Medição da Composição do Complexo de Sinalização e Processamento de Indução de Morte CD95 de Procaspase-8 neste Complexo

Resumo

Aqui, é apresentado um fluxo de trabalho experimental que permite a detecção do processamento caspase-8 diretamente no complexo de sinalização indutor de morte (DISC) e determina a composição desse complexo. Essa metodologia possui amplas aplicações, desde a desvendação dos mecanismos moleculares das vias de morte celular até a modelagem dinâmica das redes de apoptose.

Resumo

A apoptose extrínseca é mediada pela ativação de receptores de morte (DRs) como CD95/Fas/APO-1 ou ligante indutor de fator de necrose tumoral (TRAIL)-receptor 1/receptor 2 (TRAIL-R1/R2). A estimulação desses receptores com seus ligantes cognatos leva à montagem do complexo de sinalização indutor da morte (DISC). O DISCO compreende dr, a proteína adaptadora Fas com domínio de morte (FADD), procaspases-8/-10, e interleucina semelhante a FADD celular (IL)-1β-conversão de proteínas inibitórias de enzimas (c-FLIPs). O DISCO serve como uma plataforma para processamento e ativação procaspase-8. Este último ocorre por meio de sua dimerização/oligomerização nos filamentos de domínio de efeito de morte (DED) montados no DISC.

A ativação do procaspase-8 é seguida pelo seu processamento, que ocorre em várias etapas. Neste trabalho, descreve-se um fluxo de trabalho experimental estabelecido que permite a medição da formação de DISC e o processamento do procaspase-8 neste complexo. O fluxo de trabalho é baseado em técnicas de imunoprecipitação apoiadas pela análise de manchas ocidentais. Este fluxo de trabalho permite um monitoramento cuidadoso de diferentes etapas do recrutamento procaspase-8 para o DISCO e seu processamento e é altamente relevante para investigar mecanismos moleculares de apoptose extrínseca.

Introdução

Um dos receptores de morte (DRs) mais bem estudados é o CD95 (Fas, APO-1). A via poptótica extrínseca começa com a interação do DR com seu ligante cognato, ou seja, o CD95L interage com cd95 ou trail liga-Rs. Isso resulta na formação do DISCO no DR. DISC correspondente composto por CD95, FADD, procaspase-8/-10 e proteínas c-FLIP^1,2. Além disso, o DISCO é montado por interações entre proteínas contendo domínio de morte (DD), como CD95 e FADD, e proteínas contendo DED, como FADD, procaspase-8/-10 e c-FLIP(Figura 1). O Procaspase-8 passa por oligomerização via associação de seus DEDs, resultando na formação de filamentos de DED, seguido pela ativação e processamento do Procaspase-8. Isso desencadeia uma cascata de caspase, que leva à morte celular(Figura 1)^3,4. Assim, o procaspase-8 é um caspase iniciador central da via de apoptose extrínseca mediada por CD95 ou trail-Rs, ativada na plataforma macromolecular correspondente, DISC.

Dois isóformes de procaspase-8, ou seja, procaspase-8a (p55) e -8b (p53), são conhecidos por serem recrutados para o DISC⁵. Ambas as isoformas compreendem dois DEDs. DED1 e DED2 estão localizados na parte n-terminal do procaspase-8a/b seguido pelos domínios catalíticos p18 e p10. A análise detalhada da microscopia crio-elétron (crio-EM) dos DEDs procaspase-8 revelou a montagem de proteínas procaspase-8 em estruturas filamentos filamentos de ded chamados filamentos DED^4,6. Notavelmente, as cadeias lineares procaspase-8 foram inicialmente sugeridas para serem engajadas na dimerização seguida pela ativação procaspase-8 no DISC. Agora, sabe-se que essas cadeias são apenas uma subestrutura do filamento procaspase-8 DED, este último compreendendo três cadeias montadas em uma tríplice hélice^3,4,6,7.

Após a dimerização no filamento de DED, alterações conformais no procaspase-8a/b levam à formação do centro ativo do procaspase-8 e sua ativação^3,8. Isso é seguido pelo processamento procaspase-8, que é mediado por duas vias: a primeira passa pela geração de um produto de decote p43/p41 e a segunda através da geração inicial de um produto de decote p30. A via p43/p41 é iniciada pelo decote de procaspase-8a/b em Asp374, resultando em produtos de decote p43/p41 e p12(Figura 2). Além disso, esses fragmentos são auto-catalicamente cortados em Asp384 e Asp210/216, dando origem à formação do heterotetramer caspase ativo-8, p10₂/p18₂^9,10,11. Além disso, mostrou-se que paralelamente à via p43/p41 de processamento, o procaspase-8a/b também é cortado em Asp216, o que leva à formação do produto de decote terminal C p30, seguido por sua proteólise para p10 e p18¹⁰ (Figura 2).

A ativação procaspase-8a/b no filamento DED é estritamente regulada por proteínas chamadas c-FLIPs¹². As proteínas c-FLIP ocorrem em três isoformas: c-FLIP_Long (c-FLIP_L),c-FLIP_Short (c-FLIP_S)e c-FLIP_Raji (c-FLIP_R). Todos os três isoforms contêm dois DEDs em sua região n-terminal. c-FLIP_L também possui um terminal C catalyticamente inativo como o domínio caspase^12,13. Ambos os isoformes curtos de c-FLIP-c-FLIP_S e c-FLIP_R-ajam de forma anti-apoptótica interrompendo a formação de filamento de DED no DISC^6,14,15. Além disso, o C-FLIP_L pode regular a ativação caspase-8 de forma dependente da concentração. Isso pode resultar em efeitos pró e anti-apoptóticos^16,17,18. Ao formar o catalisticamente ativo procaspase-8/c-FLIP_L heterodimer, c-FLIP_L leva à estabilização do centro ativo do procaspase-8 e sua ativação. A função pró ou anti-apoptótica do c-FLIP_L depende diretamente de sua quantidade nos filamentos de DED e da quantidade subsequente de heterímeros procaspase-8/c-FLIP_L ¹⁹. Concentrações baixas ou intermediárias de c-FLIP_L no DISCO resultam em quantidades suficientes de heterodimers procaspase-8/c-FLIP_L no filamento DED, que suporta a ativação de caspase-8. Em contraste, o aumento das quantidades de c-FLIP_L levam diretamente aos seus efeitos anti-apoptóticos no DISC²⁰.

Em conjunto, a ativação e processamento do procaspase-8a/b no DISCO é um processo altamente regulamentado envolvendo várias etapas. Este artigo discute a medição do processamento procaspase-8 diretamente no DISCO, bem como a análise da composição deste complexo. Este será apresentado utilizando o CD95 DISC como o complexo dr exemplar.

Protocolo

Os experimentos com células T foram realizados de acordo com o acordo ético 42502-2-1273 Uni MD.

1. Preparando células para o experimento

NOTA: O número médio de células para esta imunoprecipitação é de 1 × 10⁷_. Células aderentes devem ser semeadas um dia antes do experimento para que haja 1 × 10⁷ células no dia do experimento.

1. Preparando células aderentes para o experimento
   1. Semente 5-8 × 10⁶ células aderentes em 20 mL de meio (ver a Tabela de Materiais para a composição) para cada condição em pratos de 14,5 cm um dia antes do início do experimento.
   2. No dia do experimento, certifique-se de que as células são 80-90% confluentes e aderentes ao prato. Descarte o meio e adicione meio fresco às células aderentes.
2. Preparando células de suspensão para o experimento
   1. Coloque cuidadosamente 1 × 10⁷ células de suspensão em 10 mL de meio de cultura (ver a Tabela de Materiais para a composição) por condição em pratos de 14,5 cm imediatamente antes do início do experimento.
   2. Se usar células primárias, isole as células T primárias de acordo com o procedimento descrito anteriormente²¹. T tratar células T primárias com fitohemagglutinina de 1 μg/mL por 24 h, seguido por 25 tratamento U/mL IL2 por 6 dias.
   3. Coloque cuidadosamente 1 × 10⁸ células T primárias em 10 mL de meio de cultura (ver a Tabela de Materiais para a composição) por condição em pratos de 14,5 cm imediatamente antes do início do experimento.
      NOTA: Recomenda-se um maior número de células T primárias, uma vez que essas células são menores.

2. Estimulação CD95L

1. Estimule as células com CD95L (produzido como descrito anteriormente²⁰ ou comercialmente disponível (ver a Tabela de Materiais).).
   NOTA: A concentração do CD95L e o tempo de estimulação são dependentes do tipo celular^{13,15,22,23,24,25}. Prepare duas vezes uma condição de estimulação para gerar uma amostra de "controle de contas".
   1. Estimule as células aderentes com a concentração selecionada de CD95L. Segure a placa em um ângulo e coloque a ligadura no meio sem tocar nas células aderentes.
   2. Estimule as células de suspensão com CD95L, canalização da solução de ligadura na suspensão celular.

3. Colheita celular e lise

1. Coloque os pratos de celular no gelo.
   NOTA: Não descarte o meio. Células moribundas flutuam no meio e são importantes para a análise.
2. Adicione 10 mL de soro fisiológico a frio (PBS) à suspensão celular e raspe as células anexadas da placa. Colete a suspensão da célula em um tubo de 50 mL.
3. Lave o prato da célula com 10 mL de PBS frio duas vezes e coloque a solução de lavagem no mesmo tubo de 50 mL. Centrifugar a suspensão da célula a 500 × g por 5 min, 4 °C.
4. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular com 1 mL de PBS frio. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 1,5 mL.
5. Centrifugar a suspensão da célula a 500 × g por 5 min, 4 °C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular com 1 mL de PBS frio.
6. Centrifugar a suspensão da célula a 500 × g por 5 min, 4 °C. Descarte o supernascimento e resuspenque a pelota celular com 1 mL de tampão de lise (contendo 4% de coquetel inibidor de protease). Incuba-lo por 30 minutos no gelo.
7. Centrifugar o lysate em velocidade máxima (~17.000 × g) por 15 min, 4 °C.
8. Transfira o supernatante (lise) para um tubo limpo. Descarte a pelota. Tome 50 μL do lysate em outro tubo. Analise a concentração de proteínas pelo ensaio de Bradford e tome a quantidade de lise correspondente a 25 μg de proteína em um frasco. Adicione o tampão de carga (consulte a tabela de materiais para a composição) ao frasco. Armazene-o a -20 °C como controle de lise.

4. Imunoprecipitação (IP)

1. Adicione 2 μL de anticorpos anti-APO-1 e 10 μL de proteínaS A sepharose (preparada conforme recomendado pelo fabricante) ao liseto. Adicione apenas 10 μL das contas a um tubo separado contendo liseto (amostra estimulada) para gerar um "controle de contas".
   NOTA: Use pontas de pipet com orifícios largos, cortando as pontas ou comprando dicas especiais para IP enquanto manuseia as contas de proteína A sepharose.
2. Incubar a mistura de liseto com anticorpos/proteínaSA contas de sepharose com mistura suave durante a noite a 4 °C. Centrifugar os lises com anticorpos/proteínaS Uma semente de sepharose a 500 × g por 4 min, 4 °C. Descarte o supernatante, adicione 1 mL de PBS frio às contas e repita esta etapa pelo menos três vezes.
3. Descarte o supernatante. Aspire as contas de preferência com uma seringa Hamilton de 50 μL.

5. Mancha ocidental

1. Adicione 20 μL de tampão de carga de 4x (consulte a tabela de materiais para a composição) às contas e aqueça a 95 °C por 10 min. Aqueça os controles de lise a 95 °C por 5 min.
2. Carregue os lises, IPs e um padrão proteico em um gel de sulfato de dodecyl de sódio (SDS) de sódio de 12,5% (veja a tabela de materiais para a preparação do gel) e corra com uma tensão constante de 80 V.
3. Transfira as proteínas do gel SDS para uma membrana nitrocelulose.
   NOTA: Aqui, a técnica semi-seca, otimizada para as proteínas de interesse, foi utilizada para a transferência ao longo de 12 min (25 V; 2,5 A= constante). Mergulhe a membrana de nitrocelulose e duas mini-pilhas de transferência em tampão de eletroforese (consulte a Tabela de Materiais para a composição, prepare-se de acordo com as instruções do fabricante) por alguns minutos antes da mancha ocidental.
4. Coloque a membrana manchada em uma caixa e bloqueie-a por 1h na solução de bloqueio (0,1% Tween-20 em PBS (PBST) + 5% de leite). Incubar a membrana com a solução de bloqueio sob agitação suave.
5. Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min cada lavagem.

6. Detecção de manchas ocidentais

1. Adicione o primeiro anticorpo primário na diluição indicada (ver a Tabela de Materiais) à membrana e incuba-o durante a noite a 4 °C com agitação suave.
2. Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min cada lavagem.
3. Incubar a membrana com 20 mL de anticorpo secundário (diluído 1:10.000 em PBST + 5% de leite) com agitação suave por 1h à temperatura ambiente.
4. Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min cada lavagem.
5. Descarte PBST e adicione aproximadamente 1 mL de substrato de peroxidase de rabanete à membrana.
6. Detecte o sinal quimioluminescente (ver a Tabela de Materiais).
   NOTA: O tempo de exposição e o número de imagens capturadas dependem da quantidade de proteína na célula e da especificidade dos anticorpos utilizados. Deve ser estabelecido empiricamente para cada anticorpo utilizado para a detecção.

Resultados

Para analisar o recrutamento caspase-8 para o DISCO e seu processamento no DISCO CD95, este artigo descreve um fluxo de trabalho clássico, que combina IP do CD95 DISC com análise de manchas ocidentais. Isso permite a detecção de várias características-chave da ativação caspase-8 no DISCO: a montagem da plataforma macromolecular ativante caspase-8, o recrutamento do procaspase-8 para o DISCO e o processamento desta caspase iniciadora(Figura 1 e Figura 2)....

Discussão

Esta abordagem foi descrita pela primeira vez por Kischkel et al.²⁷ e foi desenvolvida com sucesso desde então por vários grupos. Várias questões importantes devem ser consideradas para a eficiente imunoprecipitação disc-imunoprecipitação e monitoramento do processamento caspase-8 neste complexo.

Em primeiro lugar, é essencial seguir todas as etapas de lavagem durante a imunoprecipitação. Especialmente importantes são as etapas finais de lavagem das contas d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12.5% SDS gel	self made		for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED
14.5 cm cell dishes	Greiner	639160
acrylamide	Carl Roth	A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice	VWR	46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)	Used for pipetting beads to the lysate
anti-actin Ab	Sigma Aldrich	A2103	dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo	ALX-805-038-C100	used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Ab	cell signaling	9662 S	dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-242-C100	dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-961-0100	dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ADI-AAM-212-E	dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Ab	cell signaling	9542	dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APS	Carl Roth	9592.3
β-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	used according to manufacturer's instructions
CD95L	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-522-020-C005
chemoluminescence detector Chem Doc XRS+	Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	11 836 145 001	prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
eletrophoresis buffer	self made		10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage
glycine	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human(hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	for activation of T cells
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL	Bio Rad	161-0747	prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUFO500
lysis buffer	self made		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,  2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
medium for primary T cells	gibco by Life Technologie	21875034	adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
milk powder	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	self made		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk	self made		50 g milk powder + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	for activation of T Cells
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	use between 3-5 µL
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
scraper	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
shaker	Heidolph
sodium azide	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks	Bio Rad	170-4270	used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane	Bio Rad	170-4270	used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000