מדידת הרכב של CD95 מוות גרימת איתות מורכב ועיבוד של Procaspase-8 במתחם זה

Summary

כאן, מוצגת זרימת עבודה ניסיונית המאפשרת זיהוי של עיבוד caspase-8 ישירות בקומפלקס האיתות מעורר המוות (DISC) וקובעת את ההרכב של קומפלקס זה. למתודולוגיה זו יש יישומים רחבים, החל מחשיפת המנגנונים המולקולריים של נתיבי מוות תאים ועד למודל הדינמי של רשתות אפופטוזיס.

Abstract

אפופטוזיס Extrinsic הוא בתיווך על ידי ההפעלה של קולטני מוות (DRs) כגון CD95 /Fas/APO-1 או גידול נמק הקשורים אפופטוזיס-גרימת ליגנד (TRAIL)-קולטן 1/קולטן 2 (TRAIL-R1/R2). גירוי של קולטנים אלה עם ליגנדים מודעים שלהם מוביל להרכבה של תסביך איתות גרימת מוות (DISC). ה-DISC כולל את DR, חלבון המתאם Fas הקשור לתחום המוות (FADD), פרוקספסות-8/-10, ואינטרלוקין דמוי FADD תאי (IL)-1β הממיר חלבונים מעכבי אנזימים (c-FLIPs). הדיסק משמש כפלטפורמה לעיבוד והפעלה של פרוקספאז-8. זה האחרון מתרחש באמצעות דימרציה שלה / אוליגומריזציה בתחום אפקט המוות (DED) חוטים שהורכבו בדיסק.

הפעלה של procaspase-8 מלווה בעיבוד שלה, אשר מתרחשת במספר שלבים. בעבודה זו, מתוארת זרימת עבודה ניסיונית מבוססת המאפשרת מדידה של היווצרות דיסק ועיבוד של פרוקספאז-8 במתחם זה. זרימת העבודה מבוססת על טכניקות אימונופרציפיטציה הנתמכות על-ידי ניתוח כתם מערבי. זרימת עבודה זו מאפשרת ניטור זהיר של שלבים שונים של גיוס procaspase-8 ל- DISC ועיבודו והיא רלוונטית מאוד לחקירת מנגנונים מולקולריים של אפופטוזיס קיצוני.

Introduction

אחד קולטני המוות הנחקרים ביותר (DRs) הוא CD95 (פאס, APO-1). המסלול האפופטוטי הקיצוני מתחיל באינטראקציה של ה- DR עם ליגנד הקוגנייט שלו, כלומר, CD95L מקיים אינטראקציה עם CD95 או TRAIL נקשר ל- TRAIL-Rs. התוצאה היא היווצרות הדיסק ב- DR. DISC המתאים מורכב CD95, FADD, פרוקספאז-8/-10, וחלבוני C-FLIP^1,2. יתר על כן, הדיסק מורכב על ידי אינטראקציות בין חלבונים המכילים תחום מוות (DD), כגון CD95 ו- FADD, וחלבונים המכילים DED כגון FADD, פרוקספסאז-8/-10 ו- c-FLIP (איור 1). Procaspase-8 עובר אוליגומריזציה באמצעות שיוך של DDs שלה, וכתוצאה מכך היווצרות של חוטי DED, ואחריו הפעלה ועיבוד פרוקספאז-8. הדבר מעורר מפל מפל, מה שמוביל למוות תאי (איור 1)^3,4. לכן, procaspase-8 הוא יזם מרכזי caspase של מסלול אפופטוזיס extrinsic בתיווך CD95 או TRAIL-Rs, מופעל בפלטפורמה המקרומולקולרית המתאימה, דיסק.

שני איזופורמים של פרוקספאז-8, כלומר פרוקספאז-8a (p55) ו -8b (p53), ידועים שגויסו ל- DISC⁵. שני האיזופורמים מורכבים משני מקרים של נזיפה. DED1 ו- DED2 ממוקמים בחלק N-terminal של procaspase-8a/b ואחריו הדומיינים הקטליטיים p18 ו- p10. ניתוח מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית מפורטת (cryo-EM) של ממסמכים מזהים פרוקספצאז-8 גילה את ההרכבה של חלבוני פרוקספאז-8 למבנים חוטיים הנקראים חוטי DED^4,6. למרבה הפלא, רשתות הפרוקספסאז-8 הליניאריות הוצעו בתחילה לעסוק בדימרציה ואחריה הפעלת פרוקספסאז-8 בדיסק. עכשיו, זה ידוע כי רשתות אלה הם רק תת מבנה של חוט DED procaspase-8, האחרון מורכב שלוש שרשראות התאספו סליל משולש^3,4,6,7.

עם עמעום בסימת DED, שינויים קונפורמציה procaspase-8a/b להוביל להיווצרות של המרכז הפעיל של procaspase-8 והפעלתו^3,8. לאחר מכן עיבוד procaspase-8, אשר מתווך באמצעות שני מסלולים: הראשון עובר דרך הדור של מוצר מחשוף p43/p41 והשני באמצעות הדור הראשוני של מוצר מחשוף p30. מסלול p43/p41 הוא ביוזמת מחשוף של פרוקספז-8a/b ב Asp374, וכתוצאה מכך p43/p41 ו p12 מחשוף מוצרים(איור 2). יתר על כן, שברים אלה הם אוטומטית קטליטית בקע ב Asp384 ו Asp210/216, מה שמוליד היווצרות של הטרוטרמר קפסטה פעיל-8, p10₂/p18₂^9,10,11. בנוסף, הוכח כי במקביל למסלול העיבוד p43/p41, פרוקספז-8a/b מבקע גם ב-Asp216, מה שמוביל להיווצרותו של מוצר המחשוף C-terminal p30, ואחריו הפרוטאוליזה שלו ל-p10 ו-p18¹⁰ (איור 2).

הפעלה של פרוקספאז-8a/b בסיבי DED מוסדרת בקפדנות על ידי חלבונים הנקראים c-FLIPs¹². חלבוני C-FLIP מופיעים בשלושה איזופורמים: C-FLIP_לונג (c-FLIP_L),C-FLIP_Short (c-FLIP_S)ו-C-FLIP_Raji (c-FLIP_R). כל שלושת האיזופורמים מכילים שני מקרים של פענוחים באזור N-terminal שלהם. c-FLIP_L כולל גם תחום דמוי קפטאז^12,13. שני האיזופורמים הקצרים של C-FLIP-C-FLIP_S ו- c-FLIP_R- פועלים באופן אנטי-אפופטוטי על ידי שיבוש היווצרות חוט DED בדיסק^6,14,15. בנוסף, c-FLIP_L יכול לווסת את הפעלת caspase-8 באופן תלוי ריכוז. זה יכול לגרום הן אפקטים פרו-אנטי^{אפופטוטיים 16,17,18}. על ידי יצירת פרוקספאז פעיל קטליטית-8/c-FLIP_L הטרודימר, c-FLIP_L מוביל לייצוב של המרכז הפעיל של פרוקספז-8 והפעלתו. הפונקציה pro- או אנטי אפופטוטי של c-FLIP_L תלויה ישירות בכמות שלה בסיבי DED ואת הכמות הבאה של procaspase-8/c-FLIP_L הטרודימרים¹⁹. ריכוזים נמוכים או בינוניים של C-FLIP_L בדיסק גורמים לכמויות מספיקות של הטרודימרים פרוקספאז-8/c-FLIP_L בסיעת DED, התומכת בהפעלה של caspase-8. לעומת זאת, כמויות מוגברות של c-FLIP_L מובילות ישירות להשפעות האנטי-אפופטוטיות שלה בדיסק²⁰.

יחד, ההפעלה ועיבוד של procaspase-8a/b בדיסק הוא תהליך מוסדר מאוד הכולל מספר שלבים. מאמר זה דן במדידת עיבוד procaspase-8 ישירות בדיסק, כמו גם בניתוח הרכב של קומפלקס זה. פעולה זו תוצג באמצעות תקליטור CD95 כמתחם DR למופת.

Protocol

ניסויים בתאי T בוצעו על פי ההסכם האתי 42502-2-1273 Uni MD.

1. הכנת תאים לניסוי

הערה: המספר הממוצע של תאים עבור אימונופרציפיטציה זו הוא 1 × 10⁷_. תאים דבקים צריכים להיות זרע יום אחד לפני הניסוי, כך שיש 1 × 10⁷ תאים ביום הניסוי.

1. הכנת תאים חסידיים לניסוי
   1. זרע 5-8 × 10⁶ תאים דבקים ב 20 מ"ל של בינוני (ראה טבלת החומרים עבור הרכב) עבור כל תנאי ב 14.5 ס"מ מנות יום אחד לפני תחילת הניסוי.
   2. ביום הניסוי, ודא כי התאים הם 80-90% משוחחים ודבקים במנה. יש להשליך את המדיום ולהוסיף מדיום טרי לתאים החסידים.
2. הכנת תאי השעיה לניסוי
   1. בזהירות למקם 1 × 10⁷ תאי השעיה ב 10 מ"ל של מדיום תרבות (ראה את שולחן החומרים עבור הרכב) לכל תנאי 14.5 ס"מ מנות מיד לפני תחילת הניסוי.
   2. אם אתה משתמש בתאים ראשיים, בודד תאי T ראשיים בהתאם להליך המתואר קודם לכן²¹. לטפל בתאי T ראשוניים עם 1 מיקרוגרם / מ"ל פיטוהמגלוטינין עבור 24 שעות, ואחריו 25 U / mL IL2 טיפול במשך 6 ימים.
   3. יש למקם בזהירות 1 × 10⁸ תאי T ראשוניים ב 10 מ"ל של מדיום תרבות (ראה את טבלת החומרים עבור הרכב) לכל תנאי 14.5 ס"מ מנות מיד לפני תחילת הניסוי.
      הערה: מומלץ מספר גבוה יותר זה של תאי T ראשיים, מכיוון שתאים אלה קטנים יותר.

2. גירוי CD95L

1. לעורר את התאים עם CD95L (מיוצר כמתואר בעבר²⁰ או זמין מסחרית (ראה טבלת החומרים)).
   הערה: הריכוז של CD95L וזמן הגירוי הם תלויים בסוג התא^{13,15,22,23,24,25}. הכן מצב גירוי אחד פעמיים כדי ליצור מדגם 'בקרת חרוזים' במקביל.
   1. לעורר תאים חסידים עם הריכוז הנבחר של CD95L. החזק את הצלחת בזווית והזרימו את הליגנד למדיום מבלי לגעת בתאים החסידים.
   2. לעורר תאי השעיה עם CD95L על ידי צנרת פתרון ליגנד לתוך ההשעיה של התא.

3. קציר תאים ותסיסה

1. מניחים את הכלים הסלולריים על קרח.
   הערה: אל תמחק את המדיום. תאים גוססים צפים במדיום וחשובים לניתוח.
2. הוסף 10 מ"ל של תמיסת מלח קר פוספט חוצץ (PBS) להשעיית התא ולגרד את התאים המצורפים מהצלחת. לאסוף את ההשעיה התא בצינור 50 מ"ל.
3. לשטוף את צלחת התא עם 10 מ"ל של PBS קר פעמיים ומניחים את פתרון לשטוף לתוך אותו צינור 50 מ"ל. צנטריפוגות השעיית התא ב 500 × גרם במשך 5 דקות, 4 °C (5 °F).
4. להשליך את supernatant ו resuspend את גלולה התא עם 1 מ"ל של PBS קר. העבר את ההשעיה התאית לתוך צינור 1.5 מ"ל.
5. צנטריפוגות השעיית התא ב 500 × גרם במשך 5 דקות, 4 °C (5 °F). להשליך את supernatant ו resuspend את גלולה התא עם 1 מ"ל של PBS קר.
6. צנטריפוגות השעיית התא ב 500 × גרם במשך 5 דקות, 4 °C (5 °F). להשליך את supernatant ו resuspend את גלולה התא עם 1 מ"ל של חוצץ תמיסת (המכיל 4% קוקטייל מעכב פרוטאז). לדגור אותו במשך 30 דקות על קרח.
7. צנטריפוגות ליסאט במהירות מקסימלית (~ 17,000 × גרם)במשך 15 דקות, 4 °C (4 °F).
8. מעבירים את הסופר-נט (ליסאט) לצינור נקי. להשליך את הכדור. קח 50 μL של ליסאט בצינור אחר. לנתח את ריכוז החלבון על ידי ברדפורד assay ולקחת את כמות ליסאט המקביל 25 מיקרוגרם של חלבון בלוויון. הוסף מאגר טעינה (עיין בטבלת החומרים עבור הרכב) ל- Vial. לאחסן אותו ב -20 °C (70 °F) כמו בקרת ליסייט.

4. אימונופרציפיטציה (IP)

1. הוסף 2 μL של נוגדנים נגד APO-1 ו 10 μL של חלבון חרוזי ספרוז (מוכן כפי שהומלץ על ידי היצרן) ליסאט. הוסף רק 10 μL של החרוזים לצינור נפרד המכיל ליסאט (מדגם מגורה) כדי ליצור 'בקרת חרוזים'.
   הערה: השתמש טיפים pipet עם פתחים רחבים או על ידי חיתוך הטיפים או קניית טיפים מיוחדים עבור IP תוך טיפול חלבון חרוזים ספרוז.
2. לדגור על התערובת של ליסאט עם נוגדנים / חלבון חרוזי ספרוז עם ערבוב עדין לילה ב 4 °C (70 °F). צנטריפוגה ליסאטים עם נוגדנים / חלבון חרוזי ספרוז ב 500 × גרם במשך 4 דקות, 4 °C (4 °F). להשליך את supernatant, להוסיף 1 מ"ל של PBS קר חרוזים, ולחזור על שלב זה לפחות שלוש פעמים.
3. זרוק את סופר-טבעי. שאפו את החרוזים עדיף עם מזרק 50 μL המילטון.

5. כתם מערבי

1. הוסף 20 μL של 4x חוצץ טעינה (ראה את טבלת החומרים עבור הרכב) לחרוזים וחום ב 95 °C (10 דקות). מחממים את פקדי הלסייט ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
2. העמיסו את ה-lysates, IPs ותקן החלבון על ג'ל נתרן דודסיל סולפט (SDS) ב-12.5% (ראו טבלת החומרים להכנת הג'ל) והפעלו במתח קבוע של 80 וולט.
3. מעבירים את החלבונים מג'ל SDS לקרום ניטרוצלולוז.
   הערה: כאן, הטכניקה היבשה למחצה, ממוטבת לחלבונים מעניינים, שימשה להעברה מעל 12 דקות (25 V; 2.5 A = קבוע). השרו את קרום הניטרוצלולוז ושתי ערימות העברה מיני-גודל במאגר אלקטרופורזה (ראו טבלת החומרים להרכב, היכונו בהתאם להוראות היצרן) במשך כמה דקות לפני הכתם המערבי.
4. מניחים את הממברנה הכתומה בקופסה וחוסמים אותה למשך שעה אחת בתמיסת חסימה (0.1% Tween-20 ב- PBS (PBST) + 5% חלב). לדגור על הממברנה עם פתרון חסימה תחת תסיסה עדינה.
5. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל לשטוף.

6. זיהוי כתם מערבי

1. הוסף את הנוגדן העיקרי הראשון בדילול המצוין (ראה טבלת החומרים) לממברנה ודגר אותו למשך הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
2. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל לשטוף.
3. לדגור את הממברנה עם 20 מ"ל של נוגדן משני (מדולל 1:10,000 PBST + 5% חלב) עם רועד עדין במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
4. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל לשטוף.
5. להשליך PBST ולהוסיף כ 1 מ"ל של מצע peroxidase חזרת לממברנה.
6. זהה את האות chemoluminescent (ראה טבלת החומרים).
   הערה: זמן החשיפה ומספר התמונות שנתפסו תלויים בכמות החלבון בתא ודעת הספציפיות של הנוגדנים המשמשים. זה חייב להיות הוקם אמפירית עבור כל נוגדן המשמש לגילוי.

תוצאות

כדי לנתח גיוס caspase-8 לדיסק ועיבודו בדיסק CD95, מאמר זה מתאר זרימת עבודה קלאסית, המשלבת IP של דיסק CD95 עם ניתוח כתם מערבי. הדבר מאפשר זיהוי של מספר תכונות מרכזיות של הפעלת caspase-8 בדיסק: ההרכבה של הפלטפורמה המקרומולקולרית המפעילה caspase-8, גיוס פרוקספז-8 ל- DISC ועיבוד של קספאז יוזם זה (איור 1

Discussion

גישה זו תוארה לראשונה על ידי Kischkel ואח^'27 ופותחה בהצלחה מאז על ידי מספר קבוצות. מספר נושאים חשובים יש לשקול עבור יעיל דיסק-immunoprecipitation וניטור בעיבוד caspase-8 במתחם זה.

ראשית, זה חיוני כדי לעקוב אחר כל שלבי הכביסה במהלך immunoprecipitation. חשוב במיוחד הם צעדי הכביסה הסופיים של ח?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12.5% SDS gel	self made		for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED
14.5 cm cell dishes	Greiner	639160
acrylamide	Carl Roth	A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice	VWR	46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)	Used for pipetting beads to the lysate
anti-actin Ab	Sigma Aldrich	A2103	dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo	ALX-805-038-C100	used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Ab	cell signaling	9662 S	dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-242-C100	dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-961-0100	dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ADI-AAM-212-E	dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Ab	cell signaling	9542	dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APS	Carl Roth	9592.3
β-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	used according to manufacturer's instructions
CD95L	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-522-020-C005
chemoluminescence detector Chem Doc XRS+	Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	11 836 145 001	prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
eletrophoresis buffer	self made		10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage
glycine	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human(hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	for activation of T cells
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL	Bio Rad	161-0747	prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUFO500
lysis buffer	self made		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,  2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
medium for primary T cells	gibco by Life Technologie	21875034	adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
milk powder	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	self made		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk	self made		50 g milk powder + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	for activation of T Cells
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	use between 3-5 µL
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
scraper	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
shaker	Heidolph
sodium azide	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks	Bio Rad	170-4270	used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane	Bio Rad	170-4270	used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000