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要約

ここでは、死誘導シグナル伝達複合体(DISC)で直接カスパーゼ-8処理を検出し、この複合体の組成を決定する実験的ワークフローを提示する。この方法論は、細胞死経路の分子機構の解明からアポトーシスネットワークの動的モデリングまで幅広い応用を有する。

要約

外因性アポトーシスは、CD95/Fas/APO-1または腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)受容体1/受容体2(TRAIL-R1/R2)などの死受容体(DR)の活性化によって媒介される。これらの受容体を同一性リガンドで刺激すると、死を誘発するシグナル伝達複合体(DISC)の組み立てにつながる。DISCはDR、アダプタータンパク質Fas関連タンパク質と死ドメイン(FADD)、プロサスアーゼ-8/-10、および細胞FADD様インターロイキン(IL)-1β変換酵素阻害タンパク質(c-FLIP)を含む。DISCは、プロカスパス8の処理とアクティベーションのプラットフォームとして機能します。後者 は、DISC で組み立てられたデスエフェクタードメイン(DED)フィラメントにおける二量体化/オリゴマー化によって生じる。

procaspase-8 の活性化は、その処理が続いて、いくつかのステップで発生します。本研究では、この複合体におけるDISC形成およびプロアスパス8の処理を測定することを可能にする確立された実験ワークフローについて説明する。このワークフローは、ウェスタンブロット分析でサポートされている免疫沈降技術に基づいています。このワークフローは、DISCとその処理に対するprocaspase-8採用の異なるステップを注意深く監視することを可能にし、外因性アポトーシスの分子メカニズムを調査するために非常に関連性が高い。

概要

最もよく研究された死の受容体(DR)の1つはCD95(Fas、APO-1)である。外因性アポトーシス経路は、DRと同結合リガンドとの相互作用から始まり、CD95LはTRAIL-Rsに結合するCD95またはTRAILと相互作用する。この結果、対応するDR. DISC での DISC の形成は、CD95、 FADD、 プロカスラーゼ-8/-10、および c-FLIP タンパク質1,2からなる 。さらに、DISCは、CD95やFADDなどの死ドメイン(DD)含有タンパク質、およびFADD、プロカスパス-8/-10、およびc-FLIPなどのDED含有タンパク質との相互作用によって組み立てられる(図1)。Procaspase-8は、そのDEの関連付けを介してオリゴマー化を行い、その結果、DEDフィラメントの形成、続いてプロカスパス8の活性化および処理を行う。これは、カスパーゼカスケードをトリガーし、細胞死(図1)3、4につながる。従って、プロカスパス症−8は、CD95またはTRAIL−Rsによって媒介される外因性アポトーシス経路の中心イニシエーターカスパーゼであり、対応する高分子プラットフォームDISCで活性化される。

プロカスパスゼ-8の2つのアイソフォーム、すなわちプロカスパス-8a(p55)および-8b(p53)は、DISC5に採用することが知られている。両方のアイソフォームは、2つのDEを含む。DED1およびDED2は、触媒p18およびp10ドメインが続く、プロアスパス症-8a/bのN末端部分に位置する。プロアスパス症-8DEの詳細なクライオ電子顕微鏡(cryo-EM)分析は、プロサスパス8タンパク質のDEDフィラメント4,6と呼ばれる糸状構造への組み立てを明らかにした。驚くべきことに、リニアプロアスパス8鎖は、最初は二量体化に従事し、続いてDISCでプロスパパス8活性化に従事することが示唆された。さて、これらの鎖は、プロカスパス-8DEDフィラメントの一部構造に過ぎず、後者は三重らせん3、4、6、7に組み立てられた3つの鎖を含むことが知られている。

DEDフィラメントでの二量体化の際、プロカスパス8a/bの立体構造変化は、プロアスパス-8の活性中心の形成と、その活性化3、8を導く。これに続いて、2つの経路を介して媒介されるprocaspase-8処理が続きます:最初のものはp43 / p41切断産物の生成を介して行き、2番目のものはp30切断産物の初期生成を介して行きます。p43/p41経路はAsp374でのプロスパパス-8a/bの切断によって開始され、p43/p41およびp12切断産物を生じる(図2)。また、これらの断片は、Asp384およびAsp210/216で自動触媒的に切断され、活性カスパーゼ-8ヘテロトラマーの形成を生じさせる、p10 2/p1829、10、11。また、p43/p41処理経路と並行して、プロカスパス-8a/bもAsp216で切断され、C末端切断生成物p30の形成につながり、続いてp10およびp1810に対するタンパク質分解が行われることが示された(図2)。

DEDフィラメントにおけるプロカスパス症-8a/b活性化はc-FLIP12というタンパク質によって厳密に調節される。c-FLIPタンパク質は、c-FLIPLong (c-FLIP L)、c-フリップショート(c-FLIPS)、c-FLIPラジ(c-FLIPR)の3つのアイソフォームで発生します。3 つのアイソフォームはいずれも、N 端子領域に 2 つの DE を含んでいます。c-FLIPLはまたC末端触媒的に不活性なカスパーゼ様ドメイン12、13を有する。c-FLIP-c-FLIPSとc-FLIPRの両方の短いアイソフォーム-DISC6、14、15でDEDフィラメント形成を妨害することによって抗アポトーシス的な方法で作用する。さらに、c-FLIPLは濃度依存的な方法でカスパーゼ-8の活性化を調節することができる。これは、プロと抗アポトーシス効果16、17、18の両方をもたらすことができます。触媒活性プロアスパスを形成することによって-8/c-FLIPLヘテロダイマー、c-FLIPLは、プロアスパス8の活性中心の安定化とその活性化をもたらす。c-FLIPLのプロまたは抗アポトーシス関数は、DEDフィラメントにおけるその量および後に組み立てられたプロスパパス症-8/c-FLIPLヘテロダイマー19の量に直接依存する。DISCでのC-FLIPLの低濃度または中間濃度は、カスパーゼ-8の活性化をサポートするDEDフィラメントで十分な量のプロスパパス酵素-8/c-FLIPLヘテロ二量体をもたらす。対照的に、c-FLIPLの増加量は、直接DISC20でその抗アポトーシス効果につながります。

まとめると、DISCでのprocaspase-8a/bの活性化と処理は、いくつかのステップを伴う高度に規制されたプロセスです。本論文では、DISCにおけるプロカスパス8処理の測定と、この複合体の組成の分析について議論する。これは、例示的なDR複合体としてCD95 DISCを使用して提示されます。

プロトコル

T細胞実験は、倫理協定42502-2-1273 Uni MDに従って行った。

1. 実験用の細胞の準備

注: この免疫沈降の平均細胞数は 1 × 107です。 被着細胞は実験の日に107 個の細胞×されるように、実験の1日前に播種する必要があります。

  1. 実験用の接着細胞の準備
    1. 種子5〜8×、実験開始の前日に14.5cmの皿の各条件について、培地20mL(組成用材料表を参照)で106個の付着細胞を10個含みます。
    2. 実験の日に、細胞が80-90%コンフルエントであり、皿に付着していることを確認してください。培地を捨て、接着細胞に新鮮な培地を加えます。
  2. 実験用の懸濁液細胞の準備
    1. 実験開始直前に14.5cmの皿に10mLの培養培地(組成用材料表を参照)に1個の×を慎重に配置します。
    2. プライマリセルを使用する場合は、前述の手順21に従ってプライマリT細胞を単離する。1 μg/mL フィトヘマグルチニンを 24 時間、続いて 25 U/mL IL2 処理を 6 日間治療します。
    3. 実験開始直前に14.5cmの皿の条件ごとに1×108原T細胞を10mLの培養培地に入れてください(組成の材料表を参照)。
      注: これらのセルは小さいため、このより多くのプライマリ T セルをお勧めします。

2. CD95L刺激

  1. CD95L(20または市販の(材料表を参照)で細胞を刺激する。
    注意: CD95Lの濃度と刺激時間は細胞タイプ依存13、15、22、23、24、25です。1つの刺激条件を2回準備して、ビーズコントロールサンプルを並列に生成します。
    1. 選択したCD95L濃度で接着細胞を刺激します。プレートを斜めに保持し、接着細胞に触れることなくリガンドを培地にピペットします。
    2. リガンド溶液を細胞懸濁液にピペット化して、CD95Lで細胞の懸濁を刺激します。

3. 細胞の収穫とリシス

  1. 氷の上にセル皿を置きます。
    メモ:メディアを破棄しないでください。死にかけている細胞は培地に浮かび、分析にとって重要です。
  2. 10 mLの冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を細胞懸濁液に加え、取り付けた細胞をプレートから削り取ります。50 mLチューブにセル懸濁液を回収します。
  3. 冷たいPBSの10 mLでセル皿を2回洗い、洗浄液を同じ50mLチューブに入れます。500×gで細胞懸濁液を5分間、4°Cで遠心分離する。
  4. 上清を捨て、冷たいPBSの1 mLで細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を1.5mLチューブに移します。
  5. 500×gで細胞懸濁液を5分間、4°Cで遠心分離する。 上清を捨て、冷たいPBSの1 mLで細胞ペレットを再懸濁します。
  6. 500×gで細胞懸濁液を5分間、4°Cで遠心分離する。 上清を捨て、細胞ペレットを1mLのリシスバッファー(4%プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む)で再懸濁します。氷の上で30分間インキュベートします。
  7. 最大速度(約17,000×g)で15分間、4°Cの間、最大速度でリゼートを遠心分離します。
  8. 清浄なチューブに上清(lysate)を移します。ペレットを捨てます。別のチューブに50μLのライセートを取ります。ブラッドフォードアッセイでタンパク質濃度を分析し、バイアル中のタンパク質25μgに相当するリゼートの量を取ります。バイアルにロードバッファ( コンポジションの材料表 を参照)を追加します。-20 °Cで、ライセートコントロールとして保管してください。

4. 免疫沈降(IP)

  1. 2 μLの抗 APO-1 抗体と 10 μL のプロテイン A セファローズビーズ (メーカーが推奨するように調製) をライセートに加えます。ビーズの10 μLのみを、リセート(刺激されたサンプル)を含む別のチューブに加えることで、「ビーズコントロール」を生成します。
    注:タンパク質Aセファローズビーズを扱いながら、チップをカットするか、IPのための特別なヒントを購入することによって、広いオリフィスでピペットのヒントを使用してください。
  2. 4°Cで一晩穏やかな混合と抗体/タンパク質Aセファロースビーズとのリゼートの混合物をインキュベート。 500 ×g の抗体/プロテインAセファローズビーズを用いたリゼートを4分間、4°Cで遠心分離する。 上清を捨て、1mLの冷たいPBSをビーズに加え、このステップを少なくとも3回繰り返します。
  3. 上清を捨てます。50 μL のハミルトンシリンジを使用してビーズを吸引することが好ましい。

5. ウェスタンブロット

  1. ビーズに20 μLの4倍のローディングバッファ(組成 用材料表 を参照)を加え、95°Cで10分間加熱します。95°Cで5分間、ライセートコントロールを加熱します。
  2. 12.5%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ゲル(ゲル調製のための 材料表 を参照)に、ライセート、IP、およびタンパク質標準をロードし、80 Vの一定電圧で動作します。
  3. SDSゲルからニトロセルロース膜にタンパク質を移す。
    注:ここでは、対象のタンパク質に最適化された半乾燥技術を、12分(25V;2.5 A=定数)以上の移動に使用しました。ニトロセルロース膜と2つのミニサイズの転写スタックを電気泳動バッファーに浸し(構成用 の材料表 を参照し、メーカーの指示に従って準備してください)、ウェスタンブロッティングの前に数分間浸します。
  4. ブロット膜を箱に入れ、ブロッキング溶液(PBS(PBS(PBS)+5%ミルクで0.1%Tween-20)で1時間ブロックします。穏やかな攪拌の下でブロッキング溶液で膜をインキュベート.
  5. 膜をPBSTで3回洗浄し、洗浄を5分間行います。

6. ウェスタンブロット検出

  1. 示された希釈液に最初の一次抗体を加え( 材料表を参照)、穏やかな攪拌で4°Cで一晩インキュベートします。
  2. 膜をPBSTで3回洗浄し、洗浄を5分間行います。
  3. 20 mLの二次抗体(PBST+5%乳で希釈)を室温で1時間穏やかに振って膜をインキュベートします。
  4. 膜をPBSTで3回洗浄し、洗浄を5分間行います。
  5. PBSTを廃棄し、約1mLの西洋ワサビペルオキシダーゼ基材を膜に加えます。
  6. 化学発光シグナルを検出します( 材料表を参照)。
    注:露光時間と撮影画像の数は、細胞内のタンパク質の量と使用される抗体の特異性によって異なります。検出に使用する抗体ごとに経験的に確立する必要があります。

結果

本論文では、CD95 DISCにおけるDISCへのカスパーゼ-8の採用と処理を分析するために、CD95 DISCのIPとウェスタンブロット分析を組み合わせた古典的なワークフローについて説明する。これにより、CASPASE-8活性化の複数の主要な機能をDISCで検出できます:カスパーゼ-8活性化高分子プラットフォームの組み立て、PROCASAS-8のDISCへの採用、およびこのイニシエーターカスパーゼの処理(図1...

ディスカッション

このアプローチは、Kischkelら27 によって最初に記述され、それ以来いくつかのグループによって開発されました。この複合体における効率的なDISC-免疫沈降およびモニタリングカスパーゼ-8処理に関しては、いくつかの重要な問題を考慮する必要があります。

まず、免疫沈降の間に全ての洗浄工程に従う必要があります。特に重要なのは、セファロース?...

開示事項

著者らは開示する利益相反はない。

謝辞

我々は、ウィルヘルム・サンダー財団(2017.008.02)、EUプログラムERDF(欧州地域開発基金)、DFG(LA 2386)が資金を提供するダイナミックシステムセンター(CDS)が当社の活動を支援することを認めます。私たちの実験を支援してくれたカリーナ・グテクに感謝します。私たちは、私たちに原発性T細胞を提供したダーク・クラインホルド教授(OvGU、マクデブルク)を認めます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
12.5% SDS gelself madefor two separating gels:
3.28 mL distilled H2O
2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M
4.06 mL acrylamide
100 µL 10% SDS
100 µL 10% APS
7.5 µL TEMED

for two collecting gels:
3.1 mL distilled H2O
1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M
0.5 mL acrylamide
50 µL 10% SDS
25 µL 10% APS
7.5 µL TEMED
14.5 cm cell dishesGreiner639160
acrylamideCarl RothA124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orificeVWR46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)Used for pipetting beads to the lysate
anti-actin AbSigma AldrichA2103dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Abprovided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by EnzoALX-805-038-C100used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 AbBiozolMBL-M059-3dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Abcell signaling9662 Sdilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-804-242-C100dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 AbSanta Cruzsc-715dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Abprovided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-804-961-0100dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Abprovided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOADI-AAM-212-Edilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Abcell signaling9542dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APSCarl Roth9592.3
β-mercaptoethanolCarl Roth4227.2
Bradford solution
Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml		Bio Rad500-0006used according to manufacturer's instructions
CD95Lprovided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-522-020-C005
chemoluminescence detector
Chem Doc XRS+		Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)Sigma Aldrich11 836 145 001prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, MgPAN BiotechP04-53500dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
eletrophoresis bufferself made10x electrophoresis buffer:
60.6 g Tris
288 g glycine
20 g SDS
ad 2 L H2O
1:10 dilution before usage
glycineCarl Roth3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRPSouthernBiotech1070-05dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRPSouthernBiotech4030-05dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human(hIL-2)Merckgroup/ Roche11011456001for activation of T cells
KClCarl Roth6781.2
KH2PO4Carl Roth3904.1
loading buffer
4x Laemmli Sample Buffer,10 mL		Bio Rad161-0747prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrateMilliporeWBLUFO500
lysis bufferself made13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M
27.5 mL NaCl; 5 M
10 mL EDTA; 2 mM
100 mL Triton X-100
add 960 mL H2O
medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,  2,438 g/LPAN BiotechP04-41154adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
medium for primary T cellsgibco by Life Technologie21875034adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
milk powderCarl RothT145.4
Na2HPO4Carl RothP030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBSTself made20x PBST:
230 g NaCl
8 g KCl
56.8 g Na2HPO4
8 g KH2PO4
20 mL Tween-20
ad 2 L H2O
dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milkself made50 g milk powder + 1 L PBST
PHAThermo Fisher ScientificR30852801for activation of T Cells
Power Pac HCBio Rad
Precision Plus Protein Standard All BlueBio Rad161-0373use between 3-5 µL
Protein A Sepharose CL-4B beadsNovodirect/ Th.GeyerGE 17-0780-01affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
scraperVWR734-2602
SDSCarl Roth4360.2
shakerHeidolph
sodium azideCarl RothK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacksBio Rad170-4270used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer BufferBio Rad10026938prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membraneBio Rad170-4270used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8,08,51,000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac Appli ChemA4974,1000

参考文献

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174 CD95 DISC 8

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