auf der anderen Seite, um den Eintritt von Kalzium zu untersuchen, wird Gcamp6m verwendet, ein genetisch kodierter fluoreszierender Reporter. Wir verwenden eine hohe Kaliumchlorid-vermittelte Depolarisation, um die neuronale Aktivität nachzuahmen. Um die synaptische Vesikelexozytose eindeutig zu quantifizieren, messen wir den Verlust der normalisierten Styrylfarbstofffluoreszenz als Funktion der Zeit. Unter ähnlichen Stimulationsbedingungen, im Falle eines Kalziumeinflusses, nimmt die Gcamp6m-Fluoreszenz zu. Die Normalisierung und Quantifizierung dieser Fluoreszenzänderung erfolgt ähnlich wie das Styrylfarbstoffprotokoll. Diese Methoden können mit transfektionsbasierter Überexpression fluoreszenzmarkierter mutierter Proteine gemultiplext werden. Diese Protokolle wurden ausgiebig verwendet, um synaptische Dysfunktion in Modellen von FUS-ALS und C9ORF72-ALS unter Verwendung von primären kortikalen und motorischen Neuronen von Nagetieren zu untersuchen. Diese Protokolle ermöglichen ein schnelles Screening von Verbindungen, die die neuronale Kommunikation verbessern können. Daher sind diese Methoden nicht nur für das Studium von ALS, sondern für alle Bereiche der neurodegenerativen und entwicklungsneurowissenschaftlichen Forschung wertvoll.

Einleitung

Die Modellierung der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) im Labor ist aufgrund der überwiegend sporadischen Natur von über 80 % der Fälle1 in Verbindung mit der großen Anzahl genetischer Mutationen, von denen bekannt ist, dass sie krankheitserregend sind2, eine einzigartige Herausforderung2. Trotzdem haben alle Fälle von ALS das verbindende Merkmal gemeinsam, dass es vor der vollständigen neuronalen Degeneration zu einer dysfunktionalen Kommunikation zwischen präsynaptischen Motoneuronen und postsynaptischen Muskelzellen kommt3,4. Klinisch, wenn Patienten die Konnektivität der verbleibenden oberen und unteren Motoneuronen verlieren, weisen sie während der gesamten Krankheit Merkmale der neuronalen Hyper- und Hypoerregbarkeit auf5,6,7,8,9, die komplexe zugrunde liegende molekulare Veränderungen dieser Synapsen widerspiegeln, die wir als ALS-Forscher zu verstehen versuchen.

Mehrere transgene Modelle haben gezeigt, dass Verschlechterung und Desorganisation der neuromuskulären Verbindung mit der Expression von ALS-verursachenden genetischen Mutationen auftreten, einschließlich SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 und TDP4317,18,19 durch morphologische Bewertungen, einschließlich der Bewertung von synaptischen Boutons, Wirbelsäulendichten und prä- / postsynaptischer Organisation. Mechanistisch war es seit den bahnbrechenden Arbeiten von Cole, Hodgkin und Huxley in den 1930er Jahren auch möglich, synaptische Reaktionen durch elektrophysiologische Techniken entweder in vitro-Zellkultur oder in Gewebeschnittpräparaten zu bewerten20. Durch diese Strategien haben viele ALS-Modelle synaptische Übertragungsdefizite gezeigt. Zum Beispiel verursacht eine mutierte Variante von TDP43 eine erhöhte Feuerfrequenz und verringert die Aktionspotentialschwelle in NSC-34 (Rückenmark x Neuroblastom Hybridzelllinie 34) motorisch-neuronenähnlichen Zellen21. Dieselbe Variante verursacht auch eine dysfunktionale synaptische Übertragung an der neuromuskulären Verbindung (NMJ) vor dem Auftreten von verhaltensbedingten motorischen Defiziten in einem Mausmodell22. Es wurde zuvor gezeigt, dass die mutierte FUS-Expression in einem Drosophila-Modell von FUS-ALS vor lokomotorischen Defekten zu einer reduzierten synaptischen Übertragung am NMJ führt11. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht unter Verwendung induzierter pluripotenter Stammzellen, die aus C9orf72-Expansionsträgern gewonnen wurden, zeigte eine Verringerung des leicht freisetzbaren Pools synaptischer Vesikel23. Insgesamt unterstreichen diese und andere Studien, wie wichtig es ist, ein umfassenderes Verständnis der Mechanismen aufzubauen, die der synaptischen Signalübertragung in krankheitsrelevanten Modellen der ALS zugrunde liegen. Dies wird entscheidend sein, um die Pathobiologie von ALS zu verstehen und potenzielle therapeutische Ziele für Patienten zu entwickeln.

Methoden der Strom- und Spannungsspannzellen waren von unschätzbarem Wert bei der Bestimmung von Membraneigenschaften wie Leitwert, Ruhemembranpotential und Quantengehalt einzelner Synapsen20,24. Eine der wesentlichen Einschränkungen der Elektrophysiologie besteht jedoch darin, dass sie technisch anspruchsvoll ist und nur Erkenntnisse von einem einzelnen Neuron gleichzeitig liefert. Die konfokale Lebendzellmikroskopie, gekoppelt mit spezifischen fluoreszierenden Sonden, bietet die Möglichkeit, die synaptische Übertragung von Neuronen räumlich-zeitlich zu untersuchen25,26,27. Obwohl dieser Fluoreszenzansatz kein direktes Maß für die neuronale Erregbarkeit ist, kann er eine relative Messung von zwei molekularen Korrelationen der synaptischen Funktion liefern: synaptische Vesikelfreisetzung und Calciumtransienten an synaptischen Terminals.

Wenn ein Aktionspotential die präsynaptische terminale Region von Neuronen erreicht, werden Calciumtransienten ausgelöst, was den Übergang von einem elektrischen Signal zum Prozess der Neurotransmitterfreisetzung erleichtert28. Spannungsgesteuerte Kalziumkanäle, die in diesen Bereichen lokalisiert sind, regulieren die Kalziumsignalisierung streng, um die Kinetik der Neurotransmitterfreisetzung zu modulieren29. Die ersten berichteten fluoreszenzbasierten Aufzeichnungen von Calciumtransienten wurden entweder mit dem Zweiwellenlängenindikator Fura-2 AM oder dem Einzelwellenlängenfarbstoff Fluo-3 AM30,31,32 durchgeführt. Während diese Farbstoffe zu dieser Zeit großartige neue Erkenntnisse boten, leiden sie unter mehreren Einschränkungen wie unspezifischer Kompartimentierung innerhalb von Zellen, aktivem oder passivem Farbstoffverlust aus markierten Zellen, Photobleichen und Toxizität, wenn sie über längere Zeiträume abgebildet werden33. In den letzten zehn Jahren sind genetisch kodierte Kalziumindikatoren zu den Arbeitspferden für die Abbildung verschiedener Formen neuronaler Aktivität geworden. Diese Indikatoren kombinieren ein modifiziertes fluoreszierendes Protein mit einem Calciumchelatorprotein, das nach der Bindung von Ca2+-Ionen schnell die Fluoreszenzintensität wechselt34. Die Anwendung dieser neuen Indikatoren ist enorm und ermöglicht eine viel einfachere Visualisierung intrazellulärer Calciumtransienten sowohl in vitro- als auch in vivo-Umgebungen. Eine Familie dieser genetisch kodierten Reporter, bekannt als GCaMP, wird jetzt breit genutzt. Diese Indikatoren enthalten eine C-terminale Calmodulindomäne, gefolgt von grün fluoreszierendem Protein (GFP), und sind durch eine N-terminale Calmodulin-Bindungsregion begrenzt35,36. Die Calciumbindung an die Calmodulindomäne löst eine Wechselwirkung mit der Calmodulin-bindenden Region aus, was zu einer Konformationsänderung der gesamten Proteinstruktur und einer erheblichen Erhöhung der Fluoreszenz der GFP-Einheit führt35,36. Im Laufe der Jahre hat diese Reporterfamilie mehrere Entwicklungen durchlaufen, um unterschiedliche Auslesungen für bestimmte Kalziumtransienten mit spezifischer Kinetik (langsam, mittel und schnell) mit jeweils leicht unterschiedlichen Eigenschaften zu ermöglichen37,38. Hier wurde die Verwendung des Reporters GcaMP6 hervorgehoben, von dem zuvor gezeigt wurde, dass er einzelne Aktionspotentiale und dendritische Calciumtransienten in Neuronen sowohl in vivo als auch in vitro nachweist37.

Calciumtransienten in der präsynaptischen Region lösen synaptische Vesikelfusionsereignisse aus, die eine Freisetzung von Neurotransmittern in die Synapse und die Initiierung von Signalereignissen in der postsynaptischen Zelle verursachen28,39. Synaptische Vesikel werden sowohl schnell freigesetzt als auch recycelt, da die Zelle homöostatisch eine stabile Zellmembranoberfläche und einen leicht lösbaren Pool fusionsfähiger membrangebundener Vesikel beibehält40. Der hier verwendete Styrylfarbstoff hat eine Affinität zu Lipidmembranen und verändert seine Emissionseigenschaften spezifisch anhand der Ordnung der umgebenden Lipidumgebung41,42. Somit ist es ein ideales Werkzeug für die Markierung von synaptischen Recyclingvesikeln und die anschließende Verfolgung dieser Vesikel, da sie später nach neuronaler Stimulation freigesetzt werden41,42. Das Protokoll, das generiert und optimiert wurde, ist eine Adaption der ursprünglich von Gaffield und Kollegen beschriebenen Konzepte, die es uns ermöglicht, styrylfarbstoffmarkierte synaptische Vesikelpunkta im Laufe der Zeit kontinuierlich zu visualisieren41.

Hier werden zwei verwandte fluoreszenzbasierte Methoden beschrieben, die zuverlässig über spezifische zelluläre Ereignisse berichten, die an der synaptischen Übertragung beteiligt sind. Protokolle wurden definiert, um die Dynamik des depolarisationsvermittelten präsynaptischen terminalen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelexozytose in kultivierten Neuronen zu untersuchen. Hier konzentrieren sich Methoden und repräsentative Ergebnisse auf die Verwendung primärer kortikaler oder motorischer Neuronen von Nagetieren als In-vitro-Modellsystem, da es veröffentlichte Studien mit diesen Zelltypen gibt43,44. Diese Methoden sind jedoch auch auf differenzierte humane i3-kortikal-ähnliche Neuronen anwendbar45, da wir auch mit beiden Protokollen in derzeit laufenden Experimenten in unserem Labor erfolgreich waren. Das allgemeine Protokoll ist in einem schrittweisen linearen Format dargestellt (siehe Abbildung 1). Kurz gesagt, um die Kalziumdynamik in Neuriten zu untersuchen, werden reife Neuronen mit Plasmid-DNA transfiziert, um den fluoreszierenden Reporter GCaMP6m unter einem Cytomegalovirus (CMV) -Promotor zu exprimieren37,46. Transfizierte Zellen haben eine geringe basale grüne Fluoreszenz, die in Gegenwart von Kalzium zunimmt. Interessante Regionen werden angegeben, um Fluoreszenzänderungen während unserer Manipulation zu überwachen. Damit lassen sich stark räumlich und zeitlich begrenzte Schwankungen des Calciums messen37,46. Zur Beurteilung der synaptischen Vesikelfusion und -freisetzung werden reife Neuronen mit Styrylfarbstoff beladen, der in synaptische Vesikelmembranen eingebaut wird, während sie in präsynaptischen Zellen recycelt, reformiert und mit Neurotransmittern wieder geladen werden41,42,43,47,48. Die aktuellen Farbstoffe, die zu diesem Zweck verwendet werden, markieren synaptische Vesikel entlang von Neuriten und werden als Proxy für diese Regionen in Live-Imaging-Experimenten verwendet, wie die gemeinsame Färbung von Styrylfarbstoff und Synaptotagmin durch Kraszewski und Kollegen gezeigt wurde49. Hier sind repräsentative Bilder ähnlicher Färbungen enthalten, die ebenfalls durchgeführt wurden (Abbildung 2A). Frühere Forscher haben solche Farbstoffe ausgiebig verwendet, um die Dynamik synaptischer Vesikel an der neuromuskulären Verbindung und den Hippocampus-Neuronen zu melden48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Durch die Auswahl punktueller Regionen von farbstoffbeladenen Vesikeln und durch die Überwachung der Abnahme der Fluoreszenzintensität nach der Vesikelfreisetzung können die funktionelle synaptische Übertragungskapazität und die zeitliche Dynamik der Freisetzung nach Stimulation untersucht werden43. Für beide Methoden wird ein Medium verwendet, das eine hohe Konzentration an Kaliumchlorid enthält, um Zellen zu depolarisieren, um neuronale Aktivität nachzuahmen. Bildgebungsparameter werden angegeben, um Intervalle von unter einer Sekunde zu erfassen, die sich über eine Basisnormalisierung erstrecken, gefolgt von unserer Stimulationserfassungsperiode. Fluoreszenzmessungen zu jedem Zeitpunkt werden bestimmt, auf den Hintergrund normalisiert und über den experimentellen Zeitraum quantifiziert. Calcium-Influx-vermittelte GCaMP6m-Fluoreszenzerhöhung oder effektive synaptische Vesikel-Exozytose-Styryl-Farbstofffreisetzungsfluoreszenzabnahme kann durch diese Strategie nachgewiesen werden. Detaillierter methodischer Aufbau und Parameter für diese beiden Protokolle und eine Diskussion über ihre Vorteile und Grenzen werden im Folgenden beschrieben.

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Abbildung 1: Visuelles Rendering des allgemeinen Protokollprozesses. (1) Isolieren und kultivieren Sie primäre Nagetierneuronen in vitro zum gewählten Reifungszeitpunkt. (2) Einführung von GCaMP-DNA oder Styrylfarbstoff als Reporter der synaptischen Aktivität. (3) Richten Sie das Bildgebungsparadigma mit einem mit Live-Imaging ausgestatteten Konfokalmikroskop und der zugehörigen Software ein. Beginnen Sie mit dem Baseline-Aufzeichnungszeitraum. (4) Während Zellen noch live aufgenommen werden, stimulieren sie Neuronen durch hohe KCl-Badperfusion. (5) Bewertung von Fluoreszenzintensitätsmessungen im Laufe der Zeit, um Calciumtransienten oder synaptische Vesikelfusion zu messen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Protokoll

Alle in dieser Studie durchgeführten Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Jefferson University genehmigt.

1. Primärkultur von Neuronen aus dem embryonalen Rattenkortex

HINWEIS: Primäre kortikale Neuronen werden aus E17.5-Rattenembryonen isoliert, wie zuvor beschrieben57,58. Mit dem Erfolg dieses Kultivierungsprotokolls scheint es keine Dehnungsverzerrung zu geben. Diese Methode wird im Folgenden kurz beschrieben. Die zuvor angegebenen Artikel sollten für vollständige Details referenziert werden.

  1. Euthanasieren Sie trächtige weibliche Ratten durch CO2-Inhalation , gefolgt von einer sekundären Bestätigung durch Zervixdislokation.
  2. Ernten Sie Embryonen und isolieren Sie Gehirne in eiskalter 20 mM HEPES-gepufferter Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Von der äußeren Kortexhülle trennen und dann Striatum und Hippocampi verwerfen. Sammeln Sie Kortexe.
  3. Verwenden Sie feine Pinzetten, um Hirnhäute von Kortexen zu entfernen. Halten Sie dazu den Kortex mit einem Paar geschlossener Pinzetten unter sanftem Druck an Ort und Stelle.
    HINWEIS: Mit dem zweiten Paar Pinzetten in der zweiten Hand, kneifen Sie Meninges. Schälen Sie Hirnhäute mit rollender Bewegung mit eingeklemmtem Paar ab. Mit der geschlossenen Pinzette neu positionieren und bei Bedarf wiederholen, bis Meninges vollständig entfernt ist.
  4. Inkubieren Sie Kortexe mit 10 μg/ml Papain in HBSS für 4 min bei 37 °C.
  5. Dreimal in HBSS waschen und dann 5-10 Mal vorsichtig mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette aus Glas ritutieren, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten.
    HINWEIS: Vermeiden Sie Blasen; Halten Sie die Pipette innerhalb der Zellsuspension aufrecht.
  6. Plattenneuronen auf 100 μg/ml Poly-D-Lysin-beschichteten 35-mm-Glasbodenschalen mit einer Dichte von 75.000 Zellen/Schale in neurobasalem Medium mit B27-Präparat (2%) und Penicillin-Streptomycin.

2. Primärkultur von Motoneuronen aus embryonalem Rattenrückenmark

HINWEIS: Primäre Motoneuronen werden aus E13.5-Rattenembryonen wie zuvor beschrieben mit wenigen Modifikationen hergestellt59,60. Mit dem Erfolg dieses Kultivierungsprotokolls scheint es keine Dehnungsverzerrung zu geben. Diese Methode wird im Folgenden kurz beschrieben. Die oben genannten Artikel sollten für vollständige Details referenziert werden.

  1. Trächtige weibliche Ratten wie in Schritt 1.1 einschläfern.
  2. Sezieren Sie 10-20 Rückenmark von Embryonen und brechen Sie mechanisch in kleine Fragmente ein, indem Sie zwei Pinzettenpaare verwenden, um sie zu kneifen bzw. zu ziehen.
  3. Inkubation in 0,025% Trypsin für 8 min, gefolgt von Zugabe von DNase bei 1 mg / ml.
  4. Zentrifieren Sie durch ein 4% w/v BSA-Kissen bei 470 x g für 5 min bei 4 °C ohne Pause.
  5. Zentrifugenpelletierte Zellen für 55 min bei 830 x g bei 4 °C ohne Bremse durch ein 10,4% (v/v) Dichtegradientenmedium (siehe Materialtabelle) Kissen. Übertragen Sie das Motoneuronband an der visuellen Schnittstelle weiter.
    HINWEIS: Um die Erfassung aller Zellen sicherzustellen, verwenden Sie phenolfreie Medien für den Dichtegradientenschritt und phenolhaltige Medien für alle anderen Schritte. Die Grenzfläche des Dichtegradienten- und Dissoziationsmediums ist anhand der Farbdifferenz leicht zu identifizieren.
  6. Drehen Sie gesammelte Bänder durch ein weiteres 4% w / v BSA-Kissen bei 470 x g für 5 min bei 4 ° C ohne Pause.
  7. Resuspendieren Sie gereinigte Motoneuronen in vollständigem neurobasalem Medium mit B27-Ergänzung (2%), Glutamin (0,25%), 2-Mercaptoethanol (0,1%), Pferdeserum (2%) und Penicillin-Streptomycin.
  8. Plattenneuronen auf 100 μg/ml Polylysin und 3 μg/ml lamininbeschichteten Deckgläsern bei einer Dichte von 50.000 Zellen/35 mm Glasbodenschale.

3. Neuronale Transfektionen

HINWEIS: Dieser Schritt wird für Neuronen durchgeführt, die eine GCaMP-Kalziumbildgebung durchlaufen und/oder für Neuronen, in die vor der synaptischen Auswertung ein exogenes DNA-Plasmid oder eine interessante RNA eingeführt wird. Im Gegensatz dazu wird Styrylfarbstoff kurz vor der Bildgebungssitzung geladen und in Abschnitt 6 behandelt. Die folgende Zusammenfassung ist das Transfektionsprotokoll, das in den vorgestellten Beispielen für primäre Nagetierneuronen verwendet wird, aber es kann leicht an die Bedürfnisse des Benutzers angepasst und optimiert werden.

  1. Transfektionen für kultivierte primäre kortikale Neuronen treten am Tag 12 in vitro auf (DIV 12), während Motoneuronen am Tag 7 in vitro transfiziert werden (DIV 7).
    HINWEIS: Alle folgenden Schritte finden in einer aseptischen Biosicherheitskabine statt.
  2. Transfect 500 ng GCaMP6m unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes in einem Volumenverhältnis von 1:2. Für Co-Transfektionen fügen Sie insgesamt 1,25 μg Gesamt-DNA / -Schale hinzu, wobei dieses Verhältnis von DNA zu Reagenz beibehalten wird.
    HINWEIS: In den gezeigten experimentellen Beispielen wurden 750 ng ALS/FTD-bezogenes Plasmid von Interesse transfiziert, um C9orf72-ALS-verknüpfte Dipeptide, mutiertes FUS-Protein usw. zu exprimieren. Stellen Sie sicher, dass der fluoreszierende Tag des co-transfizierten Plasmids nicht mit dem FITC-Kanal der GCaMP-Bildgebung in Konflikt gerät. Stellen Sie bei der Styrylfarbstoffbildgebung sicher, dass das co-transfizierte Plasmid nicht mit dem TRITC-Bildgebungskanal in Konflikt gerät. Die Verwendung von Synaptophysin-GCaMP3 ist in diesem Protokoll ebenso effektiv. Transfizieren Sie daher die gleiche Menge dieses Plasmids und befolgen Sie alle Schritte wie in Abschnitt 7 üblich.
  3. Inkubieren Sie den DNA-Transfektionsreagenzienkomplex bei Raumtemperatur für 10 min.
  4. Fügen Sie den inkubierten Komplex vorsichtig zu Neuronen tropfenweise mit Wirbeln hinzu. Die Schale für 45-60 min bei 37 °C in den CO2-Inkubator zurückgeben.
  5. Entfernen Sie das gesamte Kulturmedium, das den DNA-Transfektionsreagenz-Komplex enthält, und ersetzen Sie es durch eine 50-50 x Volumen-Präparation von vorkonditionierten und frischen neuronalen Medien. Legen Sie dann die Zellen für 48 Stunden bis zur Bildgebung wieder in den CO2-Inkubator.

4. Herstellung von Pufferlösungen und Styrylfarbstoff-Stammlösung

  1. Machen Sie Lösungen mit niedrigem und hohem aCSF-Gehalt vor der Bildgebung mit den in Tabelle 1 aufgeführten Inhaltsstoffen frisch. Filtern Sie beide Pufferlösungen vor der Verwendung.
    HINWEIS: CaCl2-Dihydrat kann bei der Lagerung Ca (OH) 2 bilden. Für maximale Wirksamkeit verwenden Sie immer einen kürzlich geöffneten Behälter. Wenn dies nicht möglich ist, können Lösungen vor der CaCl2-Zugabe 5 Minuten lang mit gasförmigem CO2 kohlensäurehaltig gemacht werden, um Ca(OH)2 von der Außenfläche zu entfernen und eine maximale Löslichkeit zu gewährleisten. Wenn dieser Schritt unternommen wird, passen Sie den pH-Wert der resultierenden Lösung an, um einen pH-Wert von 7,4 aufrechtzuerhalten, da eine übermäßige Karbonisierung zur Bildung von Ca (HCO3) 2 führt.
Niedriger KCL aCSF-Puffer (pH 7,40 bis 7,45)
ReagenzKonzentration
HEPES10 mM
NaCl140 mM
Kcl5 mM
Traubenzucker10 mM
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM
Hoher KCL aCSF-Puffer (pH 7,40 bis 7,45)
ReagenzKonzentration
HEPES10 mM
NaCl95 mM
Kcl50 mM
Traubenzucker10 mM
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM

Tabelle 1: Zusammensetzung der Puffer für künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF). Diese Tabelle enthält die Inhaltsstoffe für die Herstellung von künstlichen Zerebrospinalflüssigkeitspuffern mit niedrigem und hohem KCl-Gehalt, die bei der Bildgebung und Stimulation von Neuronen verwendet werden. Siehe Abschnitt 4 für Zubereitungsanweisungen.

  1. Bereiten Sie die Styrylfarbstoff-Stammlösung vor, indem Sie eine 100 μg große Durchstechflasche mit Farbstoff nehmen und sie mit destilliertem Wasser oder neurobasalem Medium auf eine Stammkonzentration von 10 mM rekonstituieren.

5. Einrichtung des Mikroskops und des Perfusionssystems

HINWEIS: Für die Abbildung von Petrischalen mit Glasboden wird ein inverses konfokales Fluoreszenzmikroskop aufgrund der Flexibilität der Perfusion und für die Verwendung eines Ölimmersionsobjektivs mit hoher numerischer Apertur bevorzugt. In der Materialtabelle finden Sie das konfokale Mikroskop, die Kamera und die Objektive, die für die Bildgebung von Beispielen verwendet werden, die im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse aufgeführt sind.

  1. Führen Sie alle Experimente bei 37 °C mit konstantem CO2-Gehalt von 5 % mit einer systemgekoppelten Inkubator-Bühnenhalterung durch.
  2. Steuern Sie die Bilderfassung mit konfokaler Software. Optimieren Sie die Erfassungseinstellungen zu Beginn der Bildgebungssitzung, um die Anregungsleistung und -verstärkung zu wählen und eine optimale Visualisierung der Signale ohne Photobleichen zu gewährleisten.
    1. Halten Sie die Anregungsleistung, die Belichtungszeit, die Detektorverstärkung und die Bildrate über alle Proben hinweg konstant. Führen Sie Zeitraffer-Bildgebung mit einem Seitenverhältnis von 512 x 512 und einer Bildrate von 2 Bildern / s durch, um das Ausbleichen von Farbstoffen zu minimieren.
      HINWEIS: Während Puncta deutlich sichtbar sein sollte, sollte die Laserintensität auf das Minimum eingestellt werden, um Bleichen und Phototoxizität zu vermeiden. Stellen Sie die konfokale Apertur auf die engste Einstellung ein, um eine optimale Auflösung der fluoreszierenden Puncta in Neuriten zu erreichen. Die Belichtungszeit ist auf 200 ms oder weniger eingestellt, konsistent über Proben hinweg. Die maximale Abbildungsgeschwindigkeit der verwendeten Kamera betrug 2 Bilder/s. Bei Verwendung einer schnelleren Kamera können mehr Bilder aufgenommen werden. Zeitliche Bildgebungseinstellungen sollten nach Möglichkeit gewählt werden.
  3. Wählen Sie die folgenden Kombinationen aus Fluoreszenzanregung/dichroitischem / Emissionsfilter für die Bildgebung mit konfokaler Software: Gcamp6m/Gcamp3 mit FITC bzw. Styrylfarbstoff mit TRITC.
  4. Verwenden Sie die perfekte Fokusfunktion der konfokalen Bilderfassungssoftware während der Zeitraffer-Bildgebung, um Z-Drift zu vermeiden.
    HINWEIS: Aufgrund der schnellen Bildgebungsgeschwindigkeit wird eine einzelne Ebene abgebildet. Es ist sehr wichtig, dass während des Experiments keine Z-Drift vorhanden ist.
  5. Wählen Sie im Bildaufnahmefenster die Registerkarte Zeit aus, um die Aufnahmezeiträume und -intervalle festzulegen.
    1. Stellen Sie Phase #1 auf Intervall 500 ms, Dauer 3 - 5 min.
    2. Stellen Sie Phase #2 auf Intervall 500 ms, Dauer 5 min.
      HINWEIS: Phase #1 entspricht der Baseline-Aufzeichnung, Phase #2 der Stimulationsperiode.
  6. Montieren Sie Schwerkraftperfusionsgeräte für aCSF mit einem Ventilsteuerungssystem und einem Kanalverteiler.
    1. Laden Sie hohe KCl (siehe Tabelle 1) in eine 50-ml-Spritze an der Oberseite des Geräts, wobei der Schlauch durch das System verläuft. Stellen Sie die Durchflussrate auf 1 ml/min ein.
  7. Laden Sie eine 35 mm große Glasschale mit Neuronen auf die konfokale Bildgebungsstufe, wobei das Ende des Perfusionsschlauchs am Tellerrand platziert wird. Wählen Sie das Feld für die Bildgebung aus.

6. Styryl-Farbstoff-Bildgebung der synaptischen Vesikelfreisetzung

  1. Inkubieren Sie Zellen in aCSF mit niedrigem KCl (siehe Tabelle 1) für 10 min bei 37 °C, 48 h nach der Transfektion.
  2. Laden Sie primäre kortikale oder motorische Neuronen mit Styrylfarbstoff auf Petrischalen mit Glasboden.
    1. Entfernen Sie niedrige KCl aCSF durch Aspiration.
    2. Verwenden Sie eine Pipette, um Neuronen im Dunkeln mit 10 μM Styrylfarbstoff in aCSF mit 50 mM KCl für 5 min zu laden.
    3. Entfernen Sie die Belastungslösung und die Badneuronen in niedrigem KCl aCSF für 10 Minuten, um unspezifische Farbstoffbelastungen zu vermeiden.
  3. Legen Sie die 35-mm-Glasbodenschale auf die Bildgebungsstufe und beobachten Sie dann entweder unter einem 20-fachen Luftobjektiv oder einem 40-fachen Öl-Tauchobjektiv eines invertierten konfokalen Mikroskops.
    HINWEIS: Verwenden Sie GFP-Fluoreszenz, um transfizierte Zellen im Falle von Zellen zu lokalisieren, die mit einem GFP-markierten Plasmid koinziert wurden.
  4. Erregen Sie Styrylfarbstoff mit einem 546-nm-Laser, sammeln Sie die Emission mit einem 630-730 nm (TRITC) Bandpassfilter.
  5. Wählen Sie das Bildfeld aus und konzentrieren Sie sich perfekt. Nehmen Sie als Nächstes ein einzelnes Standbild mit Hellfeld-, TRITC- und Fluoreszenzmarkerkanälen auf, um neuronale Grenzen zu markieren.
  6. Initiieren Sie Run Now in der Erfassungssoftware. Führen Sie die Basalaufzeichnung für 3-5 Minuten durch, um gegebenenfalls Schwankungen der Farbstoffintensität auszuschließen (Phase #1).
    HINWEIS: Es ist wichtig sicherzustellen, dass jede Abnahme der Farbstoffintensität auf die Freisetzung synaptischer Vesikel und nicht auf passive Farbstoffdiffusion oder Photobleiche zurückzuführen ist. Diese 3-5-minütige Phase vor der Stimulation sollte zu einer konstanten und konstanten Farbintensität führen. Die letzten 30 s dieser Aufzeichnung werden verwendet, um einen mittleren Basisfluoreszenzwert für jeden ROI zu bestimmen. Vor der Bewertung der Versuchsbedingungen kann auch ein zusätzlicher Nichtstimulationszustand von ca. 10 min kontinuierlicher Aufzeichnung unter Verwendung der beabsichtigten Erfassungseinstellungen durchgeführt werden, um konstante Fluoreszenzwerte unter Verwendung der Lasereinstellungen für einen längeren Zeitraum sicherzustellen.
  7. Lösen Sie am Schalter zu Phase #2 die Taste für das Perfusionssystem aus. Perfundiert dann ständig 50 mM KCl zu Neuronen, um das Entladen von Farbstoffen zu erleichtern (Phase #2).
    1. Führen Sie Aufnahmen für 300 s nach KCl-Addition durch. Danach hört die Akquisition auf; Lösen Sie den Ausschalter für das Perfusionssystem aus.
  8. Speichern Sie das Experiment und analysieren Sie die Daten mit konfokaler Software, wie in Abschnitt 8 unten beschrieben.
    HINWEIS: Das Experiment kann an dieser Stelle gestoppt werden, und die Analyse kann später durchgeführt werden. Für den Fall, dass Zellen keine Transfektion für die Expression von Proteinen von Interesse benötigen, kann dieses Protokoll zu jedem Zeitpunkt in vitro durchgeführt werden, wenn die Funktionalität der synaptischen Entladung untersucht werden soll. Nach einem Test der Kontrollzellen, um eine ordnungsgemäße synaptische Entladung sicherzustellen, sollte der Experimentator für die genetischen oder pharmakologischen Bedingungen jeder getesteten Schale blind gemacht werden, um die Verzerrung zu minimieren.

7. Fluoreszenzbildgebung von Gcamp6m Calciumtransienten

  1. Transfekte kortikale Nagetierneuronen, die auf 35 mm Glasbodenschalen mit 500 ng Gcamp6m kultiviert sind, wie in Abschnitt 3 angegeben.
    HINWEIS: Falls gewünscht, transfizieren Sie Neuronen mit einem Plasmid von Interesse, das ein fluoreszierendes Tag im roten oder fernroten Bereich enthält.
  2. Inkubieren Sie Neuronen mit niedrigem KCl aCSF für 15 min 48 h nach der Transfektion und montieren Sie dann die Schüssel auf der Bildgebungsplattform.
  3. Visualisieren Sie die GCaMP6m-Fluoreszenz mit einem FITC-Filter (488 nm) und einem 20- oder 40-fachen Objektiv.
  4. Wählen Sie das Bildfeld aus und konzentrieren Sie sich perfekt. Als nächstes nehmen Sie ein einzelnes Standbild mit Hellfeld-, FITC- und Fluoreszenzmarkerkanälen auf, um neuronale Grenzen zu markieren.
  5. Initiieren Sie Run Now in der Erfassungssoftware. Führen Sie die Baseline-Aufzeichnung für 5 min durch und perfusionieren Sie dann mit aCSF mit 50 mM KCL in der gleichen Weise, wie in Abschnitt 6 für Styrylfarbstoffexperimente beschrieben.
    HINWEIS: Das Ziel dieser Bildgebung ist es, evozierte Kalziumtransienten zu messen. Sollte ein Neuron während der Vorstimulationsphase eine basale Feuerungsaktivität und Kalziumflüsse aufweisen, wird es nicht in der Datenanalyse verwendet. Stattdessen werden nur Zellen mit stabiler Hintergrundfluoreszenz verwendet. Die Nachstimulationsperioden können auch auf 60 Minuten für Calciumtransienten verlängert werden, mit oder ohne zusätzliche kontinuierliche Perfusion mit hohem KCl-Gehalt.
  6. Speichern Sie das Experiment und analysieren Sie die Daten mit konfokaler Software, wie in Abschnitt 8 unten beschrieben. Das Experiment kann an dieser Stelle gestoppt werden, und die Analyse kann später durchgeführt werden.
    HINWEIS: Wenn die Zellen keine Transfektion für die Expression von Proteinen von Interesse benötigen, kann dieses Protokoll zu jedem Zeitpunkt in vitro durchgeführt werden, wenn Calciumtransienten untersucht werden sollen. Nach einem Test von Kontrollzellen, um die Messung von Calciumtransienten sicherzustellen, sollte der Experimentator für die genetischen oder pharmakologischen Bedingungen jeder getesteten Schale verblindet werden, um Verzerrungen zu minimieren.

8. Bildanalyse

  1. Öffnen Sie Zeitrafferbilder mit konfokaler Software.
  2. Richten Sie Bilder in Zeitrafferserien nach der Befehlsreihe aus: Bild | Verarbeitung | Aktuelles Dokument ausrichten. Wählen Sie "Am ersten Rahmen ausrichten".
  3. Wählen Sie Regionen von Interesse (ROIs) entlang von Neuriten mithilfe des ROI-Auswahlwerkzeugs aus, einem bohnenförmigen Symbol rechts neben dem Bildrahmen (Abbildung 3B). Markieren Sie auch einen ROI, der die Hintergrundfluoreszenzintensität darstellt.
    HINWEIS: ROIs werden ausgewählt, indem Bereiche mit deutlich getrennten Puncta entlang neuronaler Spuren ausgewählt werden, die durch das Hellfeld-Standbild angezeigt werden. Mindestens fünf ROIs pro Neuron werden für die Analyse ausgewählt. Der Hintergrund-ROI wird in einer Region des Sichtfelds gewählt, die keine Neuriten enthält.
  4. Messen Sie die Rohfluoreszenz im Zeitverlauf für ausgewählte ROIs mithilfe der folgenden Befehlsreihe: | messen Zeitmessung.
    1. Initiieren Sie die Messfunktion im oberen Bereich des Bedienfelds "Zeitmessung ". Es werden sowohl eine grafische Darstellung der Rohfluoreszenz im Zeitverlauf (Abbildung 3C) als auch quantitative Daten generiert.
      HINWEIS: Jeder Datenpunkt stellt die Rohfluoreszenz für diesen ROI für den Frame dar, der diesem bestimmten gemessenen Zeitpunkt zugeordnet ist.
  5. Exportieren Sie rohe Fluoreszenzintensitäten in die Tabellenkalkulationssoftware.
  6. Analysieren Sie jeden ROI unabhängig. Normalisieren Sie zunächst die Daten, indem Sie die ROI-Intensität im Hintergrund von der ROI der Zinsintensität zu jedem Zeitpunkt subtrahieren.
    1. Nehmen Sie den rohen Fluoreszenzwert aus dem Hintergrund-ROI zu jedem bestimmten Zeitpunkt und subtrahieren Sie ihn vom ROI-Wert der rohen Intensität zu diesem Zeitpunkt.
      HINWEIS: Dies geschieht für den gesamten Aufnahmezeitraum, sowohl für die Basal- als auch für die Stimulationsphase.
  7. Bestimmen Sie den durchschnittlichen ROI der Zinsintensität für die letzten 30 s des Ausgangswerts.
    1. Berechnen Sie den Durchschnitt der normalisierten basalen Rohwerte, die in Schritt 8.6 aus den letzten 30 s der 3-5-minütigen Basalaufzeichnungsperiode generiert wurden.
      HINWEIS: Der gesamte Zeitraum der basalen Aufzeichnung könnte verwendet werden, um diesen Wert zu generieren. Da sich dieser Wert jedoch stabilisiert und beibehalten wird, sind die 60-maligen Punkte der letzten 30 s von ausreichender Stichprobengröße, um das Ganze darzustellen.
  8. Vergleichen Sie diesen Basiswert mit dem normierten Intensitätswert zu jedem Zeitpunkt, wodurch eine Änderung des Fluoreszenzwerts (ΔF) erzeugt wird.
    1. Nehmen Sie den Wert aus Schritt 8.7 und subtrahieren Sie den durchschnittlichen Ausgangsfluoreszenzwert. Führen Sie dies und die nachfolgenden Schritte für den gesamten Aufnahmezeitraum durch, sowohl für die Basal- als auch für die Stimulationsphase.
  9. Berechnen Sie diese Änderung in Bezug auf den Basisfluoreszenzwert, wodurch eine Änderung der Fluoreszenz/Baseline-Fluoreszenz (ΔF/F) erzeugt wird. Nehmen Sie dazu den Wert aus Schritt 8.8 und dividieren Sie ihn durch den durchschnittlichen Basis-Fluoreszenzwert.
  10. Setzen Sie schließlich den Startpunktwert auf 1, damit Zu- oder Abnahmen im Laufe der Zeit leicht grafisch visualisiert werden können.
    1. Nehmen Sie den in Schritt 8.9 generierten Wert und fügen Sie 1 hinzu.
      HINWEIS: Wenn dies richtig gemacht wird, sollten die 30 s der Basisperiodenwerte in der Nähe des Wertes 1 schweben. In Zellen, die effektiv synaptischen Inhalt freisetzen, sollte dieser Wert nach Beginn der Stimulation von 1 auf 0 tendieren. Ein Beispiel für die Schritte 6 bis 9 ist in Abbildung 3E dargestellt.

9. Datenanalyse

HINWEIS: Der Experimentator kann für experimentelle Bedingungen entblindet werden, um Daten für die Analyse angemessen zu sammeln. Verwenden Sie eine Stichprobengröße von mindestens 10 Neuronen pro Bedingung aus jedem der drei unabhängigen Experimente. Betrachten Sie Neuronen nur dann für die Aufnahme, wenn mindestens fünf ROI-Regionen ausgewiesen werden können. Dieses Niveau der experimentellen Replikation war in veröffentlichten Studien ausreichend, um einen tiefgreifenden Verlust der synaptischen Entladung in ALS-assoziierten poly-GA-haltigen Zellen im Vergleich zu GFP-Kontrollen nachzuweisen (siehe Repräsentative Ergebnisse). Wenn jedoch ein subtilerer Phänotyp beobachtet wird, kann die Anzahl der biologischen und/oder technischen Replikate eine Optimierung durch den Benutzer erfordern.

  1. Bestimmen Sie unter Verwendung aller berechneten ΔF/F-Werte im Zeitverlauf aus den ROIs einer gegebenen experimentellen Bedingung einen mittleren ΔF/F-Wert für jeden Zeitpunkt zusammen mit einem SEM.
  2. Plotten Sie Daten mit einem Grafik- und Statistikprogramm im xy-Format, wobei x die verstrichene Zeit und y der in Schritt 9.1 berechnete ΔF/F-Wert ist. Präsentieren Sie alle Werte als Mittelwert ± SEM.
  3. Um die statistische Signifikanz zu bestimmen, verwenden Sie den Student's t-Test für den Vergleich von zwei Gruppen und die Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Tukeys Post-hoc-Analyse zum Vergleich von drei oder mehr Gruppen.

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Ergebnisse

Nach der erfolgreichen Implementierung des oben genannten Protokolls werden repräsentative Ergebnisse für ein typisches Synapikelfreisetzungsexperiment mit Styrylfarbstoff gezeigt. Kultivierte kortikale Neuronen von Ratten wurden mit der in Abschnitt 6 beschriebenen Methode mit Farbstoff beladen. Die Spezifität der Farbstoffbelastung wurde durch Co-Markierung mit dem synaptischen Vesikelmarker Synaptophysin bestimmt. Ein Großteil der Styrylfarbstoff-positiven Puncta ist für diesen Marker co-positiv (

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Diskussion

Drei Schritte, die beiden beschriebenen Methoden gemeinsam sind, sind von entscheidender Bedeutung für den experimentellen Erfolg und quantifizierbare Ergebnisse. Erstens ist die Vorbereitung von frischem aCSF vor jeder Experimentierrunde unter Einhaltung der beigefügten Anweisungen unerlässlich. Andernfalls kann eine angemessene neuronale Depolarisation verhindert werden. Eine Probe unbehandelter Kontrollneuronen sollte vor der Stimulation von Versuchsgruppen ständig getestet werden, um eine ordnungsgemäße zellul?...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Wir danken den anwesenden und ehemaligen Mitgliedern des Jefferson Weinberg ALS Center für kritisches Feedback und Anregungen zur Optimierung dieser Techniken und deren Analysen. Diese Arbeit wurde durch Mittel des NIH (RF1-AG057882-01 und R21-NS0103118 bis D.T.), der NINDS (R56-NS092572 und R01-NS109150 bis P.P.), der Muscular Dystrophy Association (D.T.), des Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), der Family Strong 4 ALS Foundation und der Farber Family Foundation (B.K.J., K.K, und P.P.) unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
20x air objectiveNikonFor imaging
40x oil immersion objectiveNikonFor imaging
B27 supplementThermo Scientific17504044Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mLThermo Scientific13-689-8Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hoodBakerSterilGARD III SG403AAsceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-MercaptoethanolMillipore SigmaM3148For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9418For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrateMillipore Sigma223506Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubatorThermo Scientific13-998-123For culturing and maintenance of neurons
CentrifugeEppendorf5810RFor neuronal culture preparation
Confocal microscopeNikonEclipse Ti +A1R coreFor fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD cameraPhotometricsFor image acquisition
D-GlucoseMillipore SigmaG8270Component of aCSF solutions
DNaseMillipore SigmaD5025For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley ratsCharles river400SASSDFor preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cubeNikon77032509For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dyeInvitrogenT13320For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)CellVisD35-10-1.5-NFor growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipetteGrainger52NK56For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Millipore SigmaH6648For preparing neuronal cultures
HEPESMillipore SigmaH3375Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
horse serumMillipore SigmaH1138For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hoodNUAIRENU-301-630For preparing neuronal cultures
LamininThermo Scientific23017015For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 MediumThermo Scientific11415064For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol redThermo Scientific21083027For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM)Thermo Scientific25030149Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Scientific11668019For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
Magnesium chlorideMillipore Sigma208337Component of aCSF solutions
Microsoft ExcelMicrosoftSoftware for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PESThermo Scientific565-0020Filter unit for aCSF solution
Neurobasal mediumThermo Scientific21103049For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced ResearchNikonSoftware for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubesThermo Scientific339650For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubesThermo Scientific339652For preparing neuronal culture and buffer solutions
OptiprepMillipore SigmaD1556For preparing neuronal cultures
PapainMillipore SigmaP4762For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Scientific15140122To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion systemWarner InstrumentsSF-77BFor exchange of aCSF
Perfusion tubingCole-ParmerUX-30526-14Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmidAddgene40754For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromideMillipore SigmaP7886Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chlorideMillipore SigmaP3911Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonateMillipore SigmaS5761Component of aCSF solutions
Sodium ChlorideMillipore SigmaS9888Component of aCSF solutions
Stage Top IncubatorTokai HitFor incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cubeNikon77032809For imaging FM4-64
Trypsin InhibitorMillipore SigmaT6414For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Scientific25200056For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation tableNew PortVIP320X2430-135520Table/stand for microscope

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