Messung der Zusammensetzung von CD95 Death-Inducing Signaling Complex und Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex

Zusammenfassung

Hier wird ein experimenteller Workflow vorgestellt, der den Nachweis der Caspase-8-Verarbeitung direkt am todesinduzierenden Signalkomplex (DISC) ermöglicht und die Zusammensetzung dieses Komplexes bestimmt. Diese Methodik hat breite Anwendungen, von der Entschlüsselung der molekularen Mechanismen von Zelltodwegen bis hin zur dynamischen Modellierung von Apoptose-Netzwerken.

Zusammenfassung

Die extrinsische Apoptose wird durch die Aktivierung von Todesrezeptoren (DRs) wie CD95/Fas/APO-1 oder Tumornekrosefaktor-bedingtem Apoptose-induzierendem Liganden (TRAIL)-Rezeptor 1/Rezeptor 2 (TRAIL-R1/R2) vermittelt. Die Stimulation dieser Rezeptoren mit ihren verwandten Liganden führt zum Aufbau des todinduzierenden Signalkomplexes (DISC). DISC umfasst DR, das Adapterprotein Fas-assoziiertes Protein mit Todesdomäne (FADD), Procaspasen-8/-10 und zelluläre FADD-ähnliche Interleukin (IL)-1β-converting enzyme-inhibitory proteins (c-FLIPs). Die DISC dient als Plattform für die Procaspase-8-Verarbeitung und -Aktivierung. Letzteres geschieht durch seine Dimerisierung / Oligomerisierung in den an der DISC zusammengesetzten Filamenten der Death Effector Domain (DED).

Auf die Aktivierung von Procaspase-8 folgt seine Verarbeitung, die in mehreren Schritten erfolgt. In dieser Arbeit wird ein etablierter experimenteller Workflow beschrieben, der die Messung der DISC-Bildung und die Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex ermöglicht. Der Workflow basiert auf Immunpräzipitationstechniken, die durch die Western-Blot-Analyse unterstützt werden. Dieser Workflow ermöglicht eine sorgfältige Überwachung verschiedener Schritte der Procaspase-8-Rekrutierung in die DISC und ihrer Verarbeitung und ist für die Untersuchung molekularer Mechanismen der extrinsischen Apoptose von hoher Relevanz.

Einleitung

Einer der am besten untersuchten Todesrezeptoren (DRs) ist CD95 (Fas, APO-1). Der extrinsische apoptotische Signalweg beginnt mit der Interaktion des DR mit seinem verwandten Liganden, d.h. CD95L interagiert mit CD95 oder TRAIL bindet an TRAIL-Rs. Dies führt zur Bildung der DISC an der entsprechenden DR. DISC besteht aus CD95, FADD, Procaspase-8/-10 und c-FLIP Proteinen^1,2. Darüber hinaus wird die DISC durch Wechselwirkungen zwischen Death Domain (DD)-haltigen Proteinen wie CD95 und FADD und DED-haltigen Proteinen wie FADD, Procaspase-8/-10 und c-FLIP zusammengesetzt (Abbildung 1<....

Protokoll

T-Zell-Experimente wurden gemäß der ethischen Vereinbarung 42502-2-1273 Uni MD durchgeführt.

1. Zellen für das Experiment vorbereiten

HINWEIS: Die durchschnittliche Anzahl der Zellen für diese Immunpräzipitation beträgt 1 × 10⁷_. Adhärente Zellen müssen einen Tag vor dem Experiment ausgesät werden, so dass es am Tag des Experiments 1 ×^{10 7} Zellen gibt.

1. Adhärenzzellen für das Experiment vorbereiten
   1. Samen Sie 5-8 × 10⁶ adhärente Zellen in 20 ml Medium (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung) für jede Bedingung in 14,5 cm Schalen e....

Ergebnisse

Um die Caspase-8-Rekrutierung auf die DISC und deren Verarbeitung an der CD95 DISC zu analysieren, beschreibt dieses Papier einen klassischen Workflow, der IP der CD95 DISC mit Western-Blot-Analyse kombiniert. Dies ermöglicht den Nachweis mehrerer Schlüsselmerkmale der Caspase-8-Aktivierung an der DISC: die Montage der Caspase-8-aktivierenden makromolekularen Plattform, die Rekrutierung von Procaspase-8 in die DISC und die Verarbeitung dieser Initiator-Caspase (Abbildung 1 und

Diskussion

Dieser Ansatz wurde erstmals von Kischkel et al.²⁷ beschrieben und seitdem von mehreren Gruppen erfolgreich entwickelt. Für eine effiziente DISC-Immunpräzipitation und überwachung der Caspase-8-Verarbeitung in diesem Komplex müssen mehrere wichtige Aspekte berücksichtigt werden.

Erstens ist es wichtig, alle Waschschritte während der Immunpräzipitation zu befolgen. Besonders wichtig sind die letzten Waschschritte der Sepharoseperlen und das Trocknen der Sepharosep.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12.5% SDS gel	self made		for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED
14.5 cm cell dishes	Greiner	639160
acrylamide	Carl Roth	A124.1
anti-actin Ab	Sigma Aldrich	A2103	dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo	ALX-805-038-C100	used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Ab	cell signaling	9662 S	dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-242-C100	dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-961-0100	dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ADI-AAM-212-E	dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Ab	cell signaling	9542	dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APS	Carl Roth	9592.3
β-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	used according to manufacturer's instructions
CD95L	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-522-020-C005
chemoluminescence detector Chem Doc XRS+	Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	11 836 145 001	prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
eletrophoresis buffer	self made		10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage
glycine	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b	SouthernBiotech	1090-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human(hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	for activation of T cells
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL	Bio Rad	161-0747	prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUFO500
lysis buffer	self made		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,  2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
medium for primary T cells	gibco by Life Technologie	21875034	adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
milk powder	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	self made		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk	self made		50 g milk powder + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	for actavation of T ells
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	use between 3-5 µL
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
scraper	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
shaker	Heidolph
sodium azide	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks	Bio Rad	170-4270	used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane	Bio Rad	170-4270	used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000