Medición de la composición del complejo de señalización inductor de muerte CD95 y procesamiento de la procaspasa-8 en este complejo

Resumen

Aquí, se presenta un flujo de trabajo experimental que permite la detección del procesamiento de caspasa-8 directamente en el complejo de señalización inductor de muerte (DISC) y determina la composición de este complejo. Esta metodología tiene amplias aplicaciones, desde desentrañar los mecanismos moleculares de las vías de muerte celular hasta el modelado dinámico de las redes de apoptosis.

Resumen

La apoptosis extrínseca está mediada por la activación de receptores de muerte (DR) como CD95 / Fas / APO-1 o ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL) receptor 1 / receptor 2 (TRAIL-R1 / R2). La estimulación de estos receptores con sus ligandos cognados conduce al ensamblaje del complejo de señalización inductor de muerte (DISC). DISC comprende DR, la proteína adaptadora asociada a Fas con dominio de la muerte (FADD), procaspasas-8/-10 y proteínas inhibidoras de enzimas convertidoras de interleucina (IL)-1β similares a FADD celulares (c-FLP). El DISC sirve como plataforma para el procesamiento y la activación de la procaspasa-8. Este último ocurre a través de su dimerización/oligomerización en los filamentos del dominio efector de la muerte (DED) ensamblados en el DISC.

La activación de la procaspasa-8 es seguida por su procesamiento, que ocurre en varios pasos. En este trabajo se describe un flujo de trabajo experimental establecido que permite la medición de la formación de DISC y el procesamiento de la procaspasa-8 en este complejo. El flujo de trabajo se basa en técnicas de inmunoprecipitación apoyadas por el análisis de western blot. Este flujo de trabajo permite un seguimiento cuidadoso de los diferentes pasos del reclutamiento de la procaspasa-8 para el DISC y su procesamiento y es muy relevante para investigar los mecanismos moleculares de la apoptosis extrínseca.

Introducción

Uno de los receptores de muerte (DR) mejor estudiados es CD95 (Fas, APO-1). La vía apoptótica extrínseca comienza con la interacción de la DR con su ligando cognado, es decir, CD95L interactúa con CD95 o TRAIL se une a TRAIL-Rs. Esto da como resultado la formación del DISC en el DR. DISC correspondiente consiste en cd95, FADD, procaspasa-8/-10 y proteínas c-FLIP^1,2. Además, el DISC se ensambla mediante interacciones entre proteínas que contienen dominio de muerte (DD), como CD95 y FADD, y proteínas que contienen DED como FADD, procaspasa-8/-10 y c-FLIP(Figura 1). La procaspasa-8 sufre oligomerización a través de la asociación de sus DED, lo que resulta en la formación de filamentos DED, seguidos de la activación y el procesamiento de la procaspasa-8. Esto desencadena una cascada de caspasa, que conduce a la muerte celular(Figura 1)^3,4. Así, la procaspasa-8 es una caspasa iniciadora central de la vía de apoptosis extrínseca mediada por CD95 o el TRAIL-R, activada en la plataforma macromolecular correspondiente, DISC.

Se sabe que dos isoformas de la procaspasa-8, a saber, la procaspasa-8a (p55) y la -8b (p53), se reclutan para el DISC^5. Ambas isoformas comprenden dos DED. DED1 y DED2 se encuentran en la parte N-terminal de la procaspasa-8a/b seguida de los dominios catalítico p18 y p10. El análisis detallado de microscopía crioelectrónica (crio-EM) de los DED de procaspasa-8 reveló el ensamblaje de proteínas de procaspasa-8 en estructuras filamentosas llamadas filamentos DED^4,6. Sorprendentemente, inicialmente se sugirió que las cadenas lineales de procaspasa-8 participaran en la dimerización seguida de la activación de la procaspasa-8 en el DISC. Ahora bien, se sabe que esas cadenas son sólo una subestructura del filamento DED procaspasa-8, este último compuesto por tres cadenas ensambladas en una triple hélice^3,4,6,7.

Tras la dimerización en el filamento DED, los cambios conformacionales en la procaspasa-8a/b conducen a la formación del centro activo de la procaspasa-8 y su activación^3,8. Esto es seguido por el procesamiento de la procaspasa-8, que está mediado por dos vías: la primera va a través de la generación de un producto de escisión p43 / p41 y la segunda a través de la generación inicial de un producto de escisión p30. La vía p43/p41 se inicia por la escisión de la procaspasa-8a/b en Asp374, dando como resultado productos de escisión p43/p41 y p12 (Figura 2). Además, estos fragmentos se escindieron autocatalíticamente en Asp384 y Asp210/216, dando lugar a la formación del heterotetrámero activo caspasa-8, p10₂/ p18₂^9,10,11. Además, se demostró que en paralelo a la vía de procesamiento p43/p41, la procaspasa-8a/b también se escinde en Asp216, lo que conduce a la formación del producto de escisión C-terminal p30, seguido de su proteólisis a p10 y p18¹⁰ (Figura 2).

La activación de la procaspasa-8a/b en el filamento DED está estrictamente regulada por proteínas llamadas c-FLIPs^12. Las proteínas c-FLIP se encuentran en tres isoformas: c-FLIP_Long (c-FLIP_L),c-FLIP_Short (c-FLIP_S)y c-FLIP_Raji (c-FLIP_R). Las tres isoformas contienen dos DED en su región N-terminal. c-FLIP_L también tiene un dominio similar a la caspasa catalíticamente inactivo C-terminal^12,13. Ambas isoformas cortas de c-FLIP-c-FLIP_S y c-FLIP_R-actúande manera antiapoptótica al interrumpir la formación de filamentos DED en el DISC^6,14,15. Además, c-FLIP_L puede regular la activación de la caspasa-8 de una manera dependiente de la concentración. Esto puede resultar en efectos pro- y anti-apoptóticos^16,17,18. Al formar el heterodímero de procaspasa-8/c-FLIP_L catalíticamente activo, c-FLIP_L conduce a la estabilización del centro activo de la procaspasa-8 y su activación. La función pro- o anti-apoptótica de c-FLIP_L depende directamente de su cantidad en los filamentos DED y la cantidad posterior de heterodímeros de procaspasa-8/c-FLIP_L ensamblados¹⁹. Las concentraciones bajas o intermedias de c-FLIP_L en el DISC dan como resultado cantidades suficientes de heterodímeros de procaspasa-8/c-FLIP_L en el filamento DED, que apoya la activación de la caspasa-8. En contraste, el aumento de las cantidades de c-FLIP_L conduce directamente a sus efectos antiapoptóticos en el DISC^20.

En conjunto, la activación y el procesamiento de la procaspasa-8a / b en el DISC es un proceso altamente regulado que implica varios pasos. Este artículo discute la medición del procesamiento de la procaspasa-8 directamente en el DISC, así como el análisis de la composición de este complejo. Esto se presentará utilizando CD95 DISC como el complejo de DR ejemplar.

Protocolo

Los experimentos con células T se realizaron de acuerdo con el acuerdo ético 42502-2-1273 Uni MD.

1. Preparación de células para el experimento

NOTA: El número promedio de células para esta inmunoprecipitación es de 1 × 10⁷_. Las células adherentes tienen que ser sembradas un día antes del experimento para que haya 1 × 10⁷ células el día del experimento.

1. Preparación de células adherentes para el experimento
   1. Sembra 5-8 × 10⁶ células adherentes en 20 mL de medio (ver la Tabla de Materiales para la composición) para cada condición en platos de 14,5 cm un día antes de que comience el experimento.
   2. El día del experimento, asegúrese de que las células sean 80-90% confluentes y adherentes al plato. Deseche el medio y agregue medio fresco a las células adherentes.
2. Preparación de células de suspensión para el experimento
   1. Coloque cuidadosamente 1 × 10⁷ celdas de suspensión en 10 ml de medio de cultivo (consulte la Tabla de materiales para la composición) por condición en platos de 14,5 cm inmediatamente antes de que comience el experimento.
   2. Si utiliza células primarias, aísle las células T primarias de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente²¹. Tratar las células T primarias con 1 μg/ml de fitohemaglutinina durante 24 h, seguido de 25 U/ml de IL2 durante 6 días.
   3. Coloque cuidadosamente 1 × 10⁸ células T primarias en 10 ml de medio de cultivo (consulte la Tabla de materiales para la composición) por condición en platos de 14,5 cm inmediatamente antes de que comience el experimento.
      NOTA: Se recomienda este mayor número de células T primarias, ya que estas células son más pequeñas.

2. Estimulación CD95L

1. Estimular las células con CD95L (producido como se describió anteriormente²⁰ o disponible comercialmente (ver la Tabla de Materiales)).
   NOTA: La concentración de la CD95L y el tiempo de estimulación son de tipo celular^{dependientes 13,15,22,23,24,25.} Prepare una condición de estimulación dos veces para generar una muestra de "control de cuentas" en paralelo.
   1. Estimular las células adherentes con la concentración seleccionada de CD95L. Sostenga la placa en ángulo y pipetee el ligando en el medio sin tocar las células adherentes.
   2. Estimular las células de suspensión con CD95L pipeteando la solución de ligando en la suspensión celular.

3. Cosecha celular y lisis

1. Coloque los platos celulares sobre hielo.
   NOTA: No descarte el medio. Las células moribundas flotan en el medio y son importantes para el análisis.
2. Agregue 10 ml de solución salina tamponada con fosfato frío (PBS) a la suspensión celular y raspe las células adheridas de la placa. Recoger la suspensión celular en un tubo de 50 ml.
3. Lave el plato celular con 10 ml de PBS frío dos veces y coloque la solución de lavado en el mismo tubo de 50 ml. Centrifugar la suspensión celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C.
4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 1 ml de PBS frío. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml.
5. Centrifugar la suspensión celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 1 ml de PBS frío.
6. Centrifugar la suspensión celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular con 1 ml de tampón de lisis (que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa al 4%). Incubarlo durante 30 min sobre hielo.
7. Centrifugar el lisado a velocidad máxima (~17.000 × g)durante 15 min, 4 °C.
8. Transfiera el sobrenadante (lisado) a un tubo limpio. Deseche el pellet. Tome 50 μL del lisado en otro tubo. Analizar la concentración de proteínas mediante ensayo de Bradford y tomar la cantidad de lisado correspondiente a 25 μg de proteína en un vial. Agregue un tampón de carga (consulte la Tabla de materiales para la composición) al vial. Guárdelo a -20 °C como control de lisado.

4. Inmunoprecipitación (IP)

1. Añadir 2 μL de anticuerpos anti-APO-1 y 10 μL de perlas de sefarosa de proteína A (preparadas según lo recomendado por el fabricante) al lisado. Agregue solo 10 μL de las perlas a un tubo separado que contenga lisado (muestra estimulada) para generar un "control de cuentas".
   NOTA: Use puntas de pipeta con orificios anchos, ya sea cortando las puntas o comprando puntas especiales para IP mientras manipula las cuentas de sefalrosa de proteína A.
2. Incubar la mezcla de lisado con anticuerpos/perlas de sefalrosa de proteína A con una mezcla suave durante la noche a 4 °C. Centrifugar los lisados con anticuerpos/perlas de sefalrosa de proteína A a 500 × g durante 4 min, 4 °C. Deseche el sobrenadante, agregue 1 ml de PBS frío a las perlas y repita este paso al menos tres veces.
3. Deseche el sobrenadante. Aspire las perlas preferiblemente con una jeringa Hamilton de 50 μL.

5. Western blot

1. Agregue 20 μL de tampón de carga 4x (consulte la Tabla de materiales para la composición) a las perlas y caliente a 95 ° C durante 10 min. Calentar los controles de lisado a 95 °C durante 5 min.
2. Cargue los lisados, las IP y un estándar de proteínas en un gel de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 12.5% (consulte la Tabla de materiales para la preparación del gel) y funcione con un voltaje constante de 80 V.
3. Transfiera las proteínas del gel SDS a una membrana de nitrocelulosa.
   NOTA: Aquí, se utilizó la técnica semiseca, optimizada para las proteínas de interés, para la transferencia durante 12 min (25 V; 2.5 A = constante). Remoje la membrana de nitrocelulosa y dos pilas de transferencia de tamaño mini en tampón de electroforesis (consulte la Tabla de materiales para la composición, prepárese de acuerdo con las instrucciones del fabricante) durante unos minutos antes de la eliminación de manchas occidentales.
4. Coloque la membrana separada en una caja y bloquéela durante 1 h en solución de bloqueo (0.1% Tween-20 en PBS (PBST) + 5% leche). Incubar la membrana con la solución de bloqueo bajo agitación suave.
5. Lave la membrana tres veces con PBST durante 5 minutos cada lavado.

6. Detección de Western blot

1. Añadir el primer anticuerpo primario en la dilución indicada (ver la Tabla de Materiales)a la membrana e incubarlo durante la noche a 4 °C con agitación suave.
2. Lave la membrana tres veces con PBST durante 5 minutos cada lavado.
3. Incubar la membrana con 20 ml de anticuerpo secundario (diluido 1:10.000 en PBST + 5% de leche) con agitación suave durante 1 h a temperatura ambiente.
4. Lave la membrana tres veces con PBST durante 5 minutos cada lavado.
5. Deseche pbST y agregue aproximadamente 1 ml de sustrato de peroxidasa de rábano picante a la membrana.
6. Detectar la señal quimioluminiscente (ver la Tabla de Materiales).
   NOTA: El tiempo de exposición y el número de imágenes capturadas dependen de la cantidad de proteína en la célula y la especificidad de los anticuerpos utilizados. Debe establecerse empíricamente para cada anticuerpo utilizado para la detección.

Resultados

Para analizar el reclutamiento de caspasa-8 para el DISC y su procesamiento en el DISC CD95, este documento describe un flujo de trabajo clásico, que combina IP del DISC CD95 con análisis de western blot. Esto permite la detección de varias características clave de la activación de la caspasa-8 en el DISC: el ensamblaje de la plataforma macromolecular activadora de la caspasa-8, el reclutamiento de procaspasa-8 en el DISC y el procesamiento de esta caspasa iniciadora(Figura 1 y

Discusión

Este enfoque fue descrito por primera vez por Kischkel et al.²⁷ y ha sido desarrollado con éxito desde entonces por varios grupos. Se deben considerar varias cuestiones importantes para la eficiencia de la inmunoprecipitación DISC y el monitoreo del procesamiento de la caspasa-8 en este complejo.

En primer lugar, es esencial seguir todos los pasos de lavado durante la inmunoprecipitación. Especialmente importantes son los pasos finales de lavado de las cuentas de sef...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12.5% SDS gel	self made		for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED
14.5 cm cell dishes	Greiner	639160
acrylamide	Carl Roth	A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice	VWR	46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)	Used for pipetting beads to the lysate
anti-actin Ab	Sigma Aldrich	A2103	dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo	ALX-805-038-C100	used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Ab	cell signaling	9662 S	dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-242-C100	dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-961-0100	dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ADI-AAM-212-E	dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Ab	cell signaling	9542	dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APS	Carl Roth	9592.3
β-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	used according to manufacturer's instructions
CD95L	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-522-020-C005
chemoluminescence detector Chem Doc XRS+	Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	11 836 145 001	prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
eletrophoresis buffer	self made		10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage
glycine	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human(hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	for activation of T cells
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL	Bio Rad	161-0747	prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUFO500
lysis buffer	self made		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,  2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
medium for primary T cells	gibco by Life Technologie	21875034	adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
milk powder	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	self made		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk	self made		50 g milk powder + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	for activation of T Cells
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	use between 3-5 µL
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
scraper	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
shaker	Heidolph
sodium azide	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks	Bio Rad	170-4270	used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane	Bio Rad	170-4270	used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000