JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

Abstract

לפני ניוון עצבי, הגורם לליקויים מוטוריים וקוגניטיביים בחולים עם טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) ו/או דמנציה של אונה פרונטוטמפוראלית (FTLD) הוא תפקוד לקוי של תקשורת בין נוירונים נוירונים נוירונים מוטוריים ושרירים. התהליך הבסיסי של שידור סינפטי כרוך היתוך שלפוחית סינפטית תלוי depolarization ממברנה ושחרור של נוירוטרנסמיטורים לתוך הסינפסה. תהליך זה מתרחש באמצעות זרם סידן מקומי לתוך מסופים presynaptic שבו שלפוחיות סינפטיות שוכנות. כאן, הפרוטוקול מתאר מתודולוגיות הדמיה חיה מבוססות פלואורסצנטיות המדווחות באופן אמין על אקסוציטוזיס שלפוחית סינפטי בתיווך דה-פולאריזציה ודינמיקה של זרם סידן מסוף פרזינפטי בתאי עצב מתורבתים.

באמצעות צבע סטיירל המשולב בקרומי שלפוחית סינפטיים, שחרור השלפוחית הסינפטי מובהק. מצד שני, כדי לחקור את כניסת הסידן, Gcamp6m משמש, כתב פלואורסצנטי מקודד גנטית. אנו משתמשים בדה-פולאריזציה בתיווך אשלגן כלורי גבוה כדי לחקות פעילות עצבית. כדי לכמת אקסוציטוזה שלפוחית סינפטית חד משמעית, אנו מודדים את אובדן פלואורסצנטיות צבע סטיירל מנורמלת כפונקציה של זמן. תחת תנאי גירוי דומים, במקרה של זרם סידן, Gcamp6m פלואורסצנטיות עולה. נורמליזציה וכימות של שינוי פלואורסצנטי זה מבוצעים באופן דומה לפרוטוקול צבע סטיירל. שיטות אלה יכולות להיות מולטיפלקס עם ביטוי יתר מבוסס טרנספקטיה של חלבונים מוטנטיים מתויגים פלואורסצנטיים. פרוטוקולים אלה שימשו בהרחבה כדי ללמוד תפקוד סינפטי במודלים של FUS-ALS ו - C9ORF72-ALS, תוך שימוש בנוירונים קליפת המוח והמוטוריים העיקריים של מכרסמים. פרוטוקולים אלה מאפשרים בקלות סינון מהיר של תרכובות שעשויות לשפר את התקשורת העצבית. ככזה, שיטות אלה הן ערך לא רק עבור המחקר של ALS אלא עבור כל התחומים של מחקר מדעי המוח neurodegenerative והתפתחותי.

Introduction

מידול טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) במעבדה הופך למאתגר באופן ייחודי בשל האופי הלא סדיר באופן גורף של מעל 80% מהמקרים1, יחד עם המספר העצום של מוטציות גנטיות הידועות כסובטיביות למחלה2. למרות זאת, כל המקרים של ALS חולקים את התכונה המאחדת שלפני ניוון עצבי גלוי, יש תקשורת לא מתפקדת בין נוירונים מוטוריים presynaptic ותאי שריר פוסט-סינפטיים3,4. מבחינה קלינית, כאשר חולים מאבדים את הקישוריות של הנוירונים המוטוריים העליונים והתחתונים הנותרים, הם מציגים תכונות של היפר-רגישות עצבית והיבועות לאורך המחלה 5,6,7,8,9, המשקפים שינויים מולקולריים מורכבים בסיסיים בסינפסות אלה, שאנו, כחוקרי ALS, מבקשים להבין.

מודלים מהונדסים מרובים המחישו כי הידרדרות וחוסר ארגון של הצומת הנוירו-שרירי מתרחשים עם הביטוי של מוטציות גנטיות סיבתיות ALS, כולל SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16, ו- TDP4317,18,19 באמצעות הערכות מורפולוגיות, כולל הערכה של זרי פרחים סינפטיים, צפיפות עמוד שדרה, וארגון טרום/פוסט-סינפטי. מבחינה מכאניסטית, מאז ניירות ציון הדרך של קול, הודג'קין, האקסלי בשנות ה -30, ניתן היה גם להעריך תגובות סינפטיות באמצעות טכניקות אלקטרופיזיולוגיות בתרבית תאים במבחנה או בהכנות פרוסת רקמות20. באמצעות אסטרטגיות אלה, מודלים רבים של ALS הוכיחו ליקויי שידור סינפטיים. לדוגמה, גרסה מוטנטית של TDP43 גורמת לתדירות ירי משופרת ומפחיתה את סף פוטנציאל הפעולה ב- NSC-34 (חוט השדרה x קו תאים היברידי נוירובלסטומה 34) תאים דמויי נוירון מנוע21. אותה גרסה גורמת גם להעברת סינפטית לא מתפקדת בצומת הנוירו-שרירית (NMJ) לפני הופעת ליקויים מוטוריים התנהגותיים במודל עכבר22. בעבר הוכח כי ביטוי FUS מוטנטי גורם שידור סינפטי מופחת ב NMJ במודל drosophila של FUS-ALS לפני פגמים locomotor11. דו"ח שנערך לאחרונה באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה נגזר נשאי התרחבות C9orf72 חשף ירידה במאגר לשחרור בקלות של שלפוחיות סינפטי23. בסך הכל, מחקרים אלה ואחרים מדגישים את החשיבות של בניית הבנה מקיפה יותר של המנגנונים שבבסיס האיתות הסינפטי במודלים רלוונטיים למחלות של ALS. זה יהיה מרכזי בהבנת הפתוביולוגיה של ALS ופיתוח יעדים טיפוליים פוטנציאליים עבור חולים.

שיטות של תאי הידוק זרם ומתח היו לא יסולא בפז בקביעת תכונות הממברנה כגון מוליכות, פוטנציאל ממברנה מנוחה, ותוכן קוונטי של סינפסות בודדות20,24. עם זאת, אחת המגבלות המשמעותיות של אלקטרופיזיולוגיה היא שזה מאתגר מבחינה טכנית ומספק רק תובנות מתא עצב יחיד בכל פעם. מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים חיים, יחד עם בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, מציעה את ההזדמנות לחקור את ההעברה הסינפטית של נוירונים באופן מרחבי25,26,27. אמנם לא מידה ישירה של עירור עצבי, גישה פלואורסצנטית זו יכולה לספק מדידה יחסית של שני קורלציות מולקולריות של תפקוד סינפטי: שחרור שלפוחית סינפטית וחולפים סידן במסופים סינפטיים.

כאשר פוטנציאל פעולה מגיע לאזור המסוף presynaptic של נוירונים, ארעי סידן מופעלים, להקל על המעבר מאות חשמלי לתהליך של שחרור נוירוטרנסמיטר28. תעלות סידן מגודרות מתח מקומי לאזורים אלה לווסת היטב את איתות הסידן כדי לווסת את הקינטיקה של שחרור נוירוטרנסמיטר29. ההקלטות הראשונות המבוססות על פלואורסצנטיות של ארעי סידן בוצעו באמצעות מחוון אורך גל כפול Fura-2 AM או צבע אורך גל יחיד Fluo-3 AM30,31,32. בעוד צבעים אלה הציעו תובנה חדשה נהדרת באותו זמן, הם סובלים ממספר מגבלות כגון מידור לא ספציפי בתוך תאים, אובדן צבע פעיל או פסיבי מתאים מסומנים, הלבנת פוטוגר ורעילות אם הם מצולמים על פני פרקי זמן ממושכים של זמן33. בעשור האחרון, אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית הפכו סוסי העבודה להדמיית צורות שונות של פעילות עצבית. אינדיקטורים אלה משלבים חלבון פלואורסצנטי שונה עם חלבון כלאטור סידן המחליף במהירות את עוצמת הפלואורסצנטיות לאחר הכריכה של Ca2 + יונים 34. היישום של אינדיקטורים חדשים אלה הוא עצום, המאפשר הדמיה הרבה יותר קלה של ארעי סידן תאיים הן במבחנה והן בהגדרות vivo. משפחה אחת של כתבים מקודדים גנטית אלה, המכונה GCaMP, נמצאים כעת בשימוש נרחב. אינדיקטורים אלה מכילים תחום קלומודולין C-מסוף, ואחריו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), והם מכוסים על ידי אזור מחייב N-מסוף calmodulin35,36. סידן מחייב לתחום calmodulin מפעיל אינטראקציה עם האזור מחייב calmodulin, וכתוצאה מכך שינוי קונפורמציה במבנה החלבון הכולל ועלייה משמעותית פלואורסצנטיות של moiety GFP 35,36. במהלך השנים, משפחה זו של כתבים עברה מספר התפתחויות כדי לאפשר קריאות ברורות עבור ארעי סידן מסוימים עם קינטיקה ספציפית (איטי, בינוני ומהיר), כל אחד עם תכונות שונות במקצת37,38. כאן, השימוש של הכתב GcaMP6 הודגש, אשר הוכח בעבר לזהות פוטנציאל פעולה יחיד ו ארעי סידן דנדריטי בנוירונים הן ויוו והן במבחנה37.

סידן ארעי באזור presynaptic לעורר אירועי היתוך שלפוחית סינפטי, גרימת שחרור נוירוטרנסמיטר לתוך הסינפרסה וייזום של אירועי איתות בתא postsynaptic 28,39. שלפוחיות סינפטיות משתחררות וממומחזרות במהירות, שכן התא שומר באופן הומיוסטאטי על שטח פנים יציב של קרום התא ובריכה הניתנת לשחרור בקלות של שלפוחיות בעלות יכולת היתוך הכרוכות בממברנה40. צבע סטיירל המשמש כאן יש זיקה כלפי קרום השומנים, במיוחד משנה את תכונות הפליטה שלה בהתבסס על ההזמנה של סביבת השומנים שמסביב41,42. לכן, זהו כלי אידיאלי עבור תיוג שלפוחיות סינפטיות מיחזור ומעקב אחר המעקב הבא של שלפוחיות אלה כפי שהם שוחררו מאוחר יותר בעקבות גירוי עצבי41,42. הפרוטוקול שנוצר ואופטימיזציה הוא הסתגלות של המושגים שתוארו בתחילה על ידי גפילד ועמיתיו, המאפשר לנו לדמיין styryl צבע מסומן שלפוחית סינפטית puncta לאורך זמן ברציפות41.

כאן מתוארות שתי מתודולוגיות מבוססות פלואורסצנטיות קשורות, המדווחות באופן אמין על אירועים תאיים ספציפיים המעורבים בשידור סינפטי. פרוטוקולים הוגדרו כדי לחקור את הדינמיקה של זרם סידן מסוף presynaptic בתיווך דה-פולאריזציה ואקסוציטוזיס שלפוחית סינפטית בתאי עצב מתורבתים. כאן, שיטות ותוצאות מייצגות מתמקדות בשימוש במכרסמים ראשוניים קליפת המוח או נוירונים מוטוריים כמערכת מודל הפריה חוץ גופית, שכן ישנם מחקרים שפורסמו באמצעות סוגי תאים אלה43,44. עם זאת, שיטות אלה חלות גם על נוירונים אנושיים מובחנים דמויי קליפת המוח i345, שכן יש לנו גם הצלחה עם שני הפרוטוקולים בניסויים המתמשכים כיום במעבדה שלנו. הפרוטוקול הכללי מתואר בתבנית ליניארית צעדית, המוצגת באיור 1. בקצרה, כדי לחקור את דינמיקת הסידן בנוריטים, נוירונים בוגרים מועברים עם DNA פלסמיד כדי לבטא את הכתב הפלואורסצנטי GCaMP6m תחת מקדם Cytomegalovirus (CMV) 37,46. תאים שעברו זיהום יש רמה נמוכה של פלואורסצנטיות ירוקה בסיסית, אשר מגביר בנוכחות סידן. אזורי עניין מפורטים כדי לפקח על שינויים פלואורסצנטיים לאורך המניפולציה שלנו. זה מאפשר תנודות מקומיות מאוד מרחבית וזמן בסידן להימדד 37,46. להערכת היתוך ושחרור שלפוחית סינפטית, נוירונים בוגרים עמוסים בצבע סטיירל המשולב בממברנות שלפוחית סינפטית כפי שהם ממוחזרים, רפורמה, ונטען מחדש עם נוירוטרנסמיטורים בתאים presynaptic41,42,43,43,47,48. הצבעים הנוכחיים המשמשים למטרה זו תווית שלפוחיות סינפטיות לאורך neurites ומשמשים פרוקסי עבור אזורים אלה בניסויים הדמיה חיה, כפי שמוצג על ידי הכתמה משותפת של צבע סטיירל ו synaptotagmin על ידי Kraszewski ועמיתים49. להלן תמונות מייצגות של כתמים דומים שבוצעו גם הם (איור 2A). חוקרים קודמים השתמשו בהרחבה בצבעים כאלה כדי לדווח על דינמיקת שלפוחית סינפטית בצומת neuromuscular ו נוירונים ההיפוקמפוס48,49,50,51,52,53,54,55,56 . על ידי בחירת אזורים דקדקאטים של שלפוחיות טעונות צבע ועל ידי ניטור ירידות בעוצמת הפלואורסצנטיות לאחר שחרור שלפוחית, ניתן ללמוד את יכולת ההולכה הסינפטית התפקודית ואת הדינמיקה הזמנית של שחרור לאחר גירוי43. עבור שתי השיטות, מדיום המכיל ריכוז גבוה של אשלגן כלורי משמש כדי depolarize תאים כדי לחקות את הפעילות העצבית. פרמטרי הדמיה מצוינים כדי ללכוד מרווחי זמן תת-שניים המשתרעים על פני נורמליזציה בסיסית ואחריה תקופת לכידת הגירוי שלנו. מדידות פלואורסצנטיות בכל נקודת זמן נקבעות, מנורמלות לרקע ומכומתות לאורך פרק הזמן הניסיוני. סידן-זרם מתווך GCaMP6m פלואורסצנטי להגדיל או יעיל אקסוציטוזיס שלפוחית סינפטית styocytosis styryl צבע לשחרר ירידה פלואורסצנטית ניתן לזהות באמצעות אסטרטגיה זו. התקנה מתודולוגית מפורטת ופרמטרים עבור שני פרוטוקולים אלה ודיון על היתרונות והמגבלות שלהם מתוארים להלן.

figure-introduction-9885
איור 1: עיבוד חזותי של תהליך הפרוטוקול הכללי הכולל. (1) לבודד ותרבות נוירונים מכרסמים ראשוניים במבחנה לנקודת זמן התבגרות שנבחרה. (2) להציג GCaMP DNA או צבע סטיירל ככתבים של פעילות סינפטית. (3) הגדרת פרדיגמת הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל המצויד בהדמיה חיה ותוכנות משויכות. התחל תקופת הקלטה בסיסית. (4) בעוד תאים עדיין עוברים לכידת תמונה חיה, לעורר נוירונים באמצעות זלוף אמבט KCl גבוה. (5) להעריך מדידות עוצמת פלואורסצנטיות לאורך זמן כדי למדוד סידן ארעי או היתוך שלפוחית סינפטי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש של אוניברסיטת ג'פרסון.

1. התרבות העיקרית של נוירונים מקליפת המוח החולדה העוברית

הערה: נוירונים קליפת המוח העיקריים מבודדים מעוברי חולדה E17.5 כפי שתואר בעבר57,58. לא נראה שקיימת הטיית מתח עם ההצלחה של פרוטוקול פולחן זה. שיטה זו מתוארת בקצרה להלן. יש להפנות את המאמרים הקודמים שצוינו לקבלת פרטים מלאים.

  1. המתת חסד חולדות נקבה בהריון על ידי שאיפת CO2 ואחריו אישור משני על ידי נקע צוואר הרחם.
  2. לקצור עוברים ולבודד מוחות בקרח קר 20 מ"מ HEPES-buffered פתרון המלח המאוזן של האנק (HBSS). מקליפת המוח החיצונית, נפרדים ואז משליכים סטריאטום והיפוקמפי. לאסוף קליפת ריאות.
  3. השתמש מלקחיים עדינים כדי להסיר קרום המוח מקליפת המוח. כדי לעשות זאת, להחזיק את קליפת המוח במקום עם זוג אחד של מלקחיים סגורים באמצעות לחץ עדין.
    הערה: עם זוג המלקחיים השני ביד השנייה, צבוט קרום המוח. לקלף את קרום המוח באמצעות תנועה מתגלגלת עם זוג צבט. מקם מחדש עם המלקחיים הסגורים וחוזר על הפעולה לפי הצורך עד שקרום המוח מוסר לחלוטין.
  4. קליפות קליפת המוח מדגרות עם 10 מיקרוגרם / מ"ל של פפאין ב- HBSS למשך 4 דקות ב 37 °C (37 °F).
  5. לשטוף שלוש פעמים ב HBSS, ולאחר מכן triturate בעדינות 5-10 פעמים עם פיפטה פסטר זכוכית מלוטשת אש כדי לקבל השעיית תא הומוגני.
    הערה: הימנע בועות; לשמור על פיפטה בתוך ההשעיה התא.
  6. נוירונים צלחת על 100 מיקרוגרם / מ"ל poly-D-ליזין מצופה 35 מ"מ מכותכות תחתון כלים בצפיפות של 75,000 תאים / צלחת במדיום neurobasal עם תוספת B27 (2%), ו פניצילין-סטרפטומיצין.

2. התרבות העיקרית של נוירונים מוטוריים מחוט השדרה החולדה העוברי

הערה: נוירונים מוטוריים ראשוניים מוכנים מעוברי חולדות E13.5 כפי שתואר בעבר, עם מעט שינויים59,60. לא נראה שקיימת הטיית מתח עם ההצלחה של פרוטוקול פולחן זה. שיטה זו מתוארת בקצרה להלן. יש להפנות למאמרים הקודמים שצוינו לקבלת פרטים מלאים.

  1. המתת חסד של חולדות בהריון כמו בשלב 1.1.
  2. לנתח 10-20 חוטי שדרה מעוברים ולפרוץ לרסיסים קטנים באופן מכני באמצעות שני זוגות של מלקחיים כדי לצבוט ולמשוך, בהתאמה.
  3. דגירה ב 0.025% טריפסין במשך 8 דקות, ואחריו תוספת של DNase ב 1 מ"ג / מ"ל.
  4. צנטריפוגה דרך כרית BSA 4% w / v ב 470 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F) ללא הפסקה.
  5. תאים כדוריים צנטריפוגה במשך 55 דקות ב 830 x g ב 4 °C (4 °F) ללא בלם דרך 10.4% (v/ v) צפיפות הדרגתית בינונית (ראה טבלת חומרים) כרית. לשאת קדימה את רצועת הנוירונים המוטוריים בממשק החזותי.
    הערה: כדי להבטיח לכידה של כל התאים, השתמש במדיה נטולת פנול עבור שלב שיפוע הצפיפות ומדיה המכילה פנול עבור כל השלבים האחרים. הממשק של מדיית מעבר הצבע והדיסוציאציה של הצפיפות ניתן לזיהוי בקלות בהתבסס על הפרש הצבעים.
  6. ספין אסף רצועות דרך עוד 4% w / v כרית BSA ב 470 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (65 °F) ללא הפסקה.
  7. Resuspend נוירונים מוטוריים מטוהרים במדיום נוירובסל מלא עם תוסף B27 (2%), גלוטמין (0.25%), 2-mercaptoethanol (0.1%), סרום סוס (2%), פניצילין-סטרפטומיצין.
  8. נוירוני צלחת על 100 מיקרוגרם / מ"ל של פולי-ליזין ו 3 מיקרוגרם / מ"ל של כיסוי מצופה למינין בצפיפות של 50,000 תאים / צלחת 35 מ"מ זכוכית תחתונה.

3. טרנספקטים עצביים

הערה: שלב זה מתבצע עבור נוירונים שיעברו הדמיית סידן GCaMP ו / או נוירונים שבהם פלסמיד DNA אקסוגני או RNA של עניין הוא הציג לקראת הערכה סינפטית. לעומת זאת, צבע סטירל נטען ממש לפני מפגש ההדמיה ומטופל בסעיף 6. הסיכום שלהלן הוא פרוטוקול הטרנספקטיה המשמש לנוירונים מכרסמים ראשוניים בדוגמאות המוצגות, אך ניתן להתאים אותו בקלות ואופטימיזציה לצרכי המשתמש.

  1. טרנספקטים עבור נוירונים קליפת המוח העיקריים בתרבית מתרחשים ביום 12 במבחנה (DIV 12), ואילו נוירונים מוטוריים מועברים ביום 7 במבחנה (DIV 7).
    הערה: כל השלבים הבאים מתרחשים בתוך ארון בטיחות ביולוגית אספטי.
  2. Transfect 500 ng של GCaMP6m באמצעות ריאגנט transfection ביחס של 1:2 לפי נפח. עבור טרנספקטים משותפים, להוסיף סך של 1.25 מיקרוגרם של DNA הכולל / צלחת, שמירה על DNA זה ליחס ריאגנט.
    הערה: בדוגמאות הניסיוניות המוצגות, 750 ng של פלסמיד הקשור ל- ALS / FTD של עניין כבר transfected להביע C9orf72-ALS מקושר dipeptides, חלבון FUS מוטציה, וכו '. ודא שהתג הפלואורסצנטי של הפלסמיד המשותף לא יתנגש עם ערוץ FITC של הדמיית GCaMP. כמו כן, אם עושים הדמיית צבע סטיירל, ודא כי plasmid interfectd משותף לא יתנגש עם ערוץ TRITC של הדמיה. השימוש בסינפטופיסין-GCaMP3 יעיל באותה מידה בפרוטוקול זה. לכן, להעביר את אותה כמות של plasmid זה בצע את כל השלבים כרגיל בסעיף 7.
  3. דגירה את מתחם ריאגנט ה- DNA-transfection בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  4. הוסיפו בעדינות את הקומפלקס המדגר לנוירונים עם מערבולת. מחזירים את המנה לחממת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45-60 דקות.
  5. הסר את כל המדיה התרבותית המכילה את קומפלקס ריאגנט ה- DNA-transfection והחלף אותו ב- 50-50 על ידי הכנת נפח של מדיה עצבית מותנית ורעננה. לאחר מכן, להחזיר תאים לתוך אינקובטור CO2 במשך 48 שעות עד הדמיה.

4. הכנת פתרונות חוצץ ופתרון מלאי צבע סטיירל

  1. הפוך פתרונות ACSF נמוכים וגבוהים טריים לפני הדמיה באמצעות החומרים המפורטים בטבלה 1. סנן את שני פתרונות המאגר לפני השימוש.
    הערה: CaCl2 דיהידרט יכול ליצור Ca(OH)2 בעת האחסון. לקבלת יעילות מרבית, השתמש תמיד בגורם מכיל שנפתח לאחרונה. אם זה לא אפשרי, כדי להסיר Ca(OH)2 מהמשטח החיצוני ולהבטיח מסיסות מקסימלית, פתרונות עשויים להיות מוגזים עם CO2 גזי במשך 5 דקות לפני תוספת CaCl2 . אם צעד זה ננקט, התאם את ה- pH של הפתרון המתקבל כדי לשמור על ערך pH של 7.4, שכן פחמתיות מופרזת תגרום להיווצרות Ca(HCO3)2 .
מאגר ACSF נמוך של KCL (pH 7.40 עד 7.45)
מגיבריכוז
HEPES10 מ"מ
NaCl140 מ"מ
KCl5 מ"מ
גלוקוז10 מ"מ
CaCl2 2H2O2 מ"מ
MgCl2 4H2O1 מ"מ
מאגר ACSF גבוה של KCL (pH 7.40 עד 7.45)
מגיבריכוז
HEPES10 מ"מ
NaCl95 מ"מ
KCl50 מ"מ
גלוקוז10 מ"מ
CaCl2 2H2O2 מ"מ
MgCl2 4H2O1 מ"מ

טבלה 1: הרכב של מאגרי נוזל שדרתי מלאכותי (aCSF). טבלה זו כוללת את המרכיבים להכנת מאגרי נוזל השדרתיים המלאכותיים KCl נמוכים וגבוהים המשמשים תוך הדמיה וגירוי נוירונים. ראה סעיף 4 להוראות הכנה.

  1. הכן פתרון מלאי צבע styryl על ידי לקיחת בקבוקון 100 מיקרוגרם של צבע והחזרתו לריכוז מלאי של 10 מ"מ עם מים מזוקקים או מדיום neurobasal.

5. התקנת מערכת מיקרוסקופ וזלוף

הערה: להדמיית מנות פטרי עם תחתית זכוכית, מיקרוסקופ פלואורסצנטיות קונפוקלי הפוך עדיף בשל הגמישות של זלוף ושימוש במטרה טבילה בשמן צמצם מספרי גבוה. עיין בטבלת החומרים עבור המיקרוסקופ הקונפוקלי, המצלמה והיעדים המשמשים להדמיה של דוגמאות המפורטות בסעיף תוצאות מייצגות .

  1. בצע את כל הניסויים בטמפרטורה של 37 °C (6 °F) עם רמות קבועות של 5% CO2 באמצעות הרכבה בימתית משולבת של מערכת אינקובטור.
  2. שלוט ברכישת תמונה באמצעות תוכנה קונפוקלית. מטב את הגדרות הרכישה בתחילת מפגש ההדמיה כדי לבחור כוח עירור ולהשיג כדי להבטיח תצוגה חזותית אופטימלית של אותות ללא הלבנת פוטולינג.
    1. שמור על עוצמת עירור, זמן חשיפה, רווח גלאי וקצב פריימים קבוע על פני כל הדגימות. בצע הדמיה של זמן לשגות באמצעות יחס גובה-רוחב של 512 x 512 וקצב פריימים של 2 תמונות/s כדי למזער הלבנת צבע.
      הערה: בעוד puncta צריך להיות גלוי בבירור, עוצמת לייזר צריך להיות מוגדר למינימום האפשרי כדי למנוע הלבנה פוטוטוקסיה. הגדר את פתח הקונפוקלי להגדרה הצרה ביותר כדי להשיג רזולוציה אופטימלית של פונקטה פלואורסצנטית בתוך נוריטים. זמן החשיפה מוגדר ל-200 אלפיות השנייה או פחות, עקבי בין דגימות. מהירות ההדמיה המרבית של המצלמה שבה נעשה שימוש הייתה 2 תמונות/שניה. אם אתם משתמשים במצלמה מהירה יותר, ניתן לצלם תמונות/ים נוספים. יש לבחור הגדרות הדמיה זמנית במידת האפשר.
  3. בחר את השילובים הבאים של מסנני עירור פלואורסצנטיות/דיכרויקה/פליטה להדמיה באמצעות תוכנה קונפוקלית: Gcamp6m/Gcamp3 עם FITC וצבע סטיירל עם TRITC, בהתאמה.
  4. השתמש בתכונת המיקוד המושלמת של תוכנת רכישת ההדמיה הקונפוקלית במהלך הדמיה בזמן ההדמיה כדי למנוע z-drift.
    הערה: בשל המהירות המהירה של הדמיה, מישור יחיד הוא בתמונה. הבטחת חוסר z-drift במהלך הניסוי חשוב מאוד.
  5. בחרו בכרטיסיה 'זמן ' בחלונית 'רכישת תמונה' לקביעת תקופות ההקלטה ומרווחי הזמן.
    1. הגדר שלב #1 למרווח של 500 אלפיות השנייה, משך 3 - 5 דקות.
    2. הגדר שלב #2 למרווח של 500 אלפיות השנייה, משך 5 דקות.
      הערה: שלב #1 מתאים להקלטה בסיסית, שלב #2 לתקופת הגירוי, בהתאמה.
  6. להרכיב מנגנון זלוף כבידה עבור ACSF באמצעות מערכת בקרת שסתום וסעפת ערוץ.
    1. טען KCl גבוה (ראה טבלה 1) לתוך מזרק 50 מ"ל בחלק העליון של המנגנון, עם צינורות פועלים דרך המערכת. הגדר את קצב הזרימה ל- 1 מ"ל / דקה.
  7. טען צלחת זכוכית 35 מ"מ המכילה נוירונים על שלב הדמיה קונפוקלית, עם סוף צינורות זלוף להציב בקצה המנה. בחר את השדה להדמיה.

6. הדמיית צבע סטיל של שחרור שלפוחית סינפטית

  1. תאי דגירה ב- KCl aCSF נמוך (ראה טבלה 1) במשך 10 דקות ב 37 °C (37 °F), 48 שעות לאחר ההעברה.
  2. טען נוירונים קליפת המוח העיקריים או מוטוריים על צלחות פטרי תחתית זכוכית עם צבע styryl.
    1. הסר KCl aCSF נמוך על ידי שאיפה.
    2. השתמש פיפטה לטעון נוירונים בחושך עם 10 מיקרומטר של צבע סטירל ב ACSF המכיל 50 mM KCl במשך 5 דקות.
    3. הסר את פתרון הטעינה ואת נוירוני האמבטיה ב- KCl aCSF נמוך למשך 10 דקות כדי למנוע טעינת צבע לא ספציפית.
  3. מניחים את צלחת הזכוכית התחתונה 35 מ"מ על במת ההדמיה, ולאחר מכן להתבונן או תחת מטרה אוויר 20x או 40x שמן טבילה המטרה של מיקרוסקופ קונפוקל הפוך.
    הערה: השתמש בפלואורסצנטיות GFP כדי לאתר תאים שעברו שינוי במקרה של תאים שעברו שיתוף פעולה עם פלסמיד מתויג GFP.
  4. לרגש צבע סטיירל באמצעות לייזר 546 ננומטר, לאסוף פליטה באמצעות מסנן bandpass 630-730 ננומטר (TRITC).
  5. בחר את שדה ההדמיה ובצע מיקוד מושלם. לאחר מכן, צלם תמונת סטילס אחת עם ערוצי סמן ברייטפילד, TRITC ופלואורסצנטיות כדי לסמן גבולות עצביים.
  6. הפעל הפעל כעת בתוכנת הרכישה. בצע את ההקלטה הבסיסית במשך 3-5 דקות כדי לא לכלול וריאציות בעוצמת הצבע, אם בכלל (שלב #1).
    הערה: חיוני להבטיח כי כל ירידה בעוצמת הצבע נובעת משחרור שלפוחית סינפטי ולא מפיזור צבע פסיבי או הלבנת פוטולינג. תקופה זו של 3-5 דקות טרום גירוי אמורה לגרום לרמת עוצמת צבע יציבה ומתוחזקת. 30 s האחרונים של הקלטה זו ישמשו לקביעת ערך פלואורסצנטיות בסיסי ממוצע עבור כל החזר השקעה. לפני הערכת התנאים הניסיוניים, ניתן לבצע גם מצב נוסף של אי גירוי של כ-10 דקות של הקלטה רציפה באמצעות הגדרות הרכישה המיועדות כדי להבטיח ערכי פלואורסצנטיות יציבים באמצעות הגדרות הלייזר לתקופה ממושכת.
  7. בעת המעבר לשלב #2 , הפעל את הלחצן עבור מערכת הזלוף. לאחר מכן, כל הזמן perfuse 50 mM KCl לנוירונים כדי להקל על פריקת צבע (שלב #2).
    1. בצע הקלטות עבור 300 s לאחר תוספת KCl. לאחר מכן, הרכישה מפסיקה; הפעל את מתג הכיבוי עבור מערכת הזלוף.
  8. שמור את הניסוי וניתח נתונים באמצעות תוכנה קונפוקלית כמתואר בסעיף 8 להלן.
    הערה: ניתן לעצור את הניסוי בשלב זה, וניתן לבצע ניתוח מאוחר יותר. במקרה שבו תאים אינם דורשים transfection לביטוי של חלבונים של עניין, פרוטוקול זה עשוי להתבצע בכל נקודת זמן במבחנה כאשר מבקשים לבחון את הפונקציונליות של פריקה סינפטית. לאחר בדיקה של תאי בקרה כדי להבטיח פריקה סינפטית נכונה, הנסיין צריך להיות עיוור לתנאים הגנטיים או הפרמקולוגיים של כל מנה שנבדקה כדי למזער את ההטיה.

7. הדמיה פלואורסצנטית של ארעי סידן Gcamp6m

  1. נוירונים קליפת המוח מכרסמים העיקריים Transfect תרבית על מנות 35 מ"מ זכוכית התחתון עם 500 ng של Gcamp6m כפי שצוין בסעיף 3.
    הערה: אם תרצה, שיתוף transfect נוירונים עם plasmid של עניין המכיל תג פלואורסצנטי בטווח האדום או האדום הרחוק.
  2. נוירונים דגירה עם ACSF KCl נמוך במשך 15 דקות 48 שעות לאחר טרנספקטion ולאחר מכן להרכיב את המנה על פלטפורמת ההדמיה.
  3. דמיין את הפלואורסצנטיות GCaMP6m באמצעות מסנן FITC (488 ננומטר) ומטרה של 20x או 40x.
  4. בחר את שדה ההדמיה ובצע מיקוד מושלם. לאחר מכן, צלם תמונת סטילס אחת עם ערוצי סמן Brightfield, FITC ו- fluorescence כדי לסמן גבולות עצביים.
  5. הפעל הפעל כעת בתוכנת הרכישה. בצע את ההקלטה הבסיסית במשך 5 דקות, ולאחר מכן perf עם ACSF המכיל 50 mM KCL באותו אופן כפי שמתואר בסעיף 6 לניסויי צבע סטיל.
    הערה: המטרה של הדמיה זו היא למדוד חולפים סידן עורר. אם נוירון יש פעילות ירי בסיסית ושטף סידן במהלך התקופה שלפני הגירוי, הוא אינו משמש בניתוח נתונים. במקום זאת, נעשה שימוש רק בתאים עם פלואורסצנטיות רקע יציבה. תקופות לאחר גירוי ניתן גם להאריך עד 60 דקות עבור ארעי סידן, עם או בלי זלוף KCl גבוה מתמשך נוסף.
  6. שמור את הניסוי וניתח נתונים באמצעות תוכנה קונפוקלית כמתואר בסעיף 8 להלן. ניתן לעצור את הניסוי בשלב זה, ואת הניתוח ניתן לבצע מאוחר יותר.
    הערה: אם התאים אינם דורשים טרנספקטיה לביטוי חלבונים מעניינים, פרוטוקול זה עשוי להתבצע בכל נקודת זמן במבחנה כאשר מבקשים לבחון את הסידן ארעי. לאחר בדיקה של תאי בקרה כדי להבטיח מדידה של סידן ארעיים, הנסיין צריך להיות עיוור לתנאים הגנטיים או הפרמקולוגיים של כל מנה שנבדקה כדי למזער את ההטיה.

8. ניתוח תמונה

  1. פתח תמונות לשגות זמן עם תוכנה קונפוקלית.
  2. יישור תמונות בסידרה של זמן לשגות לפי סידרת הפקודות : image | עיבוד | ישר מסמך נוכחי. בחרו 'ישר למסגרת הראשונה'.
  3. בחרו אזורי עניין (ROIs) לאורך נוריטים באמצעות הכלי בחירת החזר השקעה, סמל בצורת שעועית מימין למסגרת התמונה (איור 3B). כמו כן, סמן החזר השקעה המייצג את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע.
    הערה: החזרי ההשקעה נבחרים על-ידי בחירת אזורים של פונקטה מופרדת באופן מובהק לאורך מסלולים עצביים המצוינים על-ידי תמונת הסטילס של Brightfield. לפחות חמישה החזרי השקעה לכל נוירון נבחרים לניתוח. החזר ההשקעה ברקע נבחר באזור של שדה הראייה שאינו מכיל נויטריטים.
  4. מדידת פלואורסצנטיות גולמית לאורך זמן עבור החזרי השקעה נבחרים באמצעות סדרת הפקודות הבאה: מדידת | מדידת זמן.
    1. הפעילו את הפונקציה 'מדידה ' בחלק העליון של החלונית 'מדידת זמן '. ייצוג גרפי של פלואורסצנטיות גולמית לאורך זמן (איור 3C) ונתונים כמותיים נוצרים שניהם.
      הערה: כל נקודת נתונים מייצגת את הפלואורסצנטיות הגולמית עבור החזר השקעה זה עבור המסגרת המשויכת לנקודת זמן ספציפית זו שנמדדה.
  5. יצא עוצמות פלואורסצנטיות גולמיות לתוכנת הגיליון האלקטרוני.
  6. נתח כל החזר השקעה באופן עצמאי. ראשית, נרמל נתונים על-ידי הפחתה של עוצמת ההחזר על ההשקעה ברקע מהחזר ההשקעה של עוצמת העניין בכל נקודת זמן.
    1. קח את ערך הפלואורסצנטיות הגולמי מהרקע ROI בכל נקודת זמן ספציפית והפחת זאת מהחזר ההשקעה של ערך העוצמה הגולמית של עניין בנקודת זמן זו.
      הערה: זה נעשה עבור כל תקופת ההקלטה, הן שלבי הבסיס והן של הגירוי.
  7. קבע את ההחזר הממוצע על החזר ההשקעה של עוצמת הריבית עבור 30 s האחרונים של תוכנית הבסיס.
    1. ממוצע הערכים הבסיסיים הגולמיים המנורמלים שנוצרו בשלב 8.6 מתוך 30 s האחרונים של תקופת ההקלטה הבסיסית של 3-5 דקות.
      הערה: ניתן להשתמש בכל תקופת ההקלטה הבסיסית כדי ליצור ערך זה. עם זאת, ככל שערך זה מתייצב ומתוחזק, 60 נקודות הזמן של 30 s הסופיות הן בגודל דגימה מספיק כדי לייצג את השלם.
  8. השווה ערך בסיסי זה לערך העוצמה המנורמל בכל נקודת זמן, ויצר שינוי בערך הפלואורסצנטיות (ΔF).
    1. קח את הערך משלב 8.7 והפחת את הערך הפלואורסצנטי הבסיסי הממוצע. עשה זאת ואת השלבים הבאים במשך כל תקופת ההקלטה, הן שלבי הבסיס והן של הגירוי.
  9. חשב שינוי זה לגבי ערך הפלואורסצנטיות הבסיסית, ויצר שינוי בפלואורסצנטיות/פלואורסצנטיות בסיסית (ΔF/F). לשם כך, קח את הערך משלב 8.8 וחלק אותו בערך הפלואורסצנטי הבסיסי הממוצע.
  10. לבסוף, הגדר את ערך נקודת ההתחלה ל- 1 כך שניתן יהיה להציג בקלות הגדלות או הקטנות באופן גרפי לאורך זמן.
    1. קח את הערך שנוצר בשלב 8.9 והוסף 1.
      הערה: כאשר פעולה זו נעשית כראוי, 30 s של ערכי תקופה בסיסית צריכים לרחף ליד הערך של 1. בתאים המשחררים ביעילות תוכן סינפטי, ערך זה צריך מגמה מ 1 עד 0 בעקבות תחילת הגירוי. דוגמה לשלבים 6.9 מוצגת באיור 3E.

9. ניתוח נתונים

הערה: הנסיין יכול להיות unblinded לתנאים ניסיוניים כדי לאגור נתונים לניתוח כראוי. השתמש בגודל מדגם של לפחות 10 נוירונים לכל מצב מכל אחד משלושה ניסויים עצמאיים. שקול נוירונים להכללה רק אם ניתן לייעד לפחות חמישה אזורי החזר השקעה. רמה זו של שכפול ניסיוני הספיקה במחקרים שפורסמו כדי להדגים אובדן עמוק של פריקה סינפטית בתאים המכילים פולי-GA הקשורים ל- ALS לעומת פקדי GFP (ראה תוצאות מייצגות). עם זאת, אם פנוטיפ עדין יותר הוא ציין, מספר שכפולים ביולוגיים ו/או טכניים עשוי לדרוש אופטימיזציה על ידי המשתמש.

  1. באמצעות כל ערכי ΔF/F המחושב לאורך זמן מתוך החזרי השקעה של מצב ניסיוני נתון, קבע ערך ΔF/F ממוצע עבור כל נקודת זמן יחד עם SEM.
  2. התווה נתונים באמצעות תוכנת גרפים וסטטיסטיקה בתבנית xy, כאשר x הוא הזמן שחלף, ו- y הוא הערך ΔF/F המחושב בשלב 9.1. הצג את כל הערכים כממוצע ± SEM.
  3. כדי לקבוע את המשמעות הסטטיסטית, השתמש במבחן t של התלמיד להשוואת שתי קבוצות וניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו ניתוח פוסט-הוק של Tukey להשוואת שלוש קבוצות או יותר.

תוצאות

לאחר היישום המוצלח של הפרוטוקול לעיל, תוצאות מייצגות מוצגות עבור ניסוי טיפוסי של שחרור שלפוחית סינפטית של צבע סטיירל. נוירונים קליפת המוח העיקריים חולדה מתורבתת היו טעונים בצבע בשיטה המתוארת בסעיף 6. הספציפיות של טעינת צבע נקבעה על ידי תיוג משותף עם סמן שלפוחית סינפטית סינפטופיזין. רוב הפ...

Discussion

שלושה שלבים המשותפים לשתי השיטות המתוארות הם בעלי חשיבות מכרעת להצלחה ניסיונית ולתוצאות הניתנות לכימות. ראשית, הכנת ACSF טרי לפני כל סיבוב של ניסויים היא חיונית, בעקבות ההוראות המצורפות. כישלון לעשות זאת עשוי למנוע depolarization עצבי מתאים. מדגם של נוירוני בקרה לא מטופלים צריך להיבדק כל הזמן לפני...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgements

ברצוננו להכיר לחברים בהווה ובעבר במרכז ג'פרסון ויינברג ALS למשוב קריטי והצעות למיטוב טכניקות אלה וניתוחיהן. עבודה זו נתמכה על ידי מימון של NIH (RF1-AG057882-01 ו- R21-NS0103118 ל- D.T.), NINDS (R56-NS092572 ו- R01-NS109150 ל- P.P), האגודה לניוון שרירים (D.T.), מרכז רוברט פקארד לחקר ALS (D.T.), קרן המשפחה החזקה 4 ALS וקרן משפחת פרבר (B.K.J., K.K. ו- P.P. ).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
20x air objectiveNikonFor imaging
40x oil immersion objectiveNikonFor imaging
B27 supplementThermo Scientific17504044Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mLThermo Scientific13-689-8Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hoodBakerSterilGARD III SG403AAsceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-MercaptoethanolMillipore SigmaM3148For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9418For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrateMillipore Sigma223506Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubatorThermo Scientific13-998-123For culturing and maintenance of neurons
CentrifugeEppendorf5810RFor neuronal culture preparation
Confocal microscopeNikonEclipse Ti +A1R coreFor fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD cameraPhotometricsFor image acquisition
D-GlucoseMillipore SigmaG8270Component of aCSF solutions
DNaseMillipore SigmaD5025For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley ratsCharles river400SASSDFor preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cubeNikon77032509For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dyeInvitrogenT13320For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)CellVisD35-10-1.5-NFor growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipetteGrainger52NK56For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Millipore SigmaH6648For preparing neuronal cultures
HEPESMillipore SigmaH3375Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
horse serumMillipore SigmaH1138For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hoodNUAIRENU-301-630For preparing neuronal cultures
LamininThermo Scientific23017015For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 MediumThermo Scientific11415064For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol redThermo Scientific21083027For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM)Thermo Scientific25030149Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Scientific11668019For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
Magnesium chlorideMillipore Sigma208337Component of aCSF solutions
Microsoft ExcelMicrosoftSoftware for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PESThermo Scientific565-0020Filter unit for aCSF solution
Neurobasal mediumThermo Scientific21103049For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced ResearchNikonSoftware for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubesThermo Scientific339650For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubesThermo Scientific339652For preparing neuronal culture and buffer solutions
OptiprepMillipore SigmaD1556For preparing neuronal cultures
PapainMillipore SigmaP4762For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Scientific15140122To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion systemWarner InstrumentsSF-77BFor exchange of aCSF
Perfusion tubingCole-ParmerUX-30526-14Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmidAddgene40754For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromideMillipore SigmaP7886Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chlorideMillipore SigmaP3911Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonateMillipore SigmaS5761Component of aCSF solutions
Sodium ChlorideMillipore SigmaS9888Component of aCSF solutions
Stage Top IncubatorTokai HitFor incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cubeNikon77032809For imaging FM4-64
Trypsin InhibitorMillipore SigmaT6414For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Scientific25200056For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation tableNew PortVIP320X2430-135520Table/stand for microscope

References

  1. Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16 (2015).
  5. Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
  6. Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
  7. Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
  8. Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, 1540-1550 (2008).
  9. Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
  10. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  11. Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
  12. Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
  13. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  14. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  15. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  16. Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
  17. Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
  18. Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
  19. Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
  20. Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
  21. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  22. Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
  23. Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13 (2021).
  24. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
  27. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  28. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
  29. Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
  30. Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
  31. Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle's loop. American Journal of Physiology. 268 (6), 1148-1153 (1995).
  32. Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
  33. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  34. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  37. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  38. Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
  39. Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
  40. Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
  41. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  42. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
  43. Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722 (2020).
  44. Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
  45. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  46. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113 (2017).
  47. Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
  48. Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  49. Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
  50. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  51. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  52. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
  53. Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
  54. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  55. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
  56. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  57. Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
  58. Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570 (2020).
  59. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  60. Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583 (2019).
  61. Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
  62. Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
  63. Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
  64. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  65. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427 (2017).
  66. Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
  67. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
  68. Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved