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Resumen

Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

Resumen

Antes de la degeneración neuronal, la causa de los déficits motores y cognitivos en pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y /o demencia del lóbulo frontotemporal (FTLD) es la disfunción de la comunicación entre las neuronas y las neuronas motoras y musculares. El proceso subyacente de la transmisión sináptica implica la fusión de vesículas sinápticas dependiente de la despolarización de la membrana y la liberación de neurotransmisores en la sinapsis. Este proceso ocurre a través de la afluencia localizada de calcio en los terminales presinápticos donde residen las vesículas sinápticas. Aquí, el protocolo describe metodologías de imágenes en vivo basadas en fluorescencia que informan de manera confiable la exocitosis de vesícula sináptica mediada por despolarización y la dinámica de afluencia de calcio terminal presináptica en neuronas cultivadas.

Usando un tinte de estirilo que se incorpora a las membranas de las vesículas sinápticas, se dilucida la liberación de vesículas sinápticas. Por otro lado, para estudiar la entrada de calcio, se utiliza Gcamp6m, un reportero fluorescente codificado genéticamente. Empleamos una alta despolarización mediada por cloruro de potasio para imitar la actividad neuronal. Para cuantificar la exocitosis de vesículas sinápticas sin ambigüedades, medimos la pérdida de fluorescencia normalizada del colorante de estirilo en función del tiempo. En condiciones de estimulación similares, en el caso de la afluencia de calcio, la fluorescencia de Gcamp6m aumenta. La normalización y cuantificación de este cambio de fluorescencia se realizan de manera similar al protocolo de colorante de estiril. Estos métodos se pueden multiplexar con la sobreexpresión basada en la transfección de proteínas mutantes marcadas fluorescentemente. Estos protocolos se han utilizado ampliamente para estudiar la disfunción sináptica en modelos de FUS-ALS y C9ORF72-ALS, utilizando neuronas corticales y motoras primarias de roedores. Estos protocolos permiten fácilmente la detección rápida de compuestos que pueden mejorar la comunicación neuronal. Como tal, estos métodos son valiosos no solo para el estudio de la ELA, sino para todas las áreas de la investigación neurodegenerativa y de la neurociencia del desarrollo.

Introducción

El modelado de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en el laboratorio se hace excepcionalmente desafiante debido a la naturaleza abrumadoramente esporádica de más del 80% de los casos1, junto con la gran cantidad de mutaciones genéticas que se sabe que son causantes de la enfermedad2. A pesar de esto, todos los casos de ELA comparten la característica unificadora de que antes de la degeneración neuronal absoluta, existe una comunicación disfuncional entre las neuronas motoras presinápticas y las células musculares postsinápticas3,4. Clínicamente, a medida que los pacientes pierden la conectividad de las neuronas motoras superiores e inferiores restantes, se presentan con características de hiper e hipoexcitabilidad neuronal a lo largo de la enfermedad5,6,7,8,9, lo que refleja complejos cambios moleculares subyacentes a estas sinapsis, que nosotros, como investigadores de ELA, buscamos comprender.

Múltiples modelos transgénicos han ilustrado que el deterioro y la desorganización de la unión neuromuscular ocurren con la expresión de mutaciones genéticas causantes de ELA, incluyendo SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 y TDP4317,18,19 a través de evaluaciones morfológicas, incluida la evaluación de boutones sinápticos, densidades de la columna vertebral y organización pre / postsináptica. Mecánicamente, desde los documentos históricos de Cole, Hodgkin y Huxley en la década de 1930, también ha sido posible evaluar las respuestas sinápticas a través de técnicas electrofisiológicas en cultivo celular in vitro o preparaciones de rebanadas de tejidos20. A través de estas estrategias, muchos modelos de ELA han demostrado déficits de transmisión sináptica. Por ejemplo, una variante mutante de TDP43 provoca una mayor frecuencia de disparo y disminuye el umbral de potencial de acción en células motoras-neuronales similares a las neuronas NSC-34 (línea celular híbrida de médula espinal x neuroblastoma 34)21. Esta misma variante también causa transmisión sináptica disfuncional en la unión neuromuscular (NMJ) antes de la aparición de déficits motores conductuales en un modelo de ratón22. Anteriormente se demostró que la expresión mutante de FUS resulta en una reducción de la transmisión sináptica en el NMJ en un modelo de drosophila de FUS-ALS antes de defectos locomotores11. Un informe reciente utilizando células madre pluripotentes inducidas derivadas de portadores de expansión C9orf72 reveló una reducción en el grupo fácilmente liberable de vesículas sinápticas23. En conjunto, estos estudios y otros destacan la importancia de construir una comprensión más completa de los mecanismos subyacentes a la señalización sináptica en modelos de ELA relevantes para la enfermedad. Esto será fundamental para comprender la patobiología de la ELA y desarrollar posibles objetivos terapéuticos para los pacientes.

Los métodos de sujeción de corriente y voltaje de las células han sido invaluables para determinar las propiedades de la membrana, como la conductancia, el potencial de membrana en reposo y el contenido cuantal de las sinapsis individuales20,24. Sin embargo, una de las limitaciones significativas de la electrofisiología es que es técnicamente desafiante y solo proporciona información de una sola neurona a la vez. La microscopía confocal de células vivas, junto con sondas fluorescentes específicas, ofrece la oportunidad de investigar la transmisión sináptica de neuronas de manera espaciotemporal25,26,27. Aunque no es una medida directa de la excitabilidad neuronal, este enfoque de fluorescencia puede proporcionar una medición relativa de dos correlaciones moleculares de la función sináptica: la liberación de vesículas sinápticas y los transitorios de calcio en los terminales sinápticos.

Cuando un potencial de acción alcanza la región terminal presináptica de las neuronas, se desencadenan transitorios de calcio, facilitando la transición de una señal eléctrica al proceso de liberación de neurotransmisores28. Los canales de calcio dependientes de voltaje localizados en estas áreas regulan estrechamente la señalización de calcio para modular la cinética de la liberación de neurotransmisores29. Los primeros registros basados en fluorescencia reportados de transitorios de calcio se realizaron utilizando el indicador de longitud de onda dual Fura-2 AM o el tinte de longitud de onda única Fluo-3 AM30,31,32. Si bien estos colorantes ofrecieron una gran visión nueva en ese momento, sufren de varias limitaciones, como la compartimentación inespecífica dentro de las células, la pérdida activa o pasiva de colorantes de las células marcadas, el fotoblanqueo y la toxicidad si se toman imágenes durante largos períodos de tiempo33. En la última década, los indicadores de calcio codificados genéticamente se han convertido en los caballos de batalla para obtener imágenes de diversas formas de actividad neuronal. Estos indicadores combinan una proteína fluorescente modificada con una proteína quelante de calcio que cambia rápidamente la intensidad de la fluorescencia después de la unión de iones Ca2+34. La aplicación de estos nuevos indicadores es amplia, lo que permite una visualización mucho más fácil de los transitorios de calcio intracelulares tanto en entornos in vitro como in vivo. Una familia de estos reporteros codificados genéticamente, conocida como GCaMP, ahora se utiliza ampliamente. Estos indicadores contienen un dominio de calmodulina C-terminal, seguido de proteína fluorescente verde (GFP), y están limitados por una región de unión a calmodulina N-terminal35,36. La unión del calcio al dominio de la calmodulina desencadena una interacción con la región de unión a la calmodulina, lo que resulta en un cambio conformacional en la estructura general de la proteína y un aumento sustancial en la fluorescencia de la fracción GFP35,36. A lo largo de los años, esta familia de reporteros ha experimentado varias evoluciones para permitir lecturas distintas para transitorios de calcio particulares con cinética específica (lenta, media y rápida), cada uno con propiedades ligeramente diferentes37,38. Aquí, se ha destacado el uso del reportero GcaMP6, que previamente se ha demostrado que detecta potenciales de acción única y transitorios de calcio dendríticos en neuronas tanto in vivo como in vitro37.

Los transitorios de calcio en la región presináptica desencadenan eventos de fusión de vesículas sinápticas, causando la liberación de neurotransmisores en la sinapsis y el inicio de eventos de señalización en la célula postsináptica28,39. Las vesículas sinápticas se liberan y reciclan rápidamente, ya que la célula mantiene homeostáticamente un área de superficie de membrana celular estable y un grupo fácilmente liberable de vesículas unidas a la membrana con capacidad de fusión40. El colorante de estirilo utilizado aquí tiene una afinidad hacia las membranas lipídicas y cambia específicamente sus propiedades de emisión en función del orden del entorno lipídico circundante41,42. Por lo tanto, es una herramienta ideal para el etiquetado de vesículas sinápticas de reciclaje y el posterior seguimiento de estas vesículas a medida que se liberan posteriormente tras la estimulación neuronal41,42. El protocolo que se ha generado y optimizado es una adaptación de los conceptos descritos inicialmente por Gaffield y sus colegas, lo que nos permite visualizar la punción de vesícula sináptica marcada con colorante de estirilo a lo largo del tiempo de forma continua41.

Aquí, se describen dos metodologías relacionadas basadas en la fluorescencia, que informan de manera confiable eventos celulares específicos involucrados en la transmisión sináptica. Se han definido protocolos para sondear la dinámica de la afluencia de calcio terminal presináptico mediada por despolarización y la exocitosis de vesículas sinápticas en neuronas cultivadas. Aquí, los métodos y resultados representativos se centran en el uso de neuronas corticales o motoras primarias de roedores como sistema modelo in vitro, ya que existen estudios publicados que utilizan estos tipos de células43,44. Sin embargo, estos métodos también son aplicables a neuronas humanas i3 de tipo cortical diferenciadas45, ya que también hemos tenido éxito con ambos protocolos en la experimentación actualmente en curso en nuestro laboratorio. El protocolo general se describe en un formato lineal paso a paso, que se muestra en la Figura 1. En resumen, para estudiar la dinámica del calcio en neuritas, las neuronas maduras se transfectan con ADN plásmido para expresar el reportero fluorescente GCaMP6m bajo un promotor de citomegalovirus (CMV)37,46. Las células transfectadas tienen un bajo nivel de fluorescencia verde basal, que aumenta en presencia de calcio. Las regiones de interés se especifican para monitorear los cambios de fluorescencia a lo largo de nuestra manipulación. Esto permite medir fluctuaciones altamente localizadas espacial y temporalmente en el calcio37,46. Para evaluar la fusión y liberación de vesículas sinápticas, las neuronas maduras se cargan con colorante de estirilo incorporado en las membranas de vesículas sinápticas a medida que se reciclan, reforman y recargan con neurotransmisores en células presinápticas41,42,43,47,48. Los colorantes actuales utilizados para este propósito etiquetan vesículas sinápticas a lo largo de las neuritas y se utilizan como un proxy para estas regiones en experimentos de imágenes en vivo, como lo demostró la tinción conjunta de tinte de estirilo y sinaptotagmina por Kraszewski y sus colegas49. Aquí se incluyen imágenes representativas de tinción similar que también se han realizado (Figura 2A). Investigadores anteriores han utilizado ampliamente tales colorantes para informar la dinámica de las vesículas sinápticas en la unión neuromuscular y las neuronas del hipocampo48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Mediante la selección de regiones punteadas de vesículas cargadas con colorante y mediante el seguimiento de las disminuciones en la intensidad de fluorescencia después de la liberación de vesículas, se puede estudiar la capacidad de transmisión sináptica funcional y la dinámica temporal de liberación después de la estimulación43. Para ambos métodos, se emplea un medio que contiene una alta concentración de cloruro de potasio para despolarizar las células para imitar la actividad neuronal. Los parámetros de imagen se especifican para capturar intervalos de menos de un segundo que abarcan una normalización basal seguida de nuestro período de captura de estimulación. Las mediciones de fluorescencia en cada punto de tiempo se determinan, normalizan en segundo plano y cuantifican durante el período de tiempo experimental. El aumento de la fluorescencia GCaMP6m mediado por la afluencia de calcio o la disminución efectiva de la exocitosis de la exocitosis de la exocitosis del colorante estirílico se pueden detectar a través de esta estrategia. A continuación se describen la configuración metodológica detallada y los parámetros para estos dos protocolos y una discusión sobre sus ventajas y limitaciones.

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Figura 1: Representación visual del proceso general del protocolo general. (1) Aislar y cultivar neuronas primarias de roedores in vitro hasta el punto de tiempo de maduración elegido. (2) Introducir ADN GCaMP o colorante de estirilo como reporteros de la actividad sináptica. (3) Configurar el paradigma de imágenes utilizando un microscopio confocal equipado con imágenes en vivo y el software asociado. Comience el período de registro de línea de base. (4) Mientras las células todavía están experimentando la captura de imágenes en vivo, estimule las neuronas a través de una perfusión de baño de KCl alto. (5) Evaluar las mediciones de la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo para medir los transitorios de calcio o la fusión de vesículas sinápticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

Todos los procedimientos en animales realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Jefferson.

1. Cultivo primario de neuronas de la corteza embrionaria de la rata

NOTA: Las neuronas corticales primarias se aíslan de embriones de rata E17.5 como se describió anteriormente57,58. No parece existir ningún sesgo de tensión con el éxito de este protocolo de cultivo. Este método se describe brevemente a continuación. Los artículos anteriores indicados deben ser referenciados para obtener detalles completos.

  1. Eutanasia a ratas hembra preñadas por inhalación de CO2 seguida de confirmación secundaria por luxación cervical.
  2. Recolecte embriones y aísle cerebros en la solución de sal equilibrada de Hank (HBSS) helada de 20 mM tamponada por HEPES. De la capa externa de la corteza, separe y luego descarte el cuerpo estriado y el hipocampo. Recoger cortezas.
  3. Use fórceps finos para eliminar las meninges de las cortezas. Para hacer esto, mantenga la corteza en su lugar con un par de fórceps cerrados usando una presión suave.
    NOTA: Con el segundo par de fórceps en la segunda mano, pellizque meninges. Pelar las meninges usando el movimiento de rodadura con el par pellizcado. Reposicionar con las pinzas cerradas y repetir según sea necesario hasta que las meninges se eliminen por completo.
  4. Incubar cortezas con 10 μg/ml de papaína en HBSS durante 4 min a 37 °C.
  5. Lavar tres veces en HBSS, y luego triturar suavemente 5-10 veces con una pipeta Pasteur de vidrio pulido al fuego para obtener una suspensión celular homogénea.
    NOTA: Evite las burbujas; mantenga la pipeta dentro de la suspensión celular.
  6. Neuronas de placa en placas de 100 μg/mL de poli-D-lisina recubiertas de 35 mm placas con fondo de vidrio a una densidad de 75.000 células/plato en medio neurobasal con suplemento de B27 (2%), y penicilina-estreptomicina.

2. Cultivo primario de neuronas motoras de médula espinal embrionaria de rata

NOTA: Las neuronas motoras primarias se preparan a partir de embriones de rata E13.5 como se describió anteriormente, con pocas modificaciones59,60. No parece existir ningún sesgo de tensión con el éxito de este protocolo de cultivo. Este método se describe brevemente a continuación. Los artículos anteriores indicados deben ser referenciados para obtener detalles completos.

  1. Sacrificar a las ratas hembra preñadas como en el paso 1.1.
  2. Diseccionar 10-20 médulas espinales de embriones y romper en pequeños fragmentos mecánicamente usando dos pares de fórceps para pellizcar y tirar, respectivamente.
  3. Incubar en tripsina al 0,025% durante 8 min, seguido de la adición de DNasa a 1 mg/ml.
  4. Centrifugar a través de un cojín BSA al 4% p/v a 470 x g durante 5 min a 4 °C sin rotura.
  5. Centrífuga de celdas granuladas durante 55 min a 830 x g a 4 °C sin freno a través de un cojín de gradiente de densidad del 10,4% (v/v) (ver Tabla de Materiales). Llevar adelante la banda de la neurona motora en la interfaz visual.
    NOTA: Para garantizar la captura de todas las células, use medios libres de fenol para el paso de gradiente de densidad y medios que contengan fenol para todos los demás pasos. La interfaz del gradiente de densidad y los medios de disociación es fácilmente identificable en función de la diferencia de color.
  6. Girar bandas recogidas a través de otro cojín BSA de 4% p/v a 470 x g durante 5 min a 4 °C sin rotura.
  7. Resuspend purificó las neuronas motoras en medio neurobasal completo con suplemento de B27 (2%), glutamina (0.25%), 2-mercaptoetanol (0.1%), suero de caballo (2%) y penicilina-estreptomicina.
  8. Neuronas de placa en 100 μg/mL de poli-lisina y 3 μg/mL de fundas recubiertas de laminina a una densidad de 50.000 células/35 mm de plato con fondo de vidrio.

3. Transfecciones neuronales

NOTA: Este paso se lleva a cabo para las neuronas que se someterán a imágenes de calcio GCaMP y / o neuronas en las que se introduce un plásmido de ADN exógeno o ARN de interés antes de la evaluación sináptica. Por el contrario, el tinte de estirilo se carga justo antes de la sesión de imagen y se aborda en la sección 6. El siguiente resumen es el protocolo de transfección utilizado para las neuronas primarias de roedores en los ejemplos presentados, pero se puede adaptar y optimizar fácilmente a las necesidades del usuario.

  1. Las transfecciones para las neuronas corticales primarias cultivadas ocurren en el día 12 in vitro (DIV 12), mientras que las neuronas motoras se transfectan en el día 7 in vitro (DIV 7).
    NOTA: Todos los pasos siguientes ocurren dentro de un gabinete de bioseguridad aséptico.
  2. Transfectar 500 ng de GCaMP6m utilizando reactivo de transfección en una proporción de 1:2 por volumen. Para las cotransfecciones, agregue un total de 1.25 μg de ADN total / plato, manteniendo esta relación ADN-reactivo.
    NOTA: En los ejemplos experimentales mostrados, 750 ng de plásmido de interés relacionado con ALS/FTD han sido transfectados para expresar dipéptidos ligados a C9orf72-ALS, proteína FUS mutante, etc. Asegúrese de que la etiqueta fluorescente del plásmido co-transfectado no entre en conflicto con el canal FITC de las imágenes GCaMP. Del mismo modo, si realiza imágenes de colorante de estirilo, asegúrese de que el plásmido co-transfectado no entre en conflicto con el canal TRITC de imágenes. El uso de sinaptofisina-GCaMP3 es igualmente efectivo en este protocolo. Por lo tanto, transfectar la misma cantidad de este plásmido y seguir todos los pasos habituales en la sección 7.
  3. Incubar el complejo de reactivos de transfección de ADN a temperatura ambiente durante 10 min.
  4. Agregue suavemente el complejo incubado a las neuronas gota a gota con remolinos. Devolver el plato a la incubadora de CO2 a 37 °C durante 45-60 min.
  5. Retire todo el medio de cultivo que contiene el complejo reactivo de transfección de ADN y reemplácelo con una preparación de 50-50 por volumen de medios neuronales preacondicionados y frescos. Luego, vuelva a colocar las células en la incubadora de CO2 durante 48 horas hasta la obtención de imágenes.

4. Preparación de soluciones tampón y solución madre de colorante de estirilo

  1. Haga que las soluciones de aCSF bajas y altas sean frescas antes de obtener imágenes utilizando los ingredientes enumerados en la Tabla 1. Filtre ambas soluciones de búfer antes de usarlas.
    NOTA: CaCl2 dihidrato puede formar Ca(OH)2 al almacenarlo. Para obtener la máxima eficacia, utilice siempre un recipiente recién abierto. Si esto no es posible, para eliminar el Ca(OH)2 de la superficie externa y garantizar la máxima solubilidad, las soluciones pueden ser carbonatadas con CO2 gaseoso durante 5 min antes de la adición de CaCl2 . Si se da este paso, ajuste el pH de la solución resultante para mantener un valor de pH de 7.4, ya que la carbonatación excesiva dará como resultado la formación de Ca(HCO3)2 .
Tampón ACSF de KCL bajo (pH 7.40 a 7.45)
ReactivoConcentración
HEPES10 mM
NaCl140 metros
Kcl5 mM
Glucosa10 mM
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM
Tampón ACSF de alto KCL (pH 7.40 a 7.45)
ReactivoConcentración
HEPES10 mM
NaCl95 metros
Kcl50 metros
Glucosa10 mM
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM

Tabla 1: Composición de tampones artificiales de líquido cefalorraquídeo (aCSF). Esta tabla incluye los ingredientes para preparar tampones de líquido cefalorraquídeo artificial de bajo y alto KCl utilizados al obtener imágenes y estimular las neuronas. Consulte la sección 4 para obtener instrucciones de preparación.

  1. Prepare la solución madre de colorante de estirilo tomando un vial de 100 μg de colorante y reconstituyéndolo a una concentración de stock de 10 mM con agua destilada o medio neurobasal.

5. Configuración del microscopio y del sistema de perfusión

NOTA: Para obtener imágenes de placas de Petri con fondo de vidrio, se prefiere un microscopio de fluorescencia confocal invertido debido a la flexibilidad de la perfusión y para el uso de un objetivo de inmersión en aceite de alta apertura numérica. Consulte la Tabla de materiales para el microscopio confocal, la cámara y los objetivos utilizados para la obtención de imágenes de ejemplos detallados en la sección Resultados representativos .

  1. Realice todos los experimentos a 37 °C con niveles constantes de CO2 del 5% utilizando un montaje de etapa acoplado al sistema de incubadora.
  2. Controle la adquisición de imágenes mediante software confocal. Optimice la configuración de adquisición al comienzo de la sesión de imágenes para elegir la potencia de excitación y la ganancia para garantizar una visualización óptima de las señales sin fotoblanqueo.
    1. Mantenga constante la potencia de excitación, el tiempo de exposición, la ganancia del detector y la velocidad de fotogramas en todas las muestras. Realice imágenes de lapso de tiempo utilizando una relación de aspecto de 512 x 512 y una velocidad de fotogramas de 2 imágenes / s para minimizar el blanqueamiento del tinte.
      NOTA: Si bien la punción debe ser claramente visible, la intensidad del láser debe ajustarse al mínimo posible para evitar el blanqueamiento y la fototoxicidad. Ajuste la apertura confocal al ajuste más estrecho para lograr una resolución óptima de los puntos fluorescentes dentro de las neuritas. El tiempo de exposición se establece en 200 ms o menos, consistente en todas las muestras. La velocidad máxima de imagen de la cámara utilizada fue de 2 imágenes/s. Si se utiliza una cámara más rápida, se pueden tomar más imágenes. Si es posible, se deben elegir los ajustes de imágenes temporales.
  3. Seleccione las siguientes combinaciones de filtros de excitación de fluorescencia/dicroico/emisión para la obtención de imágenes utilizando software confocal: Gcamp6m/Gcamp3 con FITC y tinte de estirilo con TRITC, respectivamente.
  4. Utilice la función de enfoque perfecto del software de adquisición de imágenes confocales durante la toma de imágenes de lapso de tiempo para evitar la deriva z.
    NOTA: Debido a la rápida velocidad de las imágenes, se toma una imagen de un solo plano. Asegurar la falta de z-drift durante el experimento es muy importante.
  5. Seleccione la pestaña Hora en el panel de adquisición de imágenes para establecer los períodos e intervalos de grabación.
    1. Establezca la Fase # 1 en Intervalo 500 ms, Duración 3 - 5 min.
    2. Establezca la Fase # 2 en Intervalo 500 ms, Duración 5 min.
      NOTA: La Fase #1 corresponde al registro basal, la Fase #2 al período de estimulación, respectivamente.
  6. Ensamble un aparato de perfusión por gravedad para aCSF utilizando un sistema de control de válvulas y un colector de canales.
    1. Cargue KCl alto (ver Tabla 1) en una jeringa de 50 ml en la parte superior del aparato, con tubos que atraviesan el sistema. Ajuste el caudal a 1 ml/min.
  7. Cargue una placa de vidrio de 35 mm que contenga neuronas en la etapa de imagen confocal, con el extremo del tubo de perfusión colocado en el borde del plato. Elija el campo para la obtención de imágenes.

6. Imágenes de colorante de estirilo de la liberación de vesículas sinápticas

  1. Incubar células en ACSF de KCl bajo (ver Tabla 1) durante 10 min a 37 °C, 48 h después de la transfección.
  2. Cargue las neuronas corticales o motoras primarias en placas de Petri con fondo de vidrio con tinte de estirilo.
    1. Eliminar el ACSF de KCl bajo por aspiración.
    2. Use una pipeta para cargar neuronas en la oscuridad con 10 μM de colorante de estirilo en aCSF que contenga 50 mM KCl durante 5 min.
    3. Retire la solución de carga y bañe las neuronas en aCSF de bajo KCl durante 10 minutos para eliminar la carga de tinte no específico.
  3. Coloque el plato con fondo de vidrio de 35 mm en el escenario de imágenes y luego observe bajo un objetivo de aire 20x o un objetivo de inmersión en aceite 40x de un microscopio confocal invertido.
    NOTA: Utilice la fluorescencia GFP para localizar células transfectadas en caso de células cotransfectadas con un plásmido marcado con GFP.
  4. Excite el tinte de estirilo con un láser de 546 nm, recoja la emisión utilizando un filtro de paso de banda de 630-730 nm (TRITC).
  5. Seleccione el campo de imagen y active el enfoque perfecto. A continuación, tome una sola imagen fija con canales de marcadores de campo brillante, TRITC y fluorescencia para marcar los límites neuronales.
  6. Inicie Ejecutar ahora en el software de adquisición. Realice el registro basal durante 3-5 min para excluir las variaciones en la intensidad del tinte, si las hubiera (Fase #1).
    NOTA: Es esencial asegurarse de que cualquier disminución en la intensidad del tinte se deba a la liberación de vesículas sinápticas y no a la difusión pasiva del tinte o al fotoblanqueo. Este período de preestimulación de 3-5 minutos debe dar como resultado un nivel de intensidad de tinte constante y mantenido. Los últimos 30 s de esta grabación se utilizarán para determinar un valor medio de fluorescencia basal para cada ROI. Antes de evaluar las condiciones experimentales, también se puede realizar una condición adicional de no estimulación de aproximadamente 10 minutos de registro continuo utilizando los ajustes de adquisición previstos para garantizar valores de fluorescencia constantes utilizando la configuración láser durante un período prolongado.
  7. En el cambio a la Fase # 2, active El botón para el sistema de perfusión. Luego, perfunda constantemente 50 mM KCl a las neuronas para facilitar la descarga del tinte (Fase # 2).
    1. Realizar grabaciones durante 300 s después de la adición de KCl. Después de esto, la adquisición se detiene; active el interruptor de apagado para el sistema de perfusión.
  8. Guarde el experimento y analice los datos utilizando el software confocal como se describe en la sección 8 a continuación.
    NOTA: El experimento puede detenerse en este punto y el análisis se puede realizar más tarde. En el caso de que las células no requieran transfección para la expresión de proteínas de interés, este protocolo podrá realizarse en cualquier momento in vitro cuando se trate de examinar la funcionalidad de la descarga sináptica. Después de una prueba de células de control para garantizar una descarga sináptica adecuada, el experimentador debe ser cegado a las condiciones genéticas o farmacológicas de cada plato probado para minimizar el sesgo.

7. Imágenes de fluorescencia de transitorios de calcio Gcamp6m

  1. Transfectar neuronas corticales primarias de roedores cultivadas en platos con fondo de vidrio de 35 mm con 500 ng de Gcamp6m como se indica en la sección 3.
    NOTA: Si lo desea, co-transfectar neuronas con un plásmido de interés que contenga una etiqueta fluorescente en el rango rojo o rojo lejano.
  2. Incubar neuronas con bajo KCl aCSF durante 15 min 48 h después de la transfección y luego montar el plato en la plataforma de imágenes.
  3. Visualice la fluorescencia GCaMP6m utilizando un filtro FITC (488 nm) y un objetivo 20x o 40x.
  4. Seleccione el campo de imagen y active el enfoque perfecto. A continuación, tome una sola imagen fija con canales de marcadores de campo brillante, FITC y fluorescencia para marcar los límites neuronales.
  5. Inicie Ejecutar ahora en el software de adquisición. Realizar el registro basal durante 5 min, y luego perfundir con aCSF que contenga 50 mM KCL de la misma manera que se describe en la sección 6 para experimentos de colorante de estirilo.
    NOTA: El objetivo de esta imagen es medir los transitorios de calcio evocados. Si una neurona tiene actividad de disparo basal y flujos de calcio durante el período de preestimulación, no se utiliza en el análisis de datos. En su lugar, solo se utilizan células con fluorescencia de fondo estable. Los períodos posteriores a la estimulación también se pueden extender a 60 minutos para los transitorios de calcio, con o sin perfusión continua adicional de alto KCl.
  6. Guarde el experimento y analice los datos utilizando el software confocal como se describe en la sección 8 a continuación. El experimento puede detenerse en este punto, y el análisis se puede realizar más tarde.
    NOTA: Si las células no requieren transfección para la expresión de proteínas de interés, este protocolo se puede realizar en cualquier punto de tiempo in vitro cuando se busca examinar transitorios de calcio. Después de una prueba de células de control para garantizar la medición de los transitorios de calcio, el experimentador debe ser cegado a las condiciones genéticas o farmacológicas de cada plato probado para minimizar el sesgo.

8. Análisis de imágenes

  1. Abra imágenes de lapso de tiempo con software confocal.
  2. Alinear imágenes en series de lapso de tiempo mediante la serie de comandos: Image | Procesamiento | Alinear documento actual. Seleccione Alinear con el primer fotograma.
  3. Seleccione regiones de interés (ROI) a lo largo de neuritas utilizando la herramienta de selección de ROI, un icono en forma de frijol a la derecha del marco de la imagen (Figura 3B). Además, marque un ROI que represente la intensidad de fluorescencia de fondo.
    NOTA: Los ROI se seleccionan eligiendo áreas de punturas claramente separadas a lo largo de las pistas neuronales indicadas por la imagen fija de campo brillante. Se eligen al menos cinco ROI por neurona para el análisis. El ROI de fondo se elige en una región del campo de visión que no contiene neuritas.
  4. Mida la fluorescencia bruta a lo largo del tiempo para los ROI seleccionados utilizando la siguiente serie de comandos: Medir | Medición del tiempo.
    1. Inicie la función Medir en la parte superior del panel Medición de tiempo . Se genera una representación gráfica de la fluorescencia bruta a lo largo del tiempo (Figura 3C) y datos cuantitativos.
      NOTA: Cada punto de datos representa la fluorescencia bruta para ese ROI para el marco asociado con ese punto de tiempo medido específico.
  5. Exporte intensidades de fluorescencia en bruto al software de hoja de cálculo.
  6. Analice cada ROI de forma independiente. Primero, normalice los datos restando la intensidad del ROI de fondo del ROI de la intensidad de interés en cada punto de tiempo.
    1. Tome el valor de fluorescencia en bruto del ROI de fondo en cada punto de tiempo específico y reste esto del valor de intensidad bruta de ROI de interés en ese punto de tiempo.
      NOTA: Esto se realiza durante todo el período de grabación, tanto en la fase basal como en la de estimulación.
  7. Determine el ROI promedio de la intensidad de interés para los últimos 30 s de línea de base.
    1. Promediar los valores basales brutos normalizados generados en el paso 8.6 de los últimos 30 s del período de registro basal de 3-5 min.
      NOTA: Todo el período de registro basal podría usarse para generar este valor. Sin embargo, a medida que este valor se estabiliza y se mantiene, los 60 puntos temporales de los últimos 30 s son de tamaño de muestreo suficiente para representar el conjunto.
  8. Compare este valor de referencia con el valor de intensidad normalizada en cada punto de tiempo, generando un cambio en el valor de fluorescencia (ΔF).
    1. Tome el valor del paso 8.7 y reste el valor fluorescente basal promedio. Realice este y los pasos posteriores durante todo el período de grabación, tanto en la fase basal como en la de estimulación.
  9. Calcular este cambio con respecto al valor de fluorescencia basal, generando un cambio en la fluorescencia/fluorescencia basal (ΔF/F). Para hacer esto, tome el valor del paso 8.8 y divídalo por el valor fluorescente basal promedio.
  10. Finalmente, establezca el valor del punto de partida en 1 para que los aumentos o disminuciones se puedan visualizar fácilmente gráficamente a lo largo del tiempo.
    1. Tome el valor generado en el paso 8.9 y agregue 1.
      NOTA: Cuando esto se hace correctamente, los 30 s de los valores del período de referencia deben flotar cerca del valor de 1. En las células que liberan efectivamente el contenido sináptico, este valor debe tender de 1 a 0 después del inicio de la estimulación. En la Figura 3E se presenta un ejemplo de los pasos 6-9.

9. Análisis de datos

NOTA: El experimentador puede no cegarse a las condiciones experimentales para agrupar los datos para su análisis de manera adecuada. Use un tamaño de muestra de al menos 10 neuronas por condición de cada uno de los tres experimentos independientes. Solo considere las neuronas para su inclusión si se pueden designar al menos cinco regiones de ROI. Este nivel de replicación experimental fue suficiente en estudios publicados para demostrar una profunda pérdida de descarga sináptica en células que contienen poli-GA relacionadas con la ELA frente a controles GFP (ver Resultados representativos). Sin embargo, si se observa un fenotipo más sutil, el número de réplicas biológicas y/o técnicas puede requerir optimización por parte del usuario.

  1. Utilizando todos los valores ΔF/F calculados a lo largo del tiempo a partir de los ROI de una condición experimental dada, determine un valor medio de ΔF/F para cada punto de tiempo junto con un SEM.
  2. Trazar datos utilizando un programa de software de gráficos y estadísticas en formato xy, donde x es el tiempo transcurrido, e y es el valor ΔF / F calculado en el paso 9.1. Presente todos los valores como media ± SEM.
  3. Para determinar la significación estadística, use la prueba t de Student para comparar dos grupos y el análisis unidireccional de varianza (ANOVA) seguido del análisis posthoc de Tukey para comparar tres o más grupos.

Resultados

Después de la implementación exitosa del protocolo anterior, se muestran resultados representativos para un experimento típico de liberación de vesículas sinápticas de colorante de estirilo. Las neuronas corticales primarias de rata cultivadas se cargaron con colorante utilizando el método descrito en la sección 6. La especificidad de la carga del colorante se determinó mediante el co-etiquetado con el marcador de vesícula sináptica sinaptofisina. La mayoría de los puntos positivos para colorante de estirilo ...

Discusión

Tres pasos comunes a ambos métodos descritos son de crucial importancia para el éxito experimental y los resultados cuantificables. En primer lugar, la preparación de aCSF fresco antes de cada ronda de experimentos es esencial, siguiendo las instrucciones adjuntas. No hacerlo puede prevenir la despolarización neuronal adecuada. Una muestra de neuronas de control no tratadas debe analizarse constantemente antes de la estimulación de cualquier grupo experimental para garantizar una despolarización celular adecuada y ...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a los miembros actuales y anteriores del Jefferson Weinberg ALS Center por sus comentarios críticos y sugerencias para optimizar estas técnicas y sus análisis. Este trabajo fue apoyado por fondos de los NIH (RF1-AG057882-01 y R21-NS0103118 a D.T.), el NINDS (R56-NS092572 y R01-NS109150 a P.P), la Asociación de Distrofia Muscular (D.T.), el Centro Robert Packard para la Investigación de la ELA (D.T.), la Fundación Family Strong 4 ALS y la Fundación de la Familia Farber (B.K.J., K.K y P.P).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
20x air objectiveNikonFor imaging
40x oil immersion objectiveNikonFor imaging
B27 supplementThermo Scientific17504044Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mLThermo Scientific13-689-8Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hoodBakerSterilGARD III SG403AAsceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-MercaptoethanolMillipore SigmaM3148For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9418For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrateMillipore Sigma223506Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubatorThermo Scientific13-998-123For culturing and maintenance of neurons
CentrifugeEppendorf5810RFor neuronal culture preparation
Confocal microscopeNikonEclipse Ti +A1R coreFor fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD cameraPhotometricsFor image acquisition
D-GlucoseMillipore SigmaG8270Component of aCSF solutions
DNaseMillipore SigmaD5025For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley ratsCharles river400SASSDFor preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cubeNikon77032509For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dyeInvitrogenT13320For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)CellVisD35-10-1.5-NFor growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipetteGrainger52NK56For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Millipore SigmaH6648For preparing neuronal cultures
HEPESMillipore SigmaH3375Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
horse serumMillipore SigmaH1138For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hoodNUAIRENU-301-630For preparing neuronal cultures
LamininThermo Scientific23017015For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 MediumThermo Scientific11415064For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol redThermo Scientific21083027For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM)Thermo Scientific25030149Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Scientific11668019For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
Magnesium chlorideMillipore Sigma208337Component of aCSF solutions
Microsoft ExcelMicrosoftSoftware for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PESThermo Scientific565-0020Filter unit for aCSF solution
Neurobasal mediumThermo Scientific21103049For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced ResearchNikonSoftware for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubesThermo Scientific339650For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubesThermo Scientific339652For preparing neuronal culture and buffer solutions
OptiprepMillipore SigmaD1556For preparing neuronal cultures
PapainMillipore SigmaP4762For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Scientific15140122To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion systemWarner InstrumentsSF-77BFor exchange of aCSF
Perfusion tubingCole-ParmerUX-30526-14Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmidAddgene40754For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromideMillipore SigmaP7886Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chlorideMillipore SigmaP3911Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonateMillipore SigmaS5761Component of aCSF solutions
Sodium ChlorideMillipore SigmaS9888Component of aCSF solutions
Stage Top IncubatorTokai HitFor incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cubeNikon77032809For imaging FM4-64
Trypsin InhibitorMillipore SigmaT6414For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Scientific25200056For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation tableNew PortVIP320X2430-135520Table/stand for microscope

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