Composizione di misurazione del complesso di segnalazione che induce la morte CD95 ed elaborazione della procaspasi-8 in questo complesso

Riepilogo

Qui viene presentato un flusso di lavoro sperimentale che consente il rilevamento dell'elaborazione della caspasi-8 direttamente nel complesso di segnalazione che induce la morte (DISC) e determina la composizione di questo complesso. Questa metodologia ha ampie applicazioni, dallo svelamento dei meccanismi molecolari delle vie di morte cellulare alla modellazione dinamica delle reti di apoptosi.

Abstract

L'apoptosi estrinseca è mediata dall'attivazione dei recettori di morte (DR) come CD95/Fas/APO-1 o il recettore 1/recettore 2 del ligando che induce l'apoptosi correlata al fattore di necrosi tumorale (TRAIL)-recettore 2 (TRAIL-R1/R2). La stimolazione di questi recettori con i loro ligandi affini porta all'assemblaggio del complesso di segnalazione che induce la morte (DISC). DISC comprende DR, la proteina adattatrice Fas-associated protein with death domain (FADD), procaspasi-8/-10 e proteine enzima-inibitorie cellulari FADD-like (IL)-1β-converting enzyme-inibitory proteins (c-FLIP). Il DISC funge da piattaforma per l'elaborazione e l'attivazione della procaspasi-8. Quest'ultimo avviene attraverso la sua dimerizzazione / oligomerizzazione nei filamenti del dominio effettrice della morte (DED) assemblati al DISC.

L'attivazione della procaspasi-8 è seguita dalla sua elaborazione, che avviene in più passaggi. In questo lavoro, viene descritto un flusso di lavoro sperimentale stabilito che consente la misurazione della formazione di DISC e l'elaborazione della procaspasi-8 in questo complesso. Il flusso di lavoro si basa su tecniche di immunoprecipitazione supportate dall'analisi western blot. Questo flusso di lavoro consente un attento monitoraggio delle diverse fasi del reclutamento della procaspasi-8 al DISC e alla sua elaborazione ed è molto rilevante per lo studio dei meccanismi molecolari dell'apoptosi estrinseca.

Introduzione

Uno dei recettori di morte (DR) meglio studiati è CD95 (Fas, APO-1). La via apoptotica estrinseca inizia con l'interazione del DR con il suo ligando affine, cioè CD95L interagisce con CD95 o TRAIL si lega a TRAIL-R. Ciò si traduce nella formazione del DISCO al corrispondente DR. DISC costituito da CD95, FADD, procaspasi-8/-10 e proteine c-FLIP^1,2. Inoltre, il DISC è assemblato per interazioni tra proteine contenenti dominio di morte (DD), come CD95 e FADD, e proteine contenenti DED come FADD, procaspasi-8/-10 e c-FLIP (Figura 1). La procaspasi-8 subisce l'oligomerizzazione tramite associazione dei suoi DED, con conseguente formazione di filamenti DED, seguita dall'attivazione e dall'elaborazione della procaspasi-8. Questo innesca una cascata di caspasi, che porta alla morte cellulare (Figura 1)^3,4. Pertanto, la procaspasi-8 è una caspasi iniziatrice centrale della via estrinseca dell'apoptosi estrinseca mediata da CD95 o TRAIL-R, attivata alla corrispondente piattaforma macromolecolare, DISC.

Due isoforme di procaspasi-8, vale a dire procaspasi-8a (p55) e -8b (p53), sono note per essere reclutate nel DISC⁵. Entrambe le isoforme comprendono due DED. DED1 e DED2 si trovano nella parte N-terminale della procaspasi-8a/b seguita dai domini catalitici p18 e p10. L'analisi dettagliata al microscopio crioelettronico (cryo-EM) dei DED della procaspasi-8 ha rivelato l'assemblaggio delle proteine della procaspasi-8 in strutture filamentose chiamate filamenti DED^4,6. Sorprendentemente, le catene lineari di procaspasi-8 sono state inizialmente suggerite per essere impegnate nella dimerizzazione seguita dall'attivazione della procaspasi-8 al DISC. Ora, è noto che quelle catene sono solo una sottostruttura del filamento DED procaspasi-8, quest'ultimo composto da tre catene assemblate in una tripla elica^3,4,6,7.

Dopo la dimerizzazione al filamento DED, i cambiamenti conformazionali nella procaspasi-8a / b portano alla formazione del centro attivo della procaspasi-8 e alla sua attivazione^3,8. Segue la lavorazione della procaspasi-8, che è mediata da due percorsi: il primo passa attraverso la generazione di un prodotto di scissione p43/p41 e il secondo attraverso la generazione iniziale di un prodotto di scissione p30. La via p43/p41 è iniziata dalla scissione della procaspasi-8a/b ad Asp374, con conseguente scissione di p43/p41 e p12 (Figura 2). Inoltre, questi frammenti sono autocatalizzati in asp384 e Asp210/216, dando origine alla formazione dell'eterotetramero attivo caspasi-8, p10₂/p18₂^9,10,11. Inoltre, è stato dimostrato che in parallelo alla via di lavorazione p43/p41, la procaspasi-8a/b viene scissa anche ad Asp216, il che porta alla formazione del prodotto di scissione C-terminale p30, seguito dalla sua proteolisi a p10 e p18¹⁰ (Figura 2).

L'attivazione della procaspasi-8a/b al filamento DED è strettamente regolata da proteine denominate c-FLIP¹². Le proteine c-FLIP si trovano in tre isoforme: c-FLIP_Long (c-FLIP_L), c-FLIP_Short (c-FLIP_S)e c-FLIP_Raji (c-FLIP_R). Tutte e tre le isoforme contengono dueD nella loro regione N-terminale. c-FLIP_L ha anche un dominio C-terminale cataliticamente inattivo simile alla caspasi^12,13. Entrambe le isoforme corte di c-FLIP-c-FLIP_S e c-FLIP_R-agiscono in modo anti-apoptotico interrompendo la formazione di filamenti DED al DISCO^6,14,15. Inoltre, c-FLIP_L può regolare l'attivazione della caspasi-8 in modo dipendente dalla concentrazione. Ciò può comportare effetti sia pro- che anti-apoptotici^16,17,18. Formando l'eterodimero cataliticamente attivo procaspasi-8/c-FLIP_L, c-FLIP_L porta alla stabilizzazione del centro attivo della procaspasi-8 e alla sua attivazione. La funzione pro- o anti-apoptotica di c-FLIP_L dipende direttamente dalla sua quantità ai filamenti DED e dalla successiva quantità di eterodimeri assemblati di procaspasi-8/c-FLIP_L ¹⁹. Concentrazioni basse o intermedie di c-FLIP_L al DISC provocano quantità sufficienti di eterodimeri procaspasi-8/c-FLIP_L al filamento DED, che supporta l'attivazione della caspasi-8. Al contrario, l'aumento delle quantità di c-FLIP_L porta direttamente ai suoi effetti anti-apoptotici al DISC²⁰.

Nel complesso, l'attivazione e l'elaborazione della procaspasi-8a/b al DISC è un processo altamente regolamentato che coinvolge diverse fasi. Questo documento discute la misurazione dell'elaborazione della procaspasi-8 direttamente sul DISC e l'analisi della composizione di questo complesso. Questo sarà presentato utilizzando CD95 DISC come complesso DR esemplare.

Protocollo

Gli esperimenti sulle cellule T sono stati eseguiti secondo l'accordo etico 42502-2-1273 Uni MD.

1. Preparare le cellule per l'esperimento

NOTA: Il numero medio di cellule per questa immunoprecipitazione è 1 × 10⁷_. Le cellule aderenti devono essere seminate un giorno prima dell'esperimento in modo che ci siano 1 × 10⁷ cellule il giorno dell'esperimento.

1. Preparazione delle cellule aderenti per l'esperimento
   1. Seme 5-8 × 10⁶ cellule aderenti in 20 ml di mezzo (vedi la tabella dei materiali per la composizione) per ogni condizione in piatti da 14,5 cm un giorno prima dell'inizio dell'esperimento.
   2. Il giorno dell'esperimento, assicurarsi che le cellule siano confluenti all'80-90% e aderenti al piatto. Scartare il mezzo e aggiungere mezzo fresco alle cellule aderenti.
2. Preparazione delle celle di sospensione per l'esperimento
   1. Posizionare con attenzione 1 × 10⁷ celle di sospensione in 10 ml di terreno di coltura (vedere la Tabella dei materiali per la composizione) per condizione in piatti da 14,5 cm immediatamente prima dell'inizio dell'esperimento.
   2. Se si utilizzano cellule primarie, isolare le cellule T primarie secondo la procedura precedentemente descritta²¹. Trattare le cellule T primarie con 1 μg/mL di fitoemoagglutinina per 24 ore, seguite da 25 U/mL di trattamento IL2 per 6 giorni.
   3. Posizionare con attenzione 1 × 10⁸ cellule T primarie in 10 ml di terreno di coltura (vedere la tabella dei materiali per la composizione) per condizione in piatti da 14,5 cm immediatamente prima dell'inizio dell'esperimento.
      NOTA: si raccomanda questo numero maggiore di cellule T primarie, poiché queste cellule sono più piccole.

2. Stimolazione CD95L

1. Stimolare le cellule con CD95L (prodotto come descritto in precedenza²⁰ o disponibile in commercio (vedi la Tabella dei materiali)).
   NOTA: La concentrazione del CD95L e il tempo di stimolazione dipendono dal tipo cellulare^{13,15,22,23,24,25.} Preparare una condizione di stimolazione due volte per generare un campione di "controllo delle perline" in parallelo.
   1. Stimolare le cellule aderenti con la concentrazione selezionata di CD95L. Tenere la piastra ad angolo e pipettare il ligando nel mezzo senza toccare le cellule aderenti.
   2. Stimolare le cellule in sospensione con CD95L pipettando la soluzione di ligando nella sospensione cellulare.

3. Raccolta cellulare e lisi

1. Mettere le piastre cellulari sul ghiaccio.
   NOTA: non scartare il supporto. Le cellule morenti galleggiano nel mezzo e sono importanti per l'analisi.
2. Aggiungere 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS) alla sospensione cellulare e raschiare le cellule attaccate dalla piastra. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 50 ml.
3. Lavare la capsula cellulare con 10 mL di PBS freddo due volte e posizionare la soluzione di lavaggio nello stesso tubo da 50 ml. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min, 4 °C.
4. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet cellulare con 1 mL di PBS freddo. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 ml.
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min, 4 °C. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet cellulare con 1 mL di PBS freddo.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min, 4 °C. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet cellulare con 1 mL di tampone di lisi (contenente il 4% di cocktail inibitore della proteasi). Incubarlo per 30 minuti sul ghiaccio.
7. Centrifugare il lisato alla massima velocità (~17.000 × g)per 15 min, 4 °C.
8. Trasferire il surnatante (lisato) in un tubo pulito. Scartare il pellet. Prendere 50 μL del lisato in un altro tubo. Analizzare la concentrazione proteica mediante il test bradford e prelevare la quantità di lisato corrispondente a 25 μg di proteine in una fiala. Aggiungere il buffer di carico (vedere la tabella dei materiali per la composizione) al flaconcino. Conservare a -20 °C come controllo lisato.

4. Immunoprecipitazione (IP)

1. Aggiungere 2 μL di anticorpi anti-APO-1 e 10 μL di perline di sefarosio della proteina A (preparate come raccomandato dal produttore) al lisato. Aggiungere solo 10 μL di perline a un tubo separato contenente lisato (campione stimolato) per generare un "controllo delle perline".
   NOTA: utilizzare punte di pipetta con orifizi larghi tagliando le punte o acquistando punte speciali per IP durante la manipolazione delle perle di sefarosio della proteina A.
2. Incubare la miscela di lisato con anticorpi/perline di sefarosio della proteina A con una miscelazione delicata durante la notte a 4 °C. Centrifugare i lisati con anticorpi/proteine A perline di sefarosio a 500 × g per 4 min, 4 °C. Scartare il surnatante, aggiungere 1 ml di PBS freddo alle perline e ripetere questo passaggio almeno tre volte.
3. Scartare il surnatante. Aspirare le perline preferibilmente con una siringa Hamilton da 50 μL.

5. Macchia occidentale

1. Aggiungere 20 μL di tampone di carico 4x (vedere la tabella dei materiali per la composizione) alle perline e riscaldare a 95 °C per 10 min. Riscaldare i controlli lisati a 95 °C per 5 min.
2. Caricare i lisati, gli IP e uno standard proteico su un gel di dodecil solfato di sodio (SDS) al 12,5% (vedere la tabella dei materiali per la preparazione del gel) ed eseguire con una tensione costante di 80 V.
3. Trasferire le proteine dal gel SDS a una membrana di nitrocellulosa.
   NOTA: Qui, la tecnica semi-secca, ottimizzata per le proteine di interesse, è stata utilizzata per il trasferimento oltre 12 min (25 V; 2,5 A = costante). Immergere la membrana di nitrocellulosa e due pile di trasferimento mini-size nel tampone di elettroforesi (vedere la tabella dei materiali per la composizione, preparare secondo le istruzioni del produttore) per alcuni minuti prima del western blotting.
4. Posizionare la membrana cancellata in una scatola e bloccarla per 1 ora in soluzione bloccante (0,1% Tween-20 in PBS (PBST) + 5% latte). Incubare la membrana con la soluzione bloccante sotto agitazione delicata.
5. Lavare la membrana tre volte con PBST per 5 minuti ogni lavaggio.

6. Rilevamento western blot

1. Aggiungere il primo anticorpo primario alla diluizione indicata (vedere la Tabella dei materiali)alla membrana e incubarlo durante la notte a 4 °C con una delicata agitazione.
2. Lavare la membrana tre volte con PBST per 5 minuti ogni lavaggio.
3. Incubare la membrana con 20 ml di anticorpo secondario (diluito 1:10.000 in PBST + 5% latte) con un delicato scuotimento per 1 ora a temperatura ambiente.
4. Lavare la membrana tre volte con PBST per 5 minuti ogni lavaggio.
5. Eliminare pbST e aggiungere circa 1 mL di substrato di perossidasi di rafano alla membrana.
6. Rilevare il segnale chemioluminescente (vedi la Tabella dei Materiali).
   NOTA: Il tempo di esposizione e il numero di immagini catturate dipendono dalla quantità di proteine nella cellula e dalla specificità degli anticorpi utilizzati. Deve essere stabilito empiricamente per ciascun anticorpo utilizzato per la rilevazione.

Risultati

Per analizzare il reclutamento della caspasi-8 nel DISC e la sua elaborazione nel CD95 DISC, questo documento descrive un flusso di lavoro classico, che combina l'IP del CD95 DISC con l'analisi western blot. Ciò consente il rilevamento di diverse caratteristiche chiave dell'attivazione della caspasi-8 al DISC: l'assemblaggio della piattaforma macromolecolare attivante la caspasi-8, il reclutamento della procaspasi-8 al DISC e l'elaborazione di questa caspasi iniziatore (Figura 1 e

Discussione

Questo approccio è stato descritto per la prima volta da Kischkel et al.²⁷ e da allora è stato sviluppato con successo da diversi gruppi. Diverse questioni importanti devono essere considerate per un'efficiente elaborazione disc-immunoprecipitazione e monitoraggio della caspasi-8 in questo complesso.

In primo luogo, è essenziale seguire tutte le fasi di lavaggio durante l'immunoprecipitazione. Particolarmente importanti sono le fasi finali di lavaggio delle perle di ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
12.5% SDS gel	self made		for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED
14.5 cm cell dishes	Greiner	639160
acrylamide	Carl Roth	A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice	VWR	46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)	Used for pipetting beads to the lysate
anti-actin Ab	Sigma Aldrich	A2103	dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo	ALX-805-038-C100	used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Ab	cell signaling	9662 S	dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-242-C100	dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-961-0100	dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ADI-AAM-212-E	dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Ab	cell signaling	9542	dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APS	Carl Roth	9592.3
β-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	used according to manufacturer's instructions
CD95L	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-522-020-C005
chemoluminescence detector Chem Doc XRS+	Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	11 836 145 001	prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
eletrophoresis buffer	self made		10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage
glycine	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human(hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	for activation of T cells
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL	Bio Rad	161-0747	prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUFO500
lysis buffer	self made		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,  2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
medium for primary T cells	gibco by Life Technologie	21875034	adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
milk powder	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	self made		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk	self made		50 g milk powder + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	for activation of T Cells
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	use between 3-5 µL
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
scraper	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
shaker	Heidolph
sodium azide	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks	Bio Rad	170-4270	used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane	Bio Rad	170-4270	used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000