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Résumé

Deux méthodes connexes sont décrites pour visualiser les événements subcellulaires nécessaires à la transmission synaptique. Ces protocoles permettent de surveiller en temps réel la dynamique de l’afflux de calcium présynaptique et de la fusion de la membrane des vésicules synaptiques à l’aide de l’imagerie cellulaire vivante de neurones cultivés in vitro .

Résumé

Avant la dégénérescence neuronale, la cause des déficits moteurs et cognitifs chez les patients atteints de sclérose latérale amyotrophique (SLA) et / ou de démence du lobe frontotemporal (FTLD) est un dysfonctionnement de la communication entre les neurones et les motoneurones et les muscles. Le processus sous-jacent de transmission synaptique implique la fusion des vésicules synaptiques dépendantes de la dépolarisation membranaire et la libération de neurotransmetteurs dans la synapse. Ce processus se produit par l’afflux localisé de calcium dans les terminaux présynaptiques où résident les vésicules synaptiques. Ici, le protocole décrit des méthodologies d’imagerie en direct basées sur la fluorescence qui rapportent de manière fiable l’exocytose des vésicules synaptiques médiées par la dépolarisation et la dynamique de l’afflux de calcium terminal présynaptique dans les neurones cultivés.

À l’aide d’un colorant stylique incorporé dans les membranes des vésicules synaptiques, la libération des vésicules synaptiques est élucidée. D’autre part, pour étudier l’entrée du calcium, Gcamp6m est utilisé, un rapporteur fluorescent génétiquement codé. Nous utilisons une dépolarisation à haute teneur en chlorure de potassium pour imiter l’activité neuronale. Pour quantifier sans ambiguïté l’exocytose des vésicules synaptiques, nous mesurons la perte de fluorescence normalisée du colorant styryl en fonction du temps. Dans des conditions de stimulation similaires, en cas d’afflux de calcium, la fluorescence de Gcamp6m augmente. La normalisation et la quantification de ce changement de fluorescence sont effectuées de la même manière que le protocole du colorant styryl. Ces méthodes peuvent être multiplexées avec une surexpression basée sur la transfection de protéines mutantes marquées par fluorescence. Ces protocoles ont été largement utilisés pour étudier le dysfonctionnement synaptique dans des modèles de FUS-ALS et de C9ORF72-ALS, en utilisant des corticaux et des motoneurones de rongeurs primaires. Ces protocoles permettent facilement un dépistage rapide des composés susceptibles d’améliorer la communication neuronale. En tant que telles, ces méthodes sont précieuses non seulement pour l’étude de la SLA, mais aussi pour tous les domaines de la recherche en neurosciences neurodégénératives et développementales.

Introduction

La modélisation de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) en laboratoire est rendue particulièrement difficile en raison de la nature extrêmement sporadique de plus de 80 % des cas1, associée au grand nombre de mutations génétiques connues pour être à l’origine de la maladie2. Malgré cela, tous les cas de SLA partagent la caractéristique unificatrice qu’avant la dégénérescence neuronale pure et simple, il existe une communication dysfonctionnelle entre les motoneurones présynaptiques et les cellules musculaires postsynaptiques3,4. Cliniquement, à mesure que les patients perdent la connectivité des motoneurones supérieurs et inférieurs restants, ils présentent des caractéristiques d’hyper- et d’hypoexcitabilité neuronale tout au long de la maladie5,6,7,8,9, reflétant des changements moléculaires sous-jacents complexes à ces synapses, que nous, en tant que chercheurs sur la SLA, cherchons à comprendre.

Plusieurs modèles transgéniques ont montré que la détérioration et la désorganisation de la jonction neuromusculaire se produisent avec l’expression de mutations génétiques responsables de la SLA, y compris SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 et TDP4317,18,19 par des évaluations morphologiques, y compris l’évaluation des boutons synaptiques, des densités de la colonne vertébrale et de l’organisation pré/postsynaptique. Mécaniquement, depuis les articles historiques de Cole, Hodgkin et Huxley dans les années 1930, il a également été possible d’évaluer les réponses synaptiques grâce à des techniques électrophysiologiques dans des cultures cellulaires in vitro ou des préparations de tranches de tissu20. Grâce à ces stratégies, de nombreux modèles de SLA ont démontré des déficits de transmission synaptique. Par exemple, une variante mutante de TDP43 améliore la fréquence de tir et diminue le seuil de potentiel d’action dans les cellules de type moteur-neurone NSC-34 (moelle épinière x neuroblastome hybride lignée 34)21. Cette même variante provoque également une transmission synaptique dysfonctionnelle à la jonction neuromusculaire (NMJ) avant l’apparition de déficits moteurs comportementaux chez un modèle murin22. Il a déjà été démontré que l’expression mutante de FUS entraîne une réduction de la transmission synaptique au NMJ dans un modèle de drosophile de FUS-ALS avant les défauts locomoteurs11. Un rapport récent utilisant des cellules souches pluripotentes induites dérivées de porteurs d’expansion C9orf72 a révélé une réduction du pool facilement libérable de vésicules synaptiques23. Dans l’ensemble, ces études et d’autres soulignent l’importance d’acquérir une compréhension plus complète des mécanismes sous-jacents à la signalisation synaptique dans les modèles de SLA pertinents pour la maladie. Cela sera essentiel pour comprendre la pathobiologie de la SLA et développer des cibles thérapeutiques potentielles pour les patients.

Les méthodes de serrage du courant et de la tension ont été inestimables pour déterminer les propriétés de la membrane telles que la conductance, le potentiel de la membrane au repos et le contenu quantifial des synapses individuelles20,24. Cependant, l’une des limites importantes de l’électrophysiologie est qu’elle est techniquement difficile et ne fournit des informations qu’à partir d’un seul neurone à la fois. La microscopie confocale à cellules vivantes, associée à des sondes fluorescentes spécifiques, offre la possibilité d’étudier la transmission synaptique des neurones de manière spatio-temporelle25,26,27. Bien qu’il ne s’agisse pas d’une mesure directe de l’excitabilité neuronale, cette approche de fluorescence peut fournir une mesure relative de deux corrélations moléculaires de la fonction synaptique: la libération de vésicules synaptiques et les transitoires calciques aux terminaux synaptiques.

Lorsqu’un potentiel d’action atteint la région terminale présynaptique des neurones, des transitoires calciques sont déclenchés, facilitant la transition d’un signal électrique au processus de libération de neurotransmetteurs28. Les canaux calciques voltage-dépendants localisés dans ces zones régulent étroitement la signalisation du calcium pour moduler la cinétique de libération de neurotransmetteurs29. Les premiers enregistrements basés sur la fluorescence des transitoires de calcium ont été effectués à l’aide de l’indicateur à double longueur d’onde Fura-2 AM ou du colorant à longueur d’onde unique Fluo-3 AM30,31,32. Bien que ces colorants aient offert de nouvelles perspectives à l’époque, ils souffrent de plusieurs limitations telles que le compartimentage non spécifique au sein des cellules, la perte de colorant actif ou passif des cellules marquées, le photoblanchiment et la toxicité s’ils sont imagés sur de longues périodes de temps33. Au cours de la dernière décennie, les indicateurs de calcium génétiquement codés sont devenus les chevaux de bataille pour l’imagerie de diverses formes d’activité neuronale. Ces indicateurs combinent une protéine fluorescente modifiée avec une protéine chélateur de calcium qui change rapidement d’intensité de fluorescence après la liaison des ions Ca2+34. L’application de ces nouveaux indicateurs est vaste, permettant une visualisation beaucoup plus facile des transitoires de calcium intracellulaires à la fois in vitro et in vivo. Une famille de ces rapporteurs génétiquement codés, connue sous le nom de GCaMP, est maintenant largement utilisée. Ces indicateurs contiennent un domaine de calmoduline C-terminal, suivi d’une protéine fluorescente verte (GFP), et sont coiffés d’une région de liaison à la calmoduline N-terminale35,36. La liaison du calcium au domaine de la calmoduline déclenche une interaction avec la région de liaison à la calmoduline, entraînant un changement conformationnel de la structure protéique globale et une augmentation substantielle de la fluorescence de la fraction GFP35,36. Au fil des ans, cette famille de rapporteurs a subi plusieurs évolutions pour permettre des lectures distinctes pour des transitoires de calcium particuliers avec une cinétique spécifique (lente, moyenne et rapide), chacune avec des propriétés légèrement différentes37,38. Ici, l’utilisation du rapporteur GcaMP6 a été mise en évidence, qui a déjà été montré pour détecter les potentiels d’action unique et les transitoires de calcium dendritique dans les neurones à la fois in vivo et in vitro37.

Les transitoires calciques dans la région présynaptique déclenchent des événements de fusion des vésicules synaptiques, provoquant la libération de neurotransmetteurs dans la synapse et l’initiation d’événements de signalisation dans la cellule postsynaptique28,39. Les vésicules synaptiques sont à la fois rapidement libérées et recyclées, car la cellule maintient homéostatiquement une surface de membrane cellulaire stable et un pool facilement libérable de vésicules membranaires capables de fusion40. Le colorant styryl utilisé ici a une affinité pour les membranes lipidiques et modifie spécifiquement ses propriétés d’émission en fonction de l’ordre de l’environnement lipidique environnant41,42. C’est donc un outil idéal pour marquer les vésicules synaptiques de recyclage et le suivi ultérieur de ces vésicules telles qu’elles sont libérées plus tard après une stimulation neuronale41,42. Le protocole qui a été généré et optimisé est une adaptation des concepts décrits initialement par Gaffield et ses collègues, ce qui nous permet de visualiser en continu les puncta de vésicules synaptiques marquées par un colorant styryl au fil du temps41.

Ici, deux méthodologies connexes basées sur la fluorescence sont décrites, rapportant de manière fiable des événements cellulaires spécifiques impliqués dans la transmission synaptique. Des protocoles ont été définis pour sonder la dynamique de l’afflux de calcium terminal présynaptique médié par la dépolarisation et de l’exocytose des vésicules synaptiques dans les neurones en culture. Ici, les méthodes et les résultats représentatifs sont axés sur l’utilisation de corticaux ou de motoneurones primaires de rongeurs comme système de modèle in vitro, car il existe des études publiées utilisant ces types de cellules43,44. Cependant, ces méthodes sont également applicables aux neurones corticaux i3 humains différenciés45, car nous avons également eu du succès avec les deux protocoles dans l’expérimentation actuellement en cours dans notre laboratoire. Le protocole général est décrit dans un format linéaire par étapes, illustré à la figure 1. En bref, pour étudier la dynamique du calcium dans les neurites, les neurones matures sont transfectés avec de l’ADN plasmidique pour exprimer le rapporteur fluorescent GCaMP6m sous un promoteur de cytomégalovirus (CMV)37,46. Les cellules transfectées ont un faible niveau de fluorescence vert basal, ce qui augmente en présence de calcium. Les régions d’intérêt sont spécifiées pour surveiller les changements de fluorescence tout au long de notre manipulation. Cela permet de mesurer des fluctuations de calcium très localisées dans l’espace et dans le temps37,46. Pour évaluer la fusion et la libération des vésicules synaptiques, les neurones matures sont chargés de colorant styryl incorporé dans les membranes des vésicules synaptiques au fur et à mesure qu’ils sont recyclés, reformés et rechargés en neurotransmetteurs dans les cellules présynaptiques41,42,43,47,48. Les colorants actuels utilisés à cette fin marquent les vésicules synaptiques le long des neurites et sont utilisés comme proxy pour ces régions dans des expériences d’imagerie en direct, comme l’ont montré la co-coloration du colorant styryl et de la synaptotagmine par Kraszewski et ses collègues49. Sont incluses ici des images représentatives de taches similaires qui ont également été effectuées (Figure 2A). Des chercheurs antérieurs ont largement utilisé ces colorants pour rapporter la dynamique des vésicules synaptiques à la jonction neuromusculaire et aux neurones de l’hippocampe48,49,50,51,52,53,54,55,56 . En sélectionnant les régions ponctuées des vésicules chargées de colorant et en surveillant les diminutions de l’intensité de fluorescence après la libération des vésicules, la capacité de transmission synaptique fonctionnelle et la dynamique temporelle de libération peuvent être étudiées après stimulation43. Pour les deux méthodes, un milieu contenant une forte concentration de chlorure de potassium est utilisé pour dépolariser les cellules afin d’imiter l’activité neuronale. Les paramètres d’imagerie sont spécifiés pour capturer des intervalles inférieurs à la seconde couvrant une normalisation de base suivie de notre période de capture de stimulation. Les mesures de fluorescence à chaque point temporel sont déterminées, normalisées à l’arrière-plan et quantifiées au cours de la période expérimentale. L’augmentation de la fluorescence GCaMP6m médiée par l’afflux de calcium ou la diminution efficace de l’exocytose de la vésicule synaptique par la libération de colorant styryl peut être détectée grâce à cette stratégie. La configuration méthodologique détaillée et les paramètres de ces deux protocoles ainsi qu’une discussion sur leurs avantages et leurs limites sont décrits ci-dessous.

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Figure 1 : Rendu visuel de l’ensemble du processus général du protocole. (1) Isoler et cultiver les neurones primaires des rongeurs in vitro jusqu’au point de temps de maturation choisi. (2) Introduire l’ADN GCaMP ou le colorant styryl comme rapporteurs de l’activité synaptique. (3) Configurer le paradigme de l’imagerie à l’aide d’un microscope confocal équipé d’imagerie en direct et du logiciel associé. Commencez la période d’enregistrement de référence. (4) Pendant que les cellules subissent encore une capture d’images en direct, stimulez les neurones via une perfusion de bain KCl élevée. (5) Évaluer les mesures d’intensité de fluorescence au fil du temps pour mesurer les transitoires calciques ou la fusion des vésicules synaptiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocole

Toutes les procédures animales effectuées dans le cadre de cette étude ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Jefferson.

1. Culture primaire de neurones du cortex embryonnaire du rat

REMARQUE: Les neurones corticaux primaires sont isolés à partir d’embryons de rats E17.5 comme décrit précédemment57,58. Aucun biais de souche ne semble exister avec le succès de ce protocole de culture. Cette méthode est décrite brièvement ci-dessous. Les articles précédents indiqués doivent être référencés pour plus de détails.

  1. Euthanasier les femelles gravides par inhalation de CO2 suivie d’une confirmation secondaire par luxation cervicale.
  2. Récoltez des embryons et isolez les cerveaux dans une solution saline équilibrée (HBSS) de Hank tamponnée hePES glacée de 20 mM. De la coquille externe du cortex, séparez puis jetez le striatum et l’hippocampe. Collectez les cortices.
  3. Utilisez des pinces fines pour enlever les méninges des cortex. Pour ce faire, maintenez le cortex en place avec une paire de pinces fermées en utilisant une légère pression.
    REMARQUE: Avec la deuxième paire de pinces dans la trotteuse, pincez les méninges. Pelez les méninges en utilisant un mouvement de roulement avec une paire pincée. Repositionnez avec les pinces fermées et répétez si nécessaire jusqu’à ce que les méninges soient entièrement enlevées.
  4. Incuber des cortices avec 10 μg/mL de papaïne dans hbSS pendant 4 min à 37 °C.
  5. Laver trois fois dans HBSS, puis triturer doucement 5 à 10 fois avec une pipette Pasteur en verre poli au feu pour obtenir une suspension cellulaire homogène.
    REMARQUE: Évitez les bulles; maintenir la pipette dans la suspension de la cellule.
  6. Neurones de plaque sur des boîtes de 100 μg/mL recouvertes de poly-D-lysine à fond de verre de 35 mm à une densité de 75 000 cellules/plat en milieu neurobasal avec supplément de B27 (2%) et pénicilline-streptomycine.

2. Culture primaire de motoneurones de la moelle épinière embryonnaire de rat

REMARQUE: Les motoneurones primaires sont préparés à partir d’embryons de rats E13.5 comme décrit précédemment, avec peu de modifications59,60. Aucun biais de souche ne semble exister avec le succès de ce protocole de culture. Cette méthode est décrite brièvement ci-dessous. Les articles précédents indiqués doivent être référencés pour plus de détails.

  1. Euthanasier les rates femelles gravides comme à l’étape 1.1.
  2. Disséquez 10 à 20 moelles épinières d’embryons et divisez en petits fragments mécaniquement à l’aide de deux paires de pinces pour pincer et tirer, respectivement.
  3. Incuber dans 0,025% de trypsine pendant 8 min, suivi de l’ajout de DNase à 1 mg / mL.
  4. Centrifuger à travers un coussin BSA de 4 % p/v à 470 x g pendant 5 min à 4 °C sans rupture.
  5. Centrifuger les cellules granulées pendant 55 min à 830 x g à 4 °C sans frein à travers un coussin de gradient de densité de 10,4 % (v/v) (voir Tableau des matériaux). Portez la bande de motoneurones vers l’avant à l’interface visuelle.
    REMARQUE: Pour assurer la capture de toutes les cellules, utilisez des milieux sans phénol pour l’étape de gradient de densité et des milieux contenant du phénol pour toutes les autres étapes. L’interface du gradient de densité et du support de dissociation est facilement identifiable en fonction de la différence de couleur.
  6. Faites tourner les bandes collectées à travers un autre coussin BSA de 4 % p/v à 470 x g pendant 5 min à 4 °C sans pause.
  7. Remettre en suspension les motoneurones purifiés en milieu neurobasal complet avec un supplément de B27 (2%), de la glutamine (0,25%), du 2-mercaptoéthanol (0,1%), du sérum de cheval (2%) et de la pénicilline-streptomycine.
  8. Neurones de plaque sur 100 μg/mL de poly-lysine et 3 μg/mL de couvercles recouverts de laminine à une densité de 50 000 cellules/plat à fond de verre de 35 mm.

3. Transfections neuronales

REMARQUE: Cette étape est effectuée pour les neurones qui subiront une imagerie calcique GCaMP et / ou les neurones dans lesquels un plasmide d’ADN exogène ou un ARN d’intérêt est introduit avant l’évaluation synaptique. En revanche, le colorant styryl est chargé juste avant la séance d’imagerie et est traité à la section 6. Le résumé ci-dessous est le protocole de transfection utilisé pour les neurones primaires des rongeurs dans les exemples présentés, mais il peut facilement être adapté et optimisé aux besoins de l’utilisateur.

  1. Les transfections des neurones corticaux primaires en culture se produisent au jour 12 in vitro (DIV 12), tandis que les motoneurones sont transfectés au jour 7 in vitro (DIV 7).
    REMARQUE: Toutes les étapes suivantes se produisent dans une armoire de biosécurité aseptique.
  2. Transfect 500 ng de GCaMP6m en utilisant un réactif de transfection à un rapport de 1:2 en volume. Pour les co-transfections, ajoutez un total de 1,25 μg d’ADN total / plat, en maintenant ce rapport ADN / réactif.
    NOTE: Dans les exemples expérimentaux montrés, 750 ng de plasmide d’intérêt lié à la SLA / FTD ont été transfectés pour exprimer des dipeptides liés à la SLA C9orf72, une protéine FUS mutante, etc. Assurez-vous que l’étiquette fluorescente du plasmide co-transfecté n’entrera pas en conflit avec le canal FITC de l’imagerie GCaMP. De même, si vous effectuez une imagerie de colorant styryl, assurez-vous que le plasmide co-transfecté n’entrera pas en conflit avec le canal d’imagerie TRITC. L’utilisation de la synaptophysine-GCaMP3 est tout aussi efficace dans ce protocole. Par conséquent, transfectez la même quantité de ce plasmide et suivez toutes les étapes comme d’habitude dans la section 7.
  3. Incuber le complexe de réactif de transfection ADN à température ambiante pendant 10 min.
  4. Ajoutez doucement le complexe incubé aux neurones goutte à goutte avec tourbillon. Remettre le plat dans l’incubateur à CO2 à 37 °C pendant 45-60 min.
  5. Retirer tout le milieu de culture contenant le complexe de réactif de transfection ADN et le remplacer par une préparation de 50 à 50 par volume de milieux neuronaux préconditionnés et frais. Ensuite, remettez les cellules dans l’incubateur à CO2 pendant 48 h jusqu’à l’imagerie.

4. Préparation de solutions tampons et de solution mère de colorant styryl

  1. Préparer des solutions de CSF faible et élevée fraîches avant l’imagerie à l’aide des ingrédients énumérés dans le tableau 1. Filtrez les deux solutions tampons avant utilisation.
    REMARQUE: CaCl2 dihydraté peut former Ca(OH)2 lors du stockage. Pour une efficacité maximale, utilisez toujours un récipient récemment ouvert. Si cela n’est pas possible, pour éliminer le Ca(OH)2 de la surface externe et assurer une solubilité maximale, les solutions peuvent être gazéifiées avec du CO2 gazeux pendant 5 min avant l’ajout de CaCl2 . Si cette étape est franchie, ajustez le pH de la solution résultante pour maintenir une valeur de pH de 7,4, car une carbonatation excessive entraînera la formation de Ca(HCO3)2 .
Tampon aCSF KCL faible (pH de 7,40 à 7,45)
RéactifConcentration
HEPES10 mM
NaCl140 mM
Kcl5 mM
Glucose10 mM
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM
Tampon ACSF KCL élevé (pH de 7,40 à 7,45)
RéactifConcentration
HEPES10 mM
NaCl95 mM
Kcl50 mM
Glucose10 mM
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM

Tableau 1 : Composition des tampons du liquide céphalo-rachidien artificiel (CSPa). Ce tableau comprend les ingrédients pour préparer des tampons de liquide céphalorachidien artificiel faible et élevé en KCl utilisés lors de l’imagerie et de la stimulation des neurones. Voir rubrique 4 pour les instructions de préparation.

  1. Préparer une solution mère de colorant styryl en prenant un flacon de 100 μg de colorant et en le reconstituant à une concentration de 10 mM avec de l’eau distillée ou un milieu neurobasal.

5. Configuration du microscope et du système de perfusion

REMARQUE: Pour l’imagerie des boîtes de Petri à fond de verre, un microscope à fluorescence confocale inversée est préféré en raison de la flexibilité de la perfusion et de l’utilisation d’un objectif d’immersion dans l’huile à grande ouverture numérique. Reportez-vous à la Table des matériaux pour le microscope confocal, la caméra et les objectifs utilisés pour l’imagerie d’exemples détaillés dans la section Résultats représentatifs .

  1. Effectuez toutes les expériences à 37 °C avec des niveaux constants de CO2 de 5 % à l’aide d’un support d’étage couplé à un système d’incubateur.
  2. Contrôlez l’acquisition d’images à l’aide d’un logiciel confocal. Optimisez les paramètres d’acquisition au début de la séance d’imagerie pour choisir la puissance d’excitation et le gain afin d’assurer une visualisation optimale des signaux sans photoblanchiment.
    1. Maintenez la puissance d’excitation, le temps d’exposition, le gain du détecteur et la fréquence d’images constants sur tous les échantillons. Effectuez une imagerie time-lapse en utilisant un rapport d’aspect de 512 x 512 et une fréquence d’images de 2 images / s pour minimiser le blanchiment de la teinture.
      REMARQUE: Bien que les ponctuations doivent être clairement visibles, l’intensité du laser doit être réglée au minimum possible pour éviter le blanchiment et la phototoxicité. Réglez l’ouverture confocale sur le réglage le plus étroit pour obtenir une résolution optimale des puncta fluorescents dans les neurites. Le temps d’exposition est réglé sur 200 ms ou moins, ce qui est cohérent entre les échantillons. La vitesse d’imagerie maximale de la caméra utilisée était de 2 images/s. Si vous utilisez un appareil photo plus rapide, plus d’images peuvent être prises. Les paramètres d’imagerie temporelle doivent être choisis si possible.
  3. Sélectionnez les combinaisons de filtres d’excitation/dichroïque/émission de fluorescence suivantes pour l’imagerie à l’aide d’un logiciel confocal : Gcamp6m/Gcamp3 avec FITC et colorant styryl avec TRITC, respectivement.
  4. Utilisez la fonction de mise au point parfaite du logiciel d’acquisition d’imagerie confocale pendant l’imagerie accélérée pour éviter la dérive z.
    REMARQUE: En raison de la vitesse rapide de l’imagerie, un seul plan est imagé. Il est très important de s’assurer de l’absence de dérive z pendant l’expérience.
  5. Sélectionnez l’onglet Heure dans le panneau d’acquisition d’image pour définir les périodes et les intervalles d’enregistrement.
    1. Réglez la phase #1 sur Intervalle 500 ms, Durée 3 - 5 min.
    2. Réglez la phase #2 sur Intervalle 500 ms, Durée 5 min.
      REMARQUE: La phase #1 correspond à l’enregistrement de base, la phase #2 à la période de stimulation, respectivement.
  6. Assemblez un appareil de perfusion par gravité pour aCSF à l’aide d’un système de commande de vanne et d’un collecteur de canaux.
    1. Chargez un KCl élevé (voir tableau 1) dans une seringue de 50 mL située au sommet de l’appareil, avec des tubes traversant le système. Réglez le débit sur 1 mL/min.
  7. Chargez une boîte en verre de 35 mm contenant des neurones sur l’étage d’imagerie confocale, avec l’extrémité du tube de perfusion placée au bord de la boîte. Choisissez le champ d’imagerie.

6. Imagerie par colorant styryl de la libération des vésicules synaptiques

  1. Incuber des cellules dans un CSAf à faible KCl (voir tableau 1) pendant 10 min à 37 °C, 48 h après la transfection.
  2. Chargez les neurones corticaux ou moteurs primaires sur des boîtes de Petri à fond de verre avec un colorant styryl.
    1. Éliminer le KCl aCSF faible par aspiration.
    2. Utilisez une pipette pour charger les neurones dans l’obscurité avec 10 μM de colorant styryl dans un CSF contenant 50 mM de KCl pendant 5 min.
    3. Retirer la solution de charge et les neurones de bain dans un faible KCl aCSF pendant 10 minutes pour éliminer la charge de colorant non spécifique.
  3. Placez la parabole à fond de verre de 35 mm sur la scène d’imagerie, puis observez soit sous un objectif d’air 20x, soit sous un objectif d’immersion dans l’huile 40x d’un microscope confocal inversé.
    REMARQUE: Utilisez la fluorescence GFP pour localiser les cellules transfectées dans le cas de cellules co-transfectées avec un plasmide marqué GFP.
  4. Excitez le colorant styryl à l’aide d’un laser de 546 nm, collectez les émissions à l’aide d’un filtre passe-bande de 630-730 nm (TRITC).
  5. Sélectionnez le champ d’imagerie et engagez une mise au point parfaite. Ensuite, prenez une seule image fixe avec des canaux de champ lumineux, triTC et marqueurs de fluorescence pour marquer les limites neuronales.
  6. Lancez Exécuter maintenant dans le logiciel d’acquisition. Effectuez l’enregistrement basal pendant 3 à 5 minutes pour exclure les variations d’intensité du colorant, le cas échéant (phase #1).
    REMARQUE: Il est essentiel de s’assurer que toute diminution de l’intensité du colorant est due à la libération de vésicules synaptiques et non à la diffusion passive du colorant ou au photoblanchiment. Cette période de pré-stimulation de 3 à 5 minutes devrait se traduire par un niveau d’intensité de colorant stable et maintenu. Les 30 dernières secondes de cet enregistrement seront utilisées pour déterminer une valeur de fluorescence de référence moyenne pour chaque retour sur investissement. Avant d’évaluer les conditions expérimentales, une condition supplémentaire de non-stimulation d’environ 10 minutes d’enregistrement continu à l’aide des paramètres d’acquisition prévus peut également être effectuée pour assurer des valeurs de fluorescence stables en utilisant les paramètres laser pendant une période prolongée.
  7. Au passage à la phase #2, déclenchez le bouton du système de perfusion. Ensuite, perfuser constamment 50 mM KCl aux neurones pour faciliter le déchargement des colorants (Phase #2).
    1. Effectuer des enregistrements pendant 300 s après l’ajout de KCl. Après cela, l’acquisition s’arrête; déclencher l’interrupteur Off du système de perfusion.
  8. Enregistrez l’expérience et analysez les données à l’aide d’un logiciel confocal comme décrit dans la section 8 ci-dessous.
    REMARQUE: L’expérience peut être arrêtée à ce stade et l’analyse peut être effectuée ultérieurement. Dans le cas où les cellules ne nécessitent pas de transfection pour l’expression de protéines d’intérêt, ce protocole peut être effectué à tout moment in vitro lorsque l’on cherche à examiner la fonctionnalité du déchargement synaptique. Après un test des cellules témoins pour assurer un déchargement synaptique approprié, l’expérimentateur doit être aveuglé par les conditions génétiques ou pharmacologiques de chaque plat testé afin de minimiser les biais.

7. Imagerie par fluorescence des transitoires calciques Gcamp6m

  1. Transfecter les neurones corticaux primaires des rongeurs cultivés sur des boîtes à fond de verre de 35 mm avec 500 ng de Gcamp6m comme indiqué à la section 3.
    REMARQUE: Si vous le souhaitez, co-transfectez les neurones avec un plasmide d’intérêt contenant une étiquette fluorescente dans la gamme rouge ou rouge lointain.
  2. Incuber les neurones avec un faible KCl aCSF pendant 15 min 48 h après la transfection, puis monter la parabole sur la plate-forme d’imagerie.
  3. Visualisez la fluorescence GCaMP6m à l’aide d’un filtre FITC (488 nm) et d’un objectif 20x ou 40x.
  4. Sélectionnez le champ d’imagerie et engagez une mise au point parfaite. Ensuite, prenez une seule image fixe avec des canaux de champ lumineux, de FITC et de marqueurs de fluorescence pour marquer les limites neuronales.
  5. Lancez Exécuter maintenant dans le logiciel d’acquisition. Effectuez l’enregistrement de base pendant 5 minutes, puis perfusez avec un CSF contenant 50 mM de KCL de la même manière que celle décrite à la section 6 pour les expériences de colorant styryl.
    NOTE: Le but de cette imagerie est de mesurer les transitoires de calcium évoqués. Si un neurone a une activité de déclenchement basale et des flux de calcium pendant la période de pré-stimulation, il n’est pas utilisé dans l’analyse des données. Au lieu de cela, seules les cellules avec une fluorescence de fond stable sont utilisées. Les périodes post-stimulation peuvent également être prolongées jusqu’à 60 minutes pour les transitoires de calcium, avec ou sans perfusion continue supplémentaire de KCl élevé.
  6. Enregistrez l’expérience et analysez les données à l’aide d’un logiciel confocal comme décrit dans la section 8 ci-dessous. L’expérience peut être arrêtée à ce stade, et l’analyse peut être effectuée plus tard.
    REMARQUE: Si les cellules ne nécessitent pas de transfection pour l’expression des protéines d’intérêt, ce protocole peut être effectué à tout moment in vitro lors de l’examen des transitoires calciques. Après un test des cellules témoins pour assurer la mesure des transitoires de calcium, l’expérimentateur doit être aveuglé par les conditions génétiques ou pharmacologiques de chaque plat testé afin de minimiser les biais.

8. Analyse d’images

  1. Ouvrez des images time-lapse avec un logiciel confocal.
  2. Aligner les images en série time-lapse par la série de commandes : Image | | de traitement Aligner le document actif. Sélectionnez Aligner sur la première image.
  3. Sélectionnez les régions d’intérêt (ROI) le long des neurites à l’aide de l’outil de sélection du retour sur investissement, une icône en forme de haricot à droite du cadre de l’image (Figure 3B). Marquez également un retour sur investissement représentant l’intensité de fluorescence de fond.
    REMARQUE: Les ROI sont sélectionnés en choisissant des zones de ponctuation distinctement séparées le long des pistes neuronales indiquées par l’image fixe en champ lumineux. Au moins cinq ROI par neurone sont choisis pour l’analyse. Le retour sur investissement d’arrière-plan est choisi dans une région du champ de vision qui ne contient pas de neurites.
  4. Mesurez la fluorescence brute au fil du temps pour les rois sélectionnés à l’aide des séries de commandes suivantes : Mesurer | Mesure du temps.
    1. Lancez la fonction Mesure dans la partie supérieure du panneau Mesure du temps . Une représentation graphique de la fluorescence brute au fil du temps (Figure 3C) et des données quantitatives sont toutes deux générées.
      REMARQUE : Chaque point de données représente la fluorescence brute de ce retour sur investissement pour la trame associée à ce point de temps mesuré spécifique.
  5. Exportez les intensités de fluorescence brutes vers le tableur.
  6. Analysez chaque retour sur investissement indépendamment. Tout d’abord, normalisez les données en soustrayant l’intensité du retour sur investissement de fond du retour sur investissement de l’intensité des intérêts à chaque point temporel.
    1. Prenez la valeur de fluorescence brute du retour sur investissement de fond à chaque point temporel spécifique et soustrayez-la de la valeur d’intensité brute du retour sur investissement d’intérêt à ce point temporel.
      REMARQUE: Ceci est fait pour toute la période d’enregistrement, à la fois les phases basales et de stimulation.
  7. Déterminez le retour sur investissement moyen de l’intensité des intérêts pour les 30 dernières années de référence.
    1. Moyenne des valeurs basales brutes normalisées générées à l’étape 8,6 à partir des 30 dernières s de la période d’enregistrement basal de 3 à 5 minutes.
      REMARQUE: Toute la période d’enregistrement basal pourrait être utilisée pour générer cette valeur. Cependant, à mesure que cette valeur se stabilise et est maintenue, les 60 points temporels des 30 dernières s sont d’une taille d’échantillonnage suffisante pour représenter l’ensemble.
  8. Comparez cette valeur de référence à la valeur d’intensité normalisée à chaque point temporel, générant un changement de la valeur de fluorescence (ΔF).
    1. Prenez la valeur de l’étape 8.7 et soustrayez la valeur fluorescente de base moyenne. Effectuez cette étape et les étapes suivantes pendant toute la période d’enregistrement, à la fois les phases basales et de stimulation.
  9. Calculer ce changement concernant la valeur de fluorescence de base, générant un changement de fluorescence/fluorescence de base (ΔF/F). Pour ce faire, prenez la valeur de l’étape 8.8 et divisez-la par la valeur fluorescente de base moyenne.
  10. Enfin, définissez la valeur du point de départ sur 1 afin que les augmentations ou les diminutions puissent être facilement visualisées graphiquement au fil du temps.
    1. Prenez la valeur générée à l’étape 8.9 et ajoutez 1.
      REMARQUE : Lorsque cela est fait correctement, les 30 s de valeurs de la période de référence doivent se situer près de la valeur de 1. Dans les cellules libérant efficacement du contenu synaptique, cette valeur devrait varier de 1 à 0 après le début de la stimulation. Un exemple des étapes 6 à 9 est présenté à la figure 3E.

9. Analyse des données

REMARQUE : L’expérimentateur peut être insensible aux conditions expérimentales pour regrouper les données à des fins d’analyse appropriées. Utilisez une taille d’échantillon d’au moins 10 neurones par condition de chacune des trois expériences indépendantes. Ne considérez les neurones pour l’inclusion que si au moins cinq régions de retour sur investissement peuvent être désignées. Ce niveau de réplication expérimentale était suffisant dans les études publiées pour démontrer une perte profonde de déchargement synaptique dans les cellules contenant des poly-GA liées à la SLA par rapport aux témoins GFP (voir Résultats représentatifs). Toutefois, si un phénotype plus subtil est observé, le nombre de répliques biologiques et/ou techniques peut nécessiter une optimisation de la part de l’utilisateur.

  1. En utilisant toutes les valeurs ΔF/F calculées au fil du temps à partir des ROI d’une condition expérimentale donnée, déterminez une valeur moyenne ΔF/F pour chaque point temporel avec un MEB.
  2. Tracez les données à l’aide d’un logiciel de représentation graphique et de statistiques au format xy, où x est le temps écoulé et y est la valeur ΔF/F calculée à l’étape 9.1. Présentez toutes les valeurs sous forme de moyenne ± SEM.
  3. Pour déterminer la signification statistique, utilisez le test t de Student pour comparer deux groupes et l’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA), suivi de l’analyse posthoc de Tukey pour comparer trois groupes ou plus.

Résultats

Après la mise en œuvre réussie du protocole ci-dessus, des résultats représentatifs sont présentés pour une expérience typique de libération de vésicules synaptiques de colorant styryl. Les neurones corticaux primaires de rats cultivés ont été chargés de colorant à l’aide de la méthode décrite à la rubrique 6. La spécificité de la charge en colorant a été déterminée par co-marquage avec la synaptophysine, marqueur de vésicule synaptique. La majorité des colorants de styryl positifs sont co-pos...

Discussion

Trois étapes communes aux deux méthodes décrites sont d’une importance cruciale pour le succès expérimental et les résultats quantifiables. Tout d’abord, la préparation d’un CSF frais avant chaque série d’expériences est essentielle, en suivant les instructions ci-jointes. Ne pas le faire peut empêcher une dépolarisation neuronale appropriée. Un échantillon de neurones témoins non traités doit être constamment testé avant la stimulation de tout groupe expérimental afin d’assurer une dépolaris...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous tenons à remercier les membres actuels et anciens du Jefferson Weinberg ALS Center pour leurs commentaires critiques et leurs suggestions visant à optimiser ces techniques et leurs analyses. Ce travail a été soutenu par le financement des NIH (RF1-AG057882-01 et R21-NS0103118 à D.T.), du NINDS (R56-NS092572 et R01-NS109150 à P.P.), de la Muscular Dystrophy Association (D.T.), du Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), de la Family Strong 4 ALS Foundation et de la Farber Family Foundation (B.K.J., K.K. et P.P).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
20x air objectiveNikonFor imaging
40x oil immersion objectiveNikonFor imaging
B27 supplementThermo Scientific17504044Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mLThermo Scientific13-689-8Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hoodBakerSterilGARD III SG403AAsceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-MercaptoethanolMillipore SigmaM3148For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9418For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrateMillipore Sigma223506Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubatorThermo Scientific13-998-123For culturing and maintenance of neurons
CentrifugeEppendorf5810RFor neuronal culture preparation
Confocal microscopeNikonEclipse Ti +A1R coreFor fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD cameraPhotometricsFor image acquisition
D-GlucoseMillipore SigmaG8270Component of aCSF solutions
DNaseMillipore SigmaD5025For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley ratsCharles river400SASSDFor preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cubeNikon77032509For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dyeInvitrogenT13320For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)CellVisD35-10-1.5-NFor growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipetteGrainger52NK56For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Millipore SigmaH6648For preparing neuronal cultures
HEPESMillipore SigmaH3375Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
horse serumMillipore SigmaH1138For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hoodNUAIRENU-301-630For preparing neuronal cultures
LamininThermo Scientific23017015For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 MediumThermo Scientific11415064For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol redThermo Scientific21083027For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM)Thermo Scientific25030149Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Scientific11668019For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
Magnesium chlorideMillipore Sigma208337Component of aCSF solutions
Microsoft ExcelMicrosoftSoftware for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PESThermo Scientific565-0020Filter unit for aCSF solution
Neurobasal mediumThermo Scientific21103049For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced ResearchNikonSoftware for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubesThermo Scientific339650For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubesThermo Scientific339652For preparing neuronal culture and buffer solutions
OptiprepMillipore SigmaD1556For preparing neuronal cultures
PapainMillipore SigmaP4762For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Scientific15140122To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion systemWarner InstrumentsSF-77BFor exchange of aCSF
Perfusion tubingCole-ParmerUX-30526-14Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmidAddgene40754For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromideMillipore SigmaP7886Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chlorideMillipore SigmaP3911Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonateMillipore SigmaS5761Component of aCSF solutions
Sodium ChlorideMillipore SigmaS9888Component of aCSF solutions
Stage Top IncubatorTokai HitFor incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cubeNikon77032809For imaging FM4-64
Trypsin InhibitorMillipore SigmaT6414For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Scientific25200056For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation tableNew PortVIP320X2430-135520Table/stand for microscope

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