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摘要

在这里，我们提出了一种基于黄粉虫（Tenebrio molitor）诱饵系统的方案，该系统用于从土壤样品中分离和选择昆虫致病真菌（EPF）。采用有效的分生孢子数（ECN）公式，根据生理特性选择高耐压EPF，用于野外害虫微生物防治。

摘要

昆虫致病真菌（EPF）是用于综合虫害管理的微生物控制剂之一。为了控制本地或入侵性害虫，隔离和选择本地EPF非常重要。因此，本研究采用土壤饵料法与昆虫饵料（黄粉虫、 Tenebrio molitor）系统相结合，并作了一些修改。然后将分离出的EPF对农业害虫 Spodoptera litura进行毒力测试。此外，对潜在的EPF菌株进行了形态学和分子鉴定。此外，对有前景的EPF菌株进行了分生孢子生产和耐热性测定并进行了比较;这些数据被进一步替换为有效分生孢子数（ECN）公式，用于实验室排名。土壤饵料-黄粉虫系统和ECN配方可以通过替代昆虫种类和整合更多胁迫因素来改善商业化和田间应用的评价。该协议为EPF选择提供了一种快速有效的方法，并将改进生物控制剂的研究。

引言

目前，昆虫病原真菌（EPF）广泛用于农业，森林和园艺害虫的微生物控制。EPF的优点是宿主范围广，环境适应性好，环保性好，可与其他化学品配合使用，显示出病虫害综合治理的协同效应1，2。对于作为害虫控制剂的应用，有必要从患病昆虫或自然环境中分离出大量EPF。

从宿主中对这些生物体进行采样有助于了解EPF在自然宿主中的地理分布和流行率3，4，5。然而，真菌感染昆虫的收集通常受到环境因素和野外昆虫种群的限制4。考虑到昆虫宿主会在EPF感染后死亡，然后落入土壤中，从土壤样本中分离EPF可能是一种稳定的资源3，6。例如，已知腐生植物使用死亡宿主作为其生长资源。土壤饵料和选择性介质系统已被广泛用于土壤中EPF的检测和分离3，4，7，8，9，10。

在选择性培养基方法中，将稀释的土壤溶液接种到含有广谱抗生素（例如氯霉素，四环素或链霉素）的培养基上以抑制细菌的生长2，3，9，11。然而，据报道，这种方法可能会扭曲菌株的多样性和密度，并可能导致对许多微生物群落的高估或低估6。此外，分离的菌株致病性较低，并且在分离过程中与腐生植物竞争。很难从稀释的土壤溶液中分离出EPF3。土壤诱饵法不使用选择性培养基，而是将EPF与受感染的死昆虫分离出来，这些害虫可以储存2-3周，从而提供更有效和标准的EPF分离方法3，4，7，6。由于该方法易于操作，因此可以低成本分离出多种致病菌株4。因此，它被许多研究人员广泛使用。

在比较了不同类型的昆虫诱饵系统后， 贝氏 蜈蚣和 苜蓿 是最常见的EPF物种，存在于属于半翅目，鳞翅目，布拉泰拉和鞘翅目昆虫中6，12，13，14。在这些昆虫诱饵中，与其他昆虫相比， 鳞 翅目（鳞翅目）和 鞘 翅目（鞘翅目）显示出更高的 Beauveria 和 Metarhizium spp.的回收率。因此， G. mellonella 和 T. molitor 通常用于昆虫诱饵。多年来，美国农业部（USDA）建立了一个EPF图书馆（农业研究服务EPF菌种馆藏，ARSEF），其中包含各种各样的物种，包括4081种 Beauveria spp.，18种 Clonostaches spp.，878种 冬虫夏草 属，2473种 Metarhizium spp.，226种 Purpureocillium spp.， 和13种 Pochonia spp.等15。另一个EPF图书馆由美国佛蒙特大学的昆虫学研究实验室（ERL）建造，历时30年。它包括来自美国、欧洲、亚洲、非洲和中东的 1345 株 EPF16。

为了控制台湾的本地或入侵害虫，需要隔离和选择本地EPF。因此，在该协议中，我们修改并描述了土壤诱饵方法的程序，并将其与昆虫诱饵（黄粉虫， Tenebrio molitor）系统相结合17。基于该协议，建立了一个EPF库。对初步EPF分离株进行了两轮筛选（接种量定量）。EPF分离株显示出对昆虫的致病性。对潜在菌株进行形态学和分子鉴定，并通过耐热性和分生孢子生产测定法进一步分析。此外，还提出了有效分生孢子数（ECN）的概念。采用ECN公式和主成分分析（PCA），在模拟环境压力下对潜在菌株进行分析，完成EPF库的建立和筛选过程。随后，对目标害虫（例如， Spodoptera litura）测试了有希望的EPF菌株的致病性。目前的协议将耐热性和分生孢子生产数据整合到ECN公式和PCA分析中，可用作EPF相关研究的标准排名系统。

研究方案

注:整个流程图如图 1所示。

1. 潜在昆虫致病真菌（EPF）的分离和选择

  1. 收集土壤样本
    1. 去除1厘米的表层土壤，然后使用铲子从每个采样点收集5-10厘米深度内的土壤。
      注:采样点为山区、森林或人口稀少的地区，以避免人工喷洒的EPF菌株受到污染。确保土壤样品采集区域表面覆盖杂草。干燥的土壤或潮湿的土壤不适合这个实验。
    2. 记录每个采样点的详细信息，包括 GPS、海拔、田地类型、年温度、年降水量、采集时间（季节）、土壤类型和 pH 值。
    3. 将100g土壤样品收集到塑料袋中，如果在实验室中将其置于真菌分离方案3小时内，则将其保持在室温下。
      注意:如果样品在3小时内不能使用，请将土壤储存在室温下，在黑暗的条件下。如果不立即进行实验，土壤样品可以在4°C下储存1周，直到方案开始18，19。
  2. 用黄粉虫（Tenebrio molitor）诱饵并分离EPF
    1. 将100g土壤样品放入塑料杯中（盖子直径= 8.5厘米，高度= 12.5厘米），然后将5只黄粉虫在室温下在黑暗中在土壤表面放置2周。
      注意:也可以使用其他类型的塑料杯容器。如果土壤太干燥（开裂或沙质），请在土壤上喷洒灭菌的ddH 2O（约5-10毫升）。T. molitor幼虫的体长为2.5厘米（14龄），有助于真菌分离筛选20。
    2. 每天观察和记录幼虫的死亡率和真菌病;将死幼虫保存在杯中直到2周进行真菌分离。
      注意:在上述过程中，土壤样品中的真菌分生孢子将附着在黄粉虫幼虫上。当菌丝从节间膜生长时，将观察到真菌真菌病，然后整个身体将被菌丝体覆盖。孢子形成将在7天后开始，真菌感染的颜色将变为分生孢子肿块的颜色。
    3. 将死昆虫转移到干净的工作台上，并使用无菌牙签收集分生孢子。在实验室中，在四分之一强度的Sabouraud葡萄糖琼脂培养基（1/4 SDA）板（55 mm）上条纹它们21。将培养板在25°C下孵育7天，以获得真菌的初级培养物。
      注意:1/4 SDA板的制备如下:将1.5gSabouraud葡萄糖汤和3g琼脂在200mL H 2 O中混合，然后灭菌20分钟。在凝固前将1/4 SDA等分到每个55毫米培养皿中。固化的1/4 SDA板储存在4°C直至使用。
    4. 在一个55 mm 1/4 SDA板上以层流重新划线每个初级培养真菌，并将培养板在25°C下孵育7天以获得真菌的单菌落。
    5. 重复这种重新分离约2-3次，并在光学显微镜下观察以获得单个和纯的形态真菌菌落。
      注意:使用 毛利托蜈虫诱饵隔离所有 EPF 并按照下一节所述进行储存。分离、保存、纯培养和条纹必须在后续部分的层流中进行。
  3. 存储公积金分离物
    1. 用软木螟在每个分离的纯真菌培养板的边缘切下3个5mm琼脂块，并将其放入1.5mL微量离心管中作为一个重复。
      注意:在第二次 毒力测试后，建议对每个真菌分离物进行三次重复，用于EPF菌株的储存。如果存储空间有限，也建议进行分子鉴定。
    2. 使用微量移液管将250μL0.03%表面活性剂溶液（材料表）和250μL60%甘油加入1.5mL微量离心管中;然后，涡旋10秒。
    3. 用石蜡膜密封1.5mL微量离心管，并将其在-20°C冰箱中预冷24小时。然后，将预冷的真菌储备转移到-80°C冰箱中进行冷冻保存。
      注:在第1.4节中使用了额外的纯真菌培养板（冷冻保存的样品除外）。
  4. 真菌分离物的第一次 致病性筛查
    1. 在25°C下将五个 T. molitor 幼虫直接放在每个纯真菌培养板的表面上。
    2. 观察并记录真菌病和死亡率10天。选择真菌分离物进行进一步分析。
      注意:选择导致100%死亡率的真菌分离物进行第二次 毒力测试，以确认它们对 毛滴虫 幼虫的毒力。或者，研究人员可以根据自己的研究调整标准。
  5. 真菌分离物的第二次 毒力试验
    注意:根据第1次 致病性筛查，从-80°C恢复选定的真菌分离物进行第2次 毒力测试。第2次 毒力测试的目的是在第 1轮筛选后量化所选真菌分离物的致病性。
    1. 通过涡旋1分钟收获每个真菌分离物的分生孢子，并使用血细胞计数器计数分生孢子的数量。
    2. 将分生孢子悬浮液在0.03%表面活性剂溶液中调节至1×107 分生孢子/ mL的浓度（材料表）。
    3. 将10μL真菌悬浮液散布到55mm 1/4 SDA板上，并在黑暗中在25°C下生长7天。
    4. 将五 个T. molitor 幼虫直接放在每个纯真菌培养板的表面上（c.a. 6 x 107 分生孢子）。用石蜡膜密封板，并在黑暗中孵育25°C。
    5. 观察并记录真菌病和死亡率10天。
    6. 对每个真菌分离物重复测试（从步骤1.51到1.5.5），一式三份。
      注意:选择导致100%死亡率的真菌分离物进行第三次 毒力测试，以确认其针对害虫的毒力。
  6. 目标害虫真菌分离物的第三次 毒力试验（以Spodoptera litura 为例）
    1. 使用来自第二 毒力的选定分离株重复步骤1.5.2至1.5.6，以测试对目标害虫的毒力。
    2. 计算每个真菌分离物的LT5022。
      注:每种真菌分离物的LT50 是使用R studio（版本3.4.1）通过广义线性模型（GLMs）计算的;准二项式误差分布和对数链接函数可用于解释过度分散。

2. 公积金的分子鉴定

  1. 真菌基因组DNA的提取
    1. 从7天1/4 SDA板中收集c.a.1 cm2 EPF。
    2. 根据制造商的说明使用真菌 基因组DNA提取试剂盒提取真菌基因组DNA23 （材料表）。
  2. PCR 扩增和 DNA 测序
    1. 使用PCR预混液（2x），ITS1F / ITS4R引物组24（表1）和以下PCR程序通过DNA样品21的PCR扩增真菌ITS区域:94°C持续1分钟，然后在94°C下循环30秒，55°C持续30秒，72°C持续1分钟，然后在72°C下最终延伸7分钟。
      注意:ITS1F/ITS4R 引物集用于属级鉴定。
    2. 通过商业测序服务对PCR进行测序。
    3. 使用NCBI BLAST在NCBI数据库中搜索类似的真菌，并选择相对真菌类型物种进行系统发育分析。
      注:属于 Metarhizium 或 Beauveria 属的真菌物种应使用tef-983F / tef-2218R引物集25 进一步确定到物种水平（重复步骤2.1.1至2.2.3）。对于不属于 Metarhizium 或 Beauveria 属的真菌，可以使用其他分子标记来鉴定该物种，包括 DNA裂解酶 （APN2）， β微管蛋白 （BTUB）， RNA聚合酶II最大亚基 （RPB1）， RNA聚合酶II第二大亚基 （RPB2）和 翻译伸长因子1α （TEF）的3'部分25，26.
  3. 系统发育分析
    1. 使用 ClustalX 2.1 software27 对齐步骤 2.2.2 和 2.2.3 中的多个序列。使用 GeneDoc28 手动修剪保守序列区域。
    2. 通过 MEGA7 software29 根据最小进化 （ME）、邻接连接 （NJ） 和最大似然 （ML） 方法执行系统发育分析。
      注意:执行所有这三种方法都有助于确认并准确结束分类状态。第1次 致病性筛选筛选的真菌分离物用于属级分子鉴定。通过第2次 毒力试验筛选的真菌分离物用于物种水平的分子和形态学鉴定。

3. 公积金的形态学鉴定

  1. 真菌菌落形态的观察
    1. 使用相机捕捉真菌培养群落生长7天，并记录菌落的生长，形式（蓬松，坚固）和颜色。
  2. 观察分生孢子和分生孢子
    1. 用接种回路从纯培养真菌菌落中刮下分生孢子，并将孢子转移到具有0.1%吐温80溶液的载玻片上。然后，用盖玻片盖住，以便对分生孢子进行光学显微镜观察。
    2. 使用手术刀在真菌菌落边缘切开5mm 2 的琼脂链，然后将琼脂块转移到载玻片上。
    3. 按如下方式进行清洁:用塑料滴管将0.1%吐温80溶液加入琼脂块上，然后用镊子洗掉大部分多余的分生孢子。然后，用盖玻片盖住它，以进行光显微镜观察。
      注意:0.1%吐温80可以用另一种更有效的表面活性剂代替（材料表），具体取决于真菌种类和疏水性。
    4. 测量并记录分生孢子和分生孢子团的宽度和长度，以比较不同真菌分离物之间的差异。
    5. 使用韦尔奇的方差分析检验和Games-Howell检验（事后检验）使用R studio（版本3.4.1）分析每个菌株的分生体宽度和长度。
      注:形态特征的数据分析可按事例进行调整。用第3次 毒力测试筛选的真菌分离物用于第4和第5部分的生理表征和ECN排名。

4. 分生孢子生产率和耐热性研究

  1. 分生孢子生产测定
    1. 将选定的真菌分离物在25±1°C的1/4 SDA培养基上在黑暗中培养10天。
    2. 在0.03%表面活性剂溶液中制备1mL真菌分离物的分生孢子悬浮液，并如上所述调整至1×107 分生孢子/ mL。
    3. 在1/4 SDA上滴下三滴10μL分生孢子悬浮液，并在黑暗中在25°C下孵育7，10和14天以计数真菌的孢子化。
      注意:10μL是收集5mm块的最佳体积，在真菌生长7-14天后均匀真菌孢子化。
    4. 使用软木螟从菌落中心分离5mm琼脂块，并在每个时间点转移到1.5mL微量离心管中的1mL0.03%表面活性剂溶液（材料表）。
    5. 在室温下以3，000rpm涡旋管15分钟，并使用血细胞计数器计数分生孢子的数量。
      注意:用于计数的公式是最小细胞的每25个方形的分生孢子数（大小= 0.025 mm2;腔室深度= 0.1 mm）:
      5个方块÷80个×的分生孢子总数（4个×106个）
    6. 对每个分离株重复三次。
  2. 耐热性测定
    1. 将选定的真菌分离物在25±1°C的1/4 SDA培养基上在黑暗中培养10天。
    2. 在0.03%表面活性剂溶液中制备1mL真菌分离物的分生孢子悬浮液，并如上所述调整至1×107 分生孢子/ mL。
    3. 涡旋壳体悬浮液，并在45°C干浴中加热0，30，60，90和120分钟。在热暴露后的每个时间点，将三滴5μL分生孢子悬浮液滴在55 mm 1/4 SDA培养基上，并在25±1°C下孵育18小时。
      注意:避免传播真菌液滴，以便能够更好地聚焦该区域。
    4. 在200x光学显微镜下，用五个随机选择的田数计算发芽的分生孢子的数量，以确定发芽率。
    5. 对每个分离株执行三次复制。

5. 有效分生孢子数 （ECN） 排名

  1. 电子网卡计算
    注意:在计算总ECN21之前，获取每个潜在真菌菌株的分生孢子产量和耐热性数据。
    1. 计算每个时间点分生孢子产生的折叠变化（FC）:
      figure-protocol-6229
      其中，x = 数据收集的时间点;ncp = 生长后每天的分生孢子数量;和 I = 种子分生孢子的初始数量。
    2. 使用以下公式计算每个时间点在压力处理下的分生孢子数:
      figure-protocol-6432
      其中，y = 所处理时间点的ECN;TT0 = 未经历热应激的分生孢子的萌发率（=发芽速率为0 min热处理）;TTz = 应力系数是不同热处理时间（z）的分生孢子萌发率。
    3. 使用以下公式计算总ECN:
      figure-protocol-6675
    4. 比较每种真菌菌株的ECN。
  2. 真菌菌株的主成分分析（PCA）
    注:PCA分析证实了ECN的排名，并有助于理解生理特征值之间的相关性。比较 ECN 值并选择具有较高 ECN 值的 EPF 分离器。
  3. 使用 R 软件通过编码创建 PCA:
    #Input PCA 数据文件
    a = read.table（"PCA.csv"，sep='，'，header=T）
    1. # 处理示例数据
      row.names（a） <- c（"NCHU-9"，"NCHU-11"，"NCHU-64"，"NCHU-69"，"NCHU-95"，"NCHU-113"）
      X=行名称（a）
      df<- a[2:11]
    2. #PCA计算
      pca <- prcomp（df， center = TRUE， scale = TRUE）
      vars <- （pca$sdev）^2
      pc1_percent = vars[1] / sum（vars）
      pc2_percent = vars[2] / sum（vars）
      值 = pca$x
    3. #Output PCA 可视化文件
      png（file = 'pca.png'， height = 2000， width = 2000， res = 300）
      注意:使用7至14天的分生孢子生产和所有耐热性数据来执行主成分分析（PCA）以确认ECN排名。
  4. 根据ECN或PCA选择性能最佳的真菌菌株，并对目标害虫进行毒力测试以进行进一步研究。

结果

潜在昆虫病原真菌（EPF）的分离和选择
通过使用Tenebrio molitor介导的昆虫致病真菌（EPF）文库构建方法，可以排除没有杀虫活性的真菌数量;因此，可以大大提高EPF的隔离效率和选择。在该方法的应用过程中，记录了采样地点，土壤样品和真菌发芽率的信息（表2）。根据我们之前的数据，从172个土壤样品中共获得101个真菌分离物，表明分?...

讨论

昆虫致病真菌（EPF）已被用于昆虫控制。有几种方法可以分离，选择和鉴定EPF30，31，32。比较不同种类的昆虫诱饵方法，在昆虫诱饵中常见于贝氏苜蓿和茴香6、12、13、14。在这些昆虫诱饵中，Galleria mellonella和<...

披露声明

作者声明，这项工作不涉及利益冲突。

致谢

这项研究得到了科学和技术部（MOST）的资助109-2313-B-005 -048 -MY3的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar Bacteriological gradeBIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.AGR001Suitable in most cell culture/molecular, biology applications.
AGAROSE, Biotechnology GradeBIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.AGA001For DNA electrophoresis.
BioGreen Safe DNA Gel BufferBIOMANSDB001T
Brass cork borerDoggerD89A-44001
Canon kiss x2CanonEOS 450DFor record strain colony morphology
Constant temperature incubatorYihder Co., Ltd.LE-509RDFungal keeping.
cubee Mini-CentrifugeGeneReachMC-CUBEE
DigiGel 10 Digital Gel Image SystemTOPBIODGIS-12S
Finnpipette F2 0.2 to 2 µL PipetteThermo Scientific4642010
Finnpipette F2 1 to 10 µL PipetteThermo Scientific4642030
Finnpipette F2 10 to 100 µL PipetteThermo Scientific4642070
Finnpipette F2 100 to 1000 µL PipetteThermo Scientific4642090
Finnpipette F2 2 to 20 µL PipetteThermo Scientific4642060
Finnpipette F2 20 to 200 µL PipetteThermo Scientific4642080
GeneAmp PCR System 9700Applied Biosystems4342718
GenepHlow Gel/PCR KitGeneaidDFH100
Genius Dry Bath IncubatorMajor ScienceMD-01N
Graduated Cylinder Custom A 100mLSIBATASABP-1195906Measure the volume of reagents.
Hand tally counterSDINO.1055
HemocytometerbiomanAP-0650010Calculate the number of spore
Inoculating loopDoggerD8GA-23000
lidIDEAHOUSERS92004
Micro cover glassMUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD24241
Microscope imaging systemSAGE VISION CO.,LTDSGHD-3.6C
Microscope SlidesDOGGERDG75001-07105
Mupid-2plus DNA Gel ElectrophoresisADVANCEAD110
Nikon optical microscopeSAGE VISION CO.,LTDEclipse CI-L
Plastic cupIDEAHOUSECS60016
Presto Mini gDNA Yeast KitGeneaidGYBY300Fungal genomic DNA extraction kit
Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium)HiMedia Leading BioSciences CompanyM033Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms.
Scalpel Blade No.23Swann-Morton310
Scalpel Handle No.4AGARWAL SURGICALSSSS -FOR-01-91
ShovelSave & SafeA -1580242 -00
Silwet L-77bioman(phytotech)S7777Surfactant
Sorvall Legend Micro 17 MicrocentrifugeThermo Scientific75002403
Steel TweezersSIPEL ELECTRONIC SAGG-SA
Sterile Petri DishBIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.1621Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use.
ThermoCell MixingBlockBIOERMB-101
Tween 80FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation164-21775
TwinGuard ULT FreezerPanasonic Healthcare Holdings Co., Ltd.MDF-DU302VX-80°C sample stored.
Vertical floor type cabinetChih ChinBSC-3Fungal operating culturing.
Vortex Genie IIScientificSIG560
Zipper storage bagsSave & SafeA -1248915 -00
100 bp DNA LadderGeneaidDL007
-20°C FreezerFRIGIDAIREFrigidaire FFFU21M1QW-20°C sample and experimental reagents stored.
2X SuperRed PCR Master MixTOOLSTE-SR01
50X TAE BufferBIOMANTAE501000

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