Mesure de la composition du complexe de signalisation induisant la mort CD95 et traitement de la procaspase-8 dans ce complexe

Résumé

Ici, un flux de travail expérimental est présenté qui permet la détection du traitement de la caspase-8 directement au niveau du complexe de signalisation induisant la mort (DISC) et détermine la composition de ce complexe. Cette méthodologie a de vastes applications, allant du démêlage des mécanismes moléculaires des voies de mort cellulaire à la modélisation dynamique des réseaux d’apoptose.

Résumé

L’apoptose extrinsèque est médiée par l’activation de récepteurs de la mort (DR) tels que CD95 / Fas / APO-1 ou le récepteur 1 / récepteur 2 induit par le facteur de nécrose tumorale (TRAIL-R1 / R2). La stimulation de ces récepteurs avec leurs ligands apparentés conduit à l’assemblage du complexe de signalisation induisant la mort (DISC). DISC comprend DR, la protéine adaptatrice Fas-associated protein with death domain (FADD), procaspases-8/-10, et cellular FADD-like interleukin (IL)-1β-converting enzyme-inhibitory proteins (c-FLIPs). Le DISC sert de plate-forme pour le traitement et l’activation de la procaspase-8. Ce dernier se produit via sa dimérisation/oligomérisation dans les filaments du domaine effecteur de la mort (DED) assemblés au DISC.

L’activation de la procaspase-8 est suivie de son traitement, qui se produit en plusieurs étapes. Dans ce travail, un flux de travail expérimental établi est décrit qui permet la mesure de la formation de DISC et le traitement de la procaspase-8 dans ce complexe. Le flux de travail est basé sur des techniques d’immunoprécipitation soutenues par l’analyse par transfert Western. Ce flux de travail permet une surveillance attentive des différentes étapes du recrutement de la procaspase-8 dans le DISC et son traitement et est très pertinent pour étudier les mécanismes moléculaires de l’apoptose extrinsèque.

Introduction

L’un des récepteurs de la mort (DR) les mieux étudiés est CD95 (Fas, APO-1). La voie apoptotique extrinsèque commence par l’interaction du DR avec son ligand apparenté, c’est-à-dire que CD95L interagit avec CD95 ou que TRAIL se lie à TRAIL-R. Il en résulte la formation du DISC au DR. DISC correspondant se compose de CD95, FADD, procaspase-8/-10 et c-FLIP protéines^1,2. En outre, le DISC est assemblé par des interactions entre des protéines contenant du domaine de la mort (DD), telles que CD95 et FADD, et des protéines contenant de la DED telles que FADD, procaspase-8/-10 et c-FLIP(Figure 1). La procaspase-8 subit une oligomérisation par association de ses DED, entraînant la formation de filaments de DED, suivie de l’activation et du traitement de la procaspase-8. Cela déclenche une cascade de caspases, qui conduit à la mort cellulaire (Figure 1)^3,4. Ainsi, la procaspase-8 est une caspase initiatrice centrale de la voie d’apoptose extrinsèque médiée par CD95 ou le TRAIL-R, activée à la plateforme macromoléculaire correspondante, DISC.

Deux isoformes de la procaspase-8, à savoir la procaspase-8a (p55) et la -8b (p53), sont connues pour être recrutées au DISC^5. Les deux isoformes comprennent deux DED. DED1 et DED2 sont situés dans la partie N-terminale de la procaspase-8a/b suivie des domaines catalytiques p18 et p10. L’analyse détaillée par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) des DED procaspase-8 a révélé l’assemblage de protéines procaspase-8 dans des structures filamenteuses appelées filaments DED^4,6. Remarquablement, les chaînes linéaires de procaspase-8 ont d’abord été suggérées pour être engagées dans la dimérisation suivie de l’activation de la procaspase-8 au DISC. Or, on sait que ces chaînes ne sont qu’une sous-structure du filament DED procaspase-8, ce dernier comprenant trois chaînes assemblées en une triple hélice^3,4,6,7.

Lors de la dimérisation au niveau du filament DED, des changements conformationnels dans la procaspase-8a/b conduisent à la formation du centre actif de la procaspase-8 et à son activation^3,8. Vient ensuite le traitement de la procaspase-8, qui est médié par deux voies : la première passe par la génération d’un produit de clivage p43/p41 et la seconde par la génération initiale d’un produit de clivage p30. La voie p43/p41 est initiée par le clivage de la procaspase-8a/b à Asp374, ce qui donne des produits de clivage p43/p41 et p12(Figure 2). De plus, ces fragments sont auto-catalytiquement clivés à Asp384 et Asp210/216, donnant lieu à la formation de l’hétérotétramère actif de la caspase-8, p10₂/p18₂^9,10,11. En outre, il a été démontré que, parallèlement à la voie de traitement p43/p41, la procaspase-8a/b est également clivée à Asp216, ce qui conduit à la formation du produit de clivage terminal C p30, suivi de sa protéolyse à p10 et p18¹⁰ (Figure 2).

L’activation de la procaspase-8a/b au niveau du filament DED est strictement régulée par des protéines nommées c-FLIPs^12. Les protéines c-FLIP se présentent sous trois isoformes : c-FLIP_Long (c-FLIP_L),c-FLIP_Short (c-FLIP_S)et c-FLIP_Raji (c-FLIP_R). Les trois isoformes contiennent deux DED dans leur région N-terminale. c-FLIP_L a également un C-terminal catalytiquement inactif caspase-like domaine^12,13. Les deux isoformes courtes de c-FLIP-c-FLIP_S et c-FLIP_R-agissent de manière anti-apoptotique en perturbant la formation de filaments DED au NIVEAU DU DISC^6,14,15. De plus, c-FLIP L peut réguler_{l’activation} de la caspase-8 en fonction de la concentration. Cela peut entraîner des effets pro- et anti-apoptotiques^16,17,18. En formant l’hétérodimère L de procaspase-8/c-FLIP_L catalytiquement actif, c-FLIP_L conduit à la stabilisation du centre actif de la procaspase-8 et à son activation. La fonction pro- ou anti-apoptotique de c-FLIP_L dépend directement de sa quantité au niveau des filaments DED et de la quantité ultérieure d’hétérodimères de procaspase-8/c-FLIP_L assemblés¹⁹. Des concentrations faibles ou intermédiaires de c-FLIP_L au niveau du DISC entraînent des quantités suffisantes d’hétérodimères de procaspase-8/c-FLIP_L au filament DED, qui soutient l’activation de la caspase-8. En revanche, des quantités accrues de c-FLIP_L conduisent directement à ses effets anti-apoptotiques au DISC²⁰.

Ensemble, l’activation et le traitement de la procaspase-8a/b au DISC est un processus hautement réglementé impliquant plusieurs étapes. Cet article traite de la mesure du traitement de la procaspase-8 directement au DISC ainsi que de l’analyse de la composition de ce complexe. Celui-ci sera présenté en utilisant CD95 DISC comme complexe DR exemplaire.

Protocole

Les expériences sur les lymphocytes T ont été réalisées conformément à l’accord éthique 42502-2-1273 Uni MD.

1. Préparation des cellules pour l’expérience

NOTE: Le nombre moyen de cellules pour cette immunoprécipitation est de 1 × 10⁷_. Les cellules adhérentes doivent être ensemencées un jour avant l’expérience afin qu’il y ait 1 ×^{10 7} cellules le jour de l’expérience.

1. Préparation des cellules adhérentes pour l’expérience
   1. Graine 5-8 × 10⁶ cellules adhérentes dans 20 mL de milieu (voir le tableau des matériaux pour la composition) pour chaque condition dans des plats de 14,5 cm un jour avant le début de l’expérience.
   2. Le jour de l’expérience, assurez-vous que les cellules sont confluentes à 80-90% et adhérentes au plat. Jetez le milieu et ajoutez du milieu frais aux cellules adhérentes.
2. Préparation des cellules de suspension pour l’expérience
   1. Placez soigneusement 1 × 10⁷ cellules de suspension dans 10 mL de milieu de culture (voir le tableau des matériaux pour la composition) par condition dans des plats de 14,5 cm immédiatement avant le début de l’expérience.
   2. Si vous utilisez des cellules primaires, isolez les cellules T primaires conformément à la procédure décrite précédemment²¹. Traiter les lymphocytes T primaires avec 1 μg/mL de phytohémagglutinine pendant 24 h, suivi d’un traitement par 25 U/mL IL2 pendant 6 jours.
   3. Placer soigneusement 1 × 10⁸ lymphocytes T primaires dans 10 mL de milieu de culture (voir le tableau des matériaux pour la composition) par condition dans des plats de 14,5 cm immédiatement avant le début de l’expérience.
      REMARQUE: Ce nombre plus élevé de cellules T primaires est recommandé, car ces cellules sont plus petites.

2. Stimulation CD95L

1. Stimuler les cellules avec CD95L (produit comme décrit précédemment²⁰ ou disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux)).
   REMARQUE: La concentration du CD95L et le temps de stimulation dépendent du type cellulaire^{13,15,22,23,24,25}. Préparez une condition de stimulation deux fois pour générer un échantillon de « contrôle de perles » en parallèle.
   1. Stimuler les cellules adhérentes avec la concentration sélectionnée de CD95L. Tenez la plaque en angle et pipetez le ligand dans le milieu sans toucher les cellules adhérentes.
   2. Stimuler les cellules de suspension avec CD95L en pipetant la solution de ligand dans la suspension cellulaire.

3. Récolte cellulaire et lyse

1. Placez les plats cellulaires sur de la glace.
   REMARQUE: Ne jetez pas le support. Les cellules mourantes flottent dans le milieu et sont importantes pour l’analyse.
2. Ajouter 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate froid (PBS) à la suspension cellulaire et gratter les cellules attachées de la plaque. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 50 mL.
3. Lavez deux fois la boîte cellulaire avec 10 mL de PBS froid et placez la solution de lavage dans le même tube de 50 mL. Centrifuger la suspension de la cellule à 500 × g pendant 5 min, 4 °C.
4. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de PBS froid. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 mL.
5. Centrifuger la suspension de la cellule à 500 × g pendant 5 min, 4 °C. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de PBS froid.
6. Centrifuger la suspension de la cellule à 500 × g pendant 5 min, 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de tampon de lyse (contenant 4% de cocktail d’inhibiteurs de protéase). Incubez-le pendant 30 min sur de la glace.
7. Centrifuger le lysat à la vitesse maximale (~17 000 × g)pendant 15 min, 4 °C.
8. Transférer le surnageant (lysat) dans un tube propre. Jetez la pastille. Prendre 50 μL du lysat dans un autre tube. Analyser la concentration en protéines par le test de Bradford et prendre la quantité de lysat correspondant à 25 μg de protéines dans un flacon. Ajouter un tampon de chargement (voir le tableau des matériaux pour la composition) au flacon. Conservez-le à -20 °C comme contrôle de lysat.

4. Immunoprécipitation (PI)

1. Ajouter 2 μL d’anticorps anti-APO-1 et 10 μL de billes de sépharose de protéine A (préparées selon les recommandations du fabricant) au lysat. Ajouter seulement 10 μL de billes dans un tube séparé contenant du lysat (échantillon stimulé) pour générer un « contrôle de perles ».
   REMARQUE: Utilisez des pointes de pipette avec de larges orifices, soit en coupant les pointes, soit en achetant des pointes spéciales pour IP tout en manipulant les perles de sépharose de protéine A.
2. Incuber le mélange de lysat avec des billes d’anticorps/protéine A de sépharose en mélangeant doucement pendant la nuit à 4 °C. Centrifuger les lysats avec des billes d’anticorps/protéine A de sépharose à 500 × g pendant 4 min, 4 °C. Jetez le surnageant, ajoutez 1 mL de PBS froid aux perles et répétez cette étape au moins trois fois.
3. Jetez le surnageant. Aspirer les billes de préférence avec une seringue Hamilton de 50 μL.

5. Transfert western

1. Ajouter 20 μL de tampon de charge 4x (voir le tableau des matériaux pour la composition) aux billes et chauffer à 95 °C pendant 10 min. Chauffer les commandes de lysat à 95 °C pendant 5 min.
2. Chargez les lysats, les IP et un étalon de protéines sur un gel de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 12,5% (voir la table des matériaux pour la préparation du gel) et exécutez avec une tension constante de 80 V.
3. Transférer les protéines du gel SDS vers une membrane de nitrocellulose.
   NOTE: Ici, la technique semi-sèche, optimisée pour les protéines d’intérêt, a été utilisée pour le transfert sur 12 min (25 V; 2,5 A = constante). Faire tremper la membrane de nitrocellulose et deux piles de transfert de mini-taille dans un tampon d’électrophorèse (voir le tableau des matériaux pour la composition, préparer selon les instructions du fabricant) pendant quelques minutes avant le transfert western.
4. Placez la membrane tachée dans une boîte et bloquez-la pendant 1 h dans une solution bloquante (0,1% Tween-20 dans du PBS (PBST) + 5% de lait). Incuber la membrane avec la solution bloquante sous une légère agitation.
5. Lavez la membrane trois fois avec pbST pendant 5 minutes à chaque lavage.

6. Détection de Western blot

1. Ajouter le premier anticorps primaire à la dilution indiquée (voir le tableau des matériaux)à la membrane et l’incuber pendant la nuit à 4 °C avec une agitation douce.
2. Lavez la membrane trois fois avec pbST pendant 5 minutes à chaque lavage.
3. Incuber la membrane avec 20 mL d’anticorps secondaires (dilués 1:10 000 dans du PBST + 5% de lait) en agitant doucement pendant 1 h à température ambiante.
4. Lavez la membrane trois fois avec pbST pendant 5 minutes à chaque lavage.
5. Jeter le PBST et ajouter environ 1 mL de substrat de peroxydase de raifort à la membrane.
6. Détecter le signal chimioluminescent (voir le Tableau des matériaux).
   REMARQUE: Le temps d’exposition et le nombre d’images capturées dépendent de la quantité de protéines dans la cellule et de la spécificité des anticorps utilisés. Il doit être établi empiriquement pour chaque anticorps utilisé pour la détection.

Résultats

Pour analyser le recrutement de caspase-8 au DISC et son traitement au CD95 DISC, cet article décrit un flux de travail classique, qui combine l’IP du CD95 DISC avec l’analyse western blot. Cela permet de détecter plusieurs caractéristiques clés de l’activation de la caspase-8 au DISC : l’assemblage de la plateforme macromoléculaire activant la caspase-8, le recrutement de la procaspase-8 dans le DISC, et le traitement de cette caspase initiatrice(Figure 1 et

Discussion

Cette approche a été décrite pour la première fois par Kischkel et al.²⁷ et a été développée avec succès depuis lors par plusieurs groupes. Plusieurs questions importantes doivent être prises en compte pour une immunoprécipitation DISC efficace et une surveillance du traitement de la caspase-8 dans ce complexe.

Tout d’abord, il est essentiel de suivre toutes les étapes de lavage pendant l’immunoprécipitation. Les dernières étapes de lavage des perles ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
12.5% SDS gel	self made		for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED
14.5 cm cell dishes	Greiner	639160
acrylamide	Carl Roth	A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice	VWR	46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)	Used for pipetting beads to the lysate
anti-actin Ab	Sigma Aldrich	A2103	dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo	ALX-805-038-C100	used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Ab	cell signaling	9662 S	dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-242-C100	dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-961-0100	dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ADI-AAM-212-E	dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Ab	cell signaling	9542	dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APS	Carl Roth	9592.3
β-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	used according to manufacturer's instructions
CD95L	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-522-020-C005
chemoluminescence detector Chem Doc XRS+	Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	11 836 145 001	prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
eletrophoresis buffer	self made		10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage
glycine	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human(hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	for activation of T cells
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL	Bio Rad	161-0747	prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUFO500
lysis buffer	self made		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,  2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
medium for primary T cells	gibco by Life Technologie	21875034	adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
milk powder	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	self made		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk	self made		50 g milk powder + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	for activation of T Cells
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	use between 3-5 µL
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
scraper	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
shaker	Heidolph
sodium azide	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks	Bio Rad	170-4270	used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane	Bio Rad	170-4270	used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000