测量CD95死亡诱导信号传导复合物的组成和该复合物中Procaspase-8的处理

摘要

在这里，提出了一种实验工作流程，可以直接在死亡诱导信号复合物（DISC）上检测caspase-8处理并确定该复合物的组成。这种方法具有广泛的应用，从解开细胞死亡途径的分子机制到细胞凋亡网络的动态建模。

摘要

外源性细胞凋亡由死亡受体（DR）的激活介导，例如CD95 / Fas / APO-1或肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）受体1 /受体2（TRAIL-R1 / R2）。这些受体及其同源配体的刺激导致死亡诱导信号复合物（DISC）的组装。DISC包括DR，具有死亡结构域的适应蛋白Fas相关蛋白（FADD），procaspases-8/-10和细胞FAD样白细胞介素（IL）-1β-转化酶抑制蛋白（c-FLIP）。DISC用作procaspase-8处理和激活的平台。后者 通过其 在DISC上组装的死亡效应域（DED）细丝中的二聚/寡聚化发生。

procaspase-8的激活之后是其处理，其分几个步骤进行。在这项工作中，描述了一个已建立的实验工作流程，该工作流程允许测量DISC形成和处理该复合物中的procaspase-8。该工作流程基于免疫沉淀技术，并辅以蛋白质印迹分析。该工作流程允许仔细监测PROCASPASE-8募集到DISC及其处理的不同步骤，并且与研究外源性凋亡的分子机制高度相关。

引言

研究最好的死亡受体（DRs）之一是CD95（Fas，APO-1）。外源性凋亡途径始于DR与其同源配体的相互作用，即CD95L与CD95相互作用或TRAIL与TRAIL-Rs结合。这导致在相应的DR处形成DISC，DISC由CD95，FADD，procaspase-8 / -10和c-FLIP蛋白^1，2组成。此外，DISC是通过含死亡域（DD）的蛋白质（例如CD95和FADD）与含DED的蛋白质（例如FAD，procaspase-8 / -10和c-FLIP）之间的相互作用组装的（图1）。Procaspase-8通过其DED的结合经历寡聚化，导致DED细丝的形成，然后Procaspase-8的激活和处理。这触发了半胱天冬酶级联反应，导致细胞死亡（图1）3、4。因此，procaspase-8是由CD95或TRAIL-Rs介导的外源性凋亡途径的中枢引发子半胱天冬酶，在相应的大分子平台DISC上激活。

已知Procaspase-8的两种亚型，即procaspase-8a（p55）和-8b（p53），被招募到DISC⁵中。两种亚型均由两个DED组成。DED1和DED2位于procaspase-8a/b的N端部分，后跟催化p18和p10结构域。对procaspase-8 DEDs的详细冷冻电子显微镜（cryo-EM）分析揭示了Procaspase-8蛋白组装成称为DED细丝^4，6的丝状结构。值得注意的是，线性procaspase-8链最初被认为参与二聚化，然后在DISC处进行procaspase-8激活。现在，已知这些链只是procaspase-8 DED细丝的子结构，后者由三个链组成三个螺旋^{3，4，6，7。}

在DED灯丝处二聚化时，procaspase-8a / b的构象变化导致Procaspase-8活性中心的形成及其激活^3，8。接下来是procaspase-8处理，其通过两种途径介导:第一种途径通过p43 / p41裂解产物的产生，第二种途径通过p30裂解产物的初始产生。p43 / p41途径由Asp374处procaspase-8a / b的裂解启动，导致p43 / p41和p12裂解产物（图2）。此外，这些片段在Asp384和Asp210/216处被自催化裂解，从而形成活性半胱天冬酶-8异四聚体p10₂/p18₂9，10，11。此外，研究表明，在p43 / p41处理途径的同时，procaspase-8a / b也在Asp216处被切割，这导致形成C端裂解产物p30，然后其蛋白水解至p10和p18^10（图2）。

DED灯丝处的Procaspase-8a / b激活受到名为c-FLIPs¹²的蛋白质的严格调节。c-FLIP蛋白以三种亚型出现:c-FLIP Long（c-FLIPL），c-FLIP Short（c-FLIP_S）和c-FLIP _{Raji（c-FLIP R）。}所有三种亚型在其N端区域都包含两个DED。c-FLIP_L还具有催化非活性的半胱天冬酶样结构域12、13。c-FLIP-c-FLIP_S和c-FLIP_R的短同种型都以抗凋亡的方式通过破坏DISC 6，14，15处的DED长丝形成而起作用。此外，c-FLIP_L可以以浓度依赖性方式调节半胱天冬酶-8的活化。这可以导致促凋亡和抗凋亡作用16，17，18。通过形成催化活性的procaspase-8 / c-FLIP_L异源二聚体，c-FLIP_L导致procaspase-8活性中心的稳定及其活化。c-FLIP_L的促凋亡或抗凋亡功能直接取决于其在DED细丝上的量以及随后组装的procaspase-8 / c-FLIP_L异源二聚体¹⁹的量。DISC处的c-FLIP_L浓度低或中等浓度导致DED长丝处产生足够量的procaspase-8 / c-FLIP_L异源二聚体，这支持了Caspase-8的活化。相反，增加的c-FLIP_L量直接导致其在DISC²⁰处具有抗凋亡作用 。

综上所述，在DISC上procaspase-8a / b的激活和处理是一个高度监管的过程，涉及几个步骤。本文讨论了直接在DISC上测量procaspase-8处理以及分析该复合物的组成。这将使用CD95 DISC作为典型的DR复合物来呈现。

研究方案

T细胞实验根据伦理协议42502-2-1273 Uni MD进行。

1. 为实验准备细胞

注意:这种免疫沉淀的平均细胞数为1×10⁷_。 贴壁细胞必须在实验前一天接种，以便在实验当天有1×10^个7 个细胞。

1. 为实验准备贴壁细胞
   1. 在实验开始前一天，将10⁶ 个贴壁细胞×10个6个贴壁细胞在20 mL培养基中（参见成分 材料表 ），用于14.5cm培养皿中的每种条件。
   2. 在实验当天，确保细胞80-90%汇合并粘附在培养皿上。丢弃培养基并将新鲜培养基加入贴壁细胞中。
2. 为实验准备悬浮细胞
   1. 在实验开始之前，将1×10⁷ 个悬浮细胞小心地置于10 mL培养基（参见成分 的材料表 ）中，立即放入14.5cm培养皿中。
   2. 如果使用原代细胞，则根据先前描述的程序²¹分离原代T细胞。用1μg/ mL植物血凝素处理原代T细胞24小时，然后用25 U / mL IL2处理6天。
   3. 在实验开始之前，将1×10⁸ 个原代T细胞小心地置于10 mL培养基（参见成分 的材料表 ）中，立即放入14.5cm培养皿中。
      注意:建议使用较高数量的原代T细胞，因为这些细胞较小。

2. CD95L刺激

1. 用CD95L刺激细胞（如前所述^生产20 或市售（见 材料表））。
   注意:CD95L的浓度和刺激时间与细胞类型相关，为13，15，22，23，24，25。准备一次刺激条件两次，以产生平行的"微珠对照"样品。
   1. 用所选浓度的CD95L刺激贴壁细胞。以一定角度握住板并将配体移入培养基中，而不接触贴壁细胞。
   2. 通过将配体溶液移液到细胞悬浮液中，用CD95L刺激悬浮细胞。

3. 细胞采集和裂解

1. 将细胞皿放在冰上。
   注:请勿丢弃培养基。染色细胞漂浮在培养基中，对分析很重要。
2. 向细胞悬浮液中加入10mL冷磷酸盐缓冲盐水（PBS），并将附着的细胞从板上刮下。将细胞悬浮液收集在50 mL管中。
3. 用10 mL冷PBS洗涤细胞皿两次，并将洗涤溶液放入相同的50 mL管中。将细胞悬浮液在500×g下离心5分钟，4°C。
4. 弃去上清液并用1mL冷PBS重悬细胞沉淀。将细胞悬浮液转移到1.5mL管中。
5. 将细胞悬浮液在500×g下离心5分钟，4°C。 弃去上清液并用1mL冷PBS重悬细胞沉淀。
6. 将细胞悬浮液在500×g下离心5分钟，4°C。 弃去上清液并用1mL裂解缓冲液（含有4%蛋白酶抑制剂混合物）重悬细胞沉淀。在冰上孵育30分钟。
7. 在4°C下以最大速度（〜17，000×g）离心裂解物15分钟。
8. 将上清液（裂解物）转移到干净的管中。丢弃颗粒。在另一个管中取50μL裂解物。通过Bradford测定分析蛋白质浓度，并在小瓶中取相当于25μg蛋白质的裂解物量。将上样缓冲液（参见成分 材料表 ）加入小瓶中。将其储存在-20°C作为裂解液对照。

4. 免疫沉淀

1. 向裂解物中加入2μL抗APO-1抗体和10μL蛋白A壳葡糖珠（按制造商推荐制备）。仅将10μL微珠加入含有裂解物（刺激样品）的单独管中，以产生"微珠控制"。
   注意:使用具有宽孔的移液器吸头，方法是在处理蛋白质A壳茴素珠时切割吸头或购买IP的特殊吸头。
2. 将裂解物与抗体/蛋白质A的混合物孵育，在4°C下轻轻混合过夜。 用抗体/蛋白A琼脂糖珠在500×g下离心裂解物4分钟，4°C。 弃去上清液，向磁珠中加入1 mL冷PBS，并重复此步骤至少三次。
3. 丢弃上清液。优选用50μL汉密尔顿注射器吸出微珠。

5. 蛋白质印迹

1. 向微珠中加入20μL4x上样缓冲液（参见成分 材料表 ），并在95°C下加热10分钟。将裂解物对照组在95°C下加热5分钟。
2. 将裂解物、IP和蛋白质标准品加载到12.5%十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶上（参见凝胶制备 材料表 ），并在80 V的恒定电压下运行。
3. 将蛋白质从SDS凝胶转移到硝酸纤维素膜上。
   注意:在这里，针对感兴趣的蛋白质优化的半干技术用于12分钟（25 V; 2.5 A =常数）的转移。在蛋白质印迹之前，将硝酸纤维素膜和两个小型转印膜浸泡在电泳缓冲液中（参见成分 材料表 ，根据制造商的说明准备）几分钟。
4. 将吸墨膜放入盒子中，并在封闭溶液中阻隔1小时（0.1%吐温-20在PBS（PBST）+ 5%牛奶中）。在轻柔搅拌下用封闭溶液孵育膜。
5. 每次洗涤用PBST洗涤膜三次5分钟。

6. 蛋白质印迹检测

1. 将第一种一抗以指示的稀释液（见 材料表）加入膜中，并在4°C下孵育过夜，轻轻搅拌。
2. 每次洗涤用PBST洗涤膜三次5分钟。
3. 用20 mL二抗（在PBST + 5%牛奶中稀释1:10，000）孵育膜，在室温下轻轻摇动1小时。
4. 每次洗涤用PBST洗涤膜三次5分钟。
5. 弃去PBST，向膜中加入约1mL辣根过氧化物酶底物。
6. 检测化学发光信号（见 材料表）。
   注意:暴露时间和捕获的图像数量取决于细胞中蛋白质的量和所用抗体的特异性。对于用于检测的每种抗体，必须根据经验确定。

结果

为了分析CASPASE-8募集到DISC及其在CD95 DISC上的处理，本文描述了一种经典的工作流程，该工作流程将CD95 DISC的IP与蛋白质印迹分析相结合。这允许在DISC上检测半胱天冬酶-8激活的几个关键特征:半胱天冬酶-8激活大分子平台的组装，Procaspase-8向DISC的募集，以及该引发子半胱天冬酶的处理（图1和图2）。该工作流程涉及以时间依赖性方式用CD95L处理敏感细胞?...

讨论

这种方法首先由Kischkel等人²⁷ 描述，并从那时起由几个小组成功开发。为了在该复合物中进行有效的DISC免疫沉淀和监测半胱天冬酶-8处理，必须考虑几个重要问题。

首先，在免疫沉淀期间必须遵循所有洗涤步骤。特别重要的是琼脂糖珠的最终洗涤步骤和蜂蜡珠的干燥。必须正确完成此操作以增加免疫沉淀的信噪比，从而允许在DISC上检测caspase-8募集和处理。?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12.5% SDS gel	self made		for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED
14.5 cm cell dishes	Greiner	639160
acrylamide	Carl Roth	A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice	VWR	46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)	Used for pipetting beads to the lysate
anti-actin Ab	Sigma Aldrich	A2103	dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo	ALX-805-038-C100	used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Ab	cell signaling	9662 S	dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-242-C100	dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-961-0100	dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ADI-AAM-212-E	dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Ab	cell signaling	9542	dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APS	Carl Roth	9592.3
β-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	used according to manufacturer's instructions
CD95L	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-522-020-C005
chemoluminescence detector Chem Doc XRS+	Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	11 836 145 001	prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
eletrophoresis buffer	self made		10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage
glycine	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human(hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	for activation of T cells
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL	Bio Rad	161-0747	prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUFO500
lysis buffer	self made		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,  2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
medium for primary T cells	gibco by Life Technologie	21875034	adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
milk powder	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	self made		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk	self made		50 g milk powder + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	for activation of T Cells
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	use between 3-5 µL
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
scraper	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
shaker	Heidolph
sodium azide	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks	Bio Rad	170-4270	used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane	Bio Rad	170-4270	used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000