JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, toprak örneklerinden entomopatojenik mantarların (EPF) izole edilmesi ve seçilmesi için kullanılan yemek kurdu (Tenebrio molitor)-yem sistemine dayanan bir protokol sunuyoruz. Sahada zararlı mikrobiyal kontrolü için fizyolojik özelliklere göre yüksek strese dayanıklı EPF seçmek için etkili bir konidia sayısı (ECN) formülü kullanılır.

Özet

İntomopatojenik mantarlar (EPF), entegre haşere yönetimi için mikrobiyal kontrol ajanlarından biridir. Yerel veya istilacı zararlıları kontrol etmek için, yerli EPF'yi izole etmek ve seçmek önemlidir. Bu nedenle, bu çalışmada böcek yemi (yemek kurdu, Tenebrio molitor) sistemi ile birlikte toprak yem yöntemi bazı değişikliklerle kullanılmıştır. İzole EPF daha sonra tarım zararlısı Spodoptera litura'ya karşı virülans testine tabi tutuldu. Ayrıca, potansiyel EPF suşları morfolojik ve moleküler tanımlamalara tabi tutulmuştır. Ek olarak, konidia üretimi ve termotolerans tahlilleri umut verici EPF suşları için yapıldı ve karşılaştırıldı; bu veriler laboratuvar sıralaması için etkili konidia sayısı (ECN) formülüne daha da ikame edilmiştir. Toprak yemi-yemek kurdu sistemi ve ECN formülü, böcek türlerinin değiştirilmesi ve ticarileştirme ve saha uygulamasının değerlendirilmesi için daha fazla stres faktörü entegre edilerek geliştirilebilir. Bu protokol, EPF seçimi için hızlı ve verimli bir yaklaşım sağlar ve biyolojik kontrol ajanları üzerindeki araştırmaları geliştirecektir.

Giriş

Şu anda, entomopatojenik mantarlar (EPF) tarım, orman ve bahçecilik zararlılarının mikrobiyal kontrolünde yaygın olarak kullanılmaktadır. EPF'nin avantajları geniş konak çeşitleri, iyi çevresel adaptasyon kabiliyeti, çevre dostu doğası ve entegre haşere yönetimi için sinerjik etkiyi göstermek için diğer kimyasallarla birlikte kullanılabilmesidir1,2. Bir haşere kontrol ajanı olarak uygulama için, çok sayıda EPF'yi hastalıklı böceklerden veya doğal ortamdan izole etmek gerekir.

Bu organizmaların konaklarından örneklemesi, EPF'nin doğal konaklarda coğrafi dağılımını ve yaygınlık oranını anlamaya yardımcı olur3,4,5. Bununla birlikte, mantar enfekte böceklerin toplanması genellikle alandaki çevresel faktörler ve böcek popülasyonları ile sınırlıdır4. Böcek konakçılarının EPF enfeksiyonundan sonra öleceği ve daha sonra toprağa düşeceği göz önüne alındığında, EPF'nin toprak örneklerinden izole edilmesi istikrarlı bir kaynak olabilir3,6. Örneğin, saprofitlerin büyüme için kaynakları olarak ölü konağı kullandıkları bilinmektedir. Toprak yemi ve seçici orta sistemler, EPF'yi topraktan tespit etmek ve izole etmek için yaygın olarak kullanılmıştır3,4,7,8,9,10.

Seçici ortam yönteminde, seyreltilmiş toprak çözeltisi, bakterilerin büyümesini engellemek için geniş spektrumlu antibiyotikler (örneğin, kloramfenikol, tetrasiklin veya streptomisin) içeren bir ortama kaplanır2,3,9,11. Bununla birlikte, bu yöntemin türün çeşitliliğini ve yoğunluğunu bozabileceği ve birçok mikrobiyal topluluğun aşırı veya az tahmin edilmesine neden olabileceği bildirilmiştir6. Ayrıca, izole suşlar daha az patojeniktir ve izolasyon sırasında saprofitlerle rekabet eder. EPF'yi seyreltilmiş toprak çözeltisinden izole etmek zordur3. Seçici bir ortam kullanmak yerine, toprak yem yöntemi EPF'yi 2-3 hafta saklanabilen enfekte ölü böceklerden izole eder, böylece daha verimli ve standart bir EPF ayırma yöntemi sağlar3,4,7,6. Yöntemin kullanımı kolay olduğundan, çeşitli patojenik suşları düşük maliyetle izole edebilirsiniz4. Bu nedenle, birçok araştırmacı tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır.

Farklı böcek yem sistemleri karşılaştırıldıktan sonra, Beauveria bassiana ve Metarhizium anisopliae, Hemiptera, Lepidoptera, Blattella ve Coleoptera6,12,13,14'e ait böceklerde bulunan en yaygın EPF türleridir. Bu böcek yemleri arasında, Galleria mellonella (Sipariş Lepidoptera) ve Tenebrio molitor (sipariş Coleoptera) beauveria ve Metarhizium spp. Bu nedenle, G. mellonella ve T. molitor genellikle böcek yemleme için kullanılır. Yıllar içinde, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) bir EPF Kütüphanesi (EPF kültürlerinin Tarımsal Araştırma Hizmeti Koleksiyonu, ARSEF) 4081 Beauveria spp., 18 Clonostachys spp., 878 Cordyceps spp., 2473 Metarhizium spp., 226 Purpureocillium spp. türü dahil olmak üzere çok çeşitli türler içerir. ve 13 Pochonia türü. Bir diğer EPF Kütüphanesi ise Amerika Birleşik Devletleri'ndeki Vermont Üniversitesi'nden Entomoloji Araştırma Laboratuvarı (ERL) tarafından 30 yıllığına inşa edilmiştir. Amerika Birleşik Devletleri, Avrupa, Asya, Afrika ve Orta Doğu16'dan 1345 EPF suşunu içerir.

Tayvan'daki yerel veya istila zararlılarını kontrol etmek için, yerli EPF'nin izolasyonu ve seçimi gereklidir. Bu nedenle, bu protokolde, toprak yem yönteminin prosedürünü değiştirdik ve tanımladık ve böcek yemi (yemek kurdu, Tenebrio molitor) sistemi ile birleştirdik17. Bu protokole dayanarak bir EPF kütüphanesi kuruldu. Ön EPF izolatları için iki tur tarama (aşılamanın nicelleştirilmesi) yapıldı. EPF izolatları böceklere patojeniklik gösterdi. Potansiyel suşlar morfolojik ve moleküler tanımlamalara tabi tutuldu ve termotolerans ve konidiyal üretim tahlilleri ile daha fazla analiz edildi. Ayrıca, etkili bir konidia sayısı (ECN) kavramı da önerildi. ECN formülü ve ana bileşen analizi (PCA) kullanılarak, potansiyel suşlar EPF kütüphanesinin kurulması ve taranmasının sürecini tamamlamak için simüle edilmiş çevresel basınç altında analiz edildi. Daha sonra, umut verici EPF suşlarının patojenitesi hedef haşere için test edildi (örneğin, Spodoptera litura). Mevcut protokol, termotolerans ve konidiyal üretim verilerini, EPF ile ilgili araştırmalar için standart bir sıralama sistemi olarak kullanılabilecek ECN formülüne ve PCA analizine entegre eder.

Protokol

NOT: Tüm akış çizelgesi Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Potansiyel Entomopatojenik mantarların izolasyonu ve seçimi (EPF)

  1. Toprak örneğini toplayın
    1. Yüzey toprağının 1 cm'lik kısmını çıkarın ve ardından her örnekleme alanından bir kürek kullanarak toprağı 5-10 cm derinlikte toplayın.
      NOT: Örnekleme alanları, yapay olarak püskürtülen EPF suşlarının kirlenmesini önlemek için dağ, orman veya seyrek nüfuslu alanlar olacaktır. Toprak numunelerinin toplanması için alanların yüzeyde oğla kaplı olduğundan emin olun. Kuru toprak veya nemli toprak bu deney için uygun değildir.
    2. GPS, yükseklik, alan türü, yıllık sıcaklık, yıllık yağış, toplama süresi (mevsim), toprak tipi ve pH değeri dahil olmak üzere her örnekleme alanının ayrıntılarını kaydedin.
    3. 100 g toprak örneğini plastik bir torbaya toplayın ve 3 saat içinde laboratuvarda mantar izolasyon protokolüne tabi tutarsanız oda sıcaklığında muhafaza edin.
      NOT: Numune 3 saat içinde kullanılamıyorsa, toprağı karanlık koşullarda oda sıcaklığında saklayın. Deney hemen yapılmazsa, toprak örneği protokolün başlangıcına kadar 1 hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir18,19.
  2. EPF'yi yemek kurdu ile yemleme ve izole etme (Tenebrio molitor)
    1. Toprak örneğinin 100 g'ını plastik bir kaba yerleştirin (kapak çapı = 8,5 cm, yükseklik = 12,5 cm) ve ardından 2 hafta boyunca karanlıkta oda sıcaklığında toprak yüzeyine 5 yemek kurdu yerleştirin.
      NOT: Diğer plastik bardak kapları da kullanılabilir. Topraklar çok kuruysa (çatlak veya kumlu), topraklara sterilize edilmiş ddH2O (yaklaşık 5-10 mL) püskürtün. T. molitor larvalarının vücut uzunluğu c.a. 2.5 cm (14. instar) mantar izole ekranlarında yardımcı olur20.
    2. Larvaları mortalite ve mikoz için günlük olarak gözlemleyin ve kaydedin; ölü larvaları mantar izolasyonu için 2 haftaya kadar bardakta tutun.
      NOT: Toprak örneklerindeki mantar konidia sporları, yukarıdaki işlem sırasında yemek kurdu larvalarına yapışacaktır. Mantar mikozu, hyphae intersegmental membrandan büyüdükçe gözlenecek ve daha sonra tüm vücut miselyum ile kaplanacaktır. Sporülasyon 7 gün sonra başlayacak ve mantar enfeksiyonunun rengi konidia kütlesinin rengine değişecektir.
    3. Ölü böcekleri temiz bir banka aktarın ve konidia toplamak için steril bir kürdan kullanın. Laboratuvarda çeyrek mukavemetli Sabouraud dekstroz agar orta (1/4 SDA) plaka (55 mm) üzerinde çizgi21. Mantarların birincil kültürünü elde etmek için kültür plakasını 7 gün boyunca 25 ° C'de kuluçkaya yatırın.
      NOT: 1/4 SDA plakası aşağıdaki gibi hazırlanır: 200 mL H2O'da 1,5 g Sabouraud dekstroz suyu ve 3 g agar karıştırın ve ardından 20 dakika sterilize edin. Katılaşmadan önce her 55 mm Petri kabına Aliquot 1/4 SDA. Katılaştırılmış 1/4 SDA plakalar kullanıma kadar 4 °C'de saklanır.
    4. Her birincil kültür mantarını laminer bir akışta bir 55 mm 1/4 SDA plakasında yeniden çizin ve tek bir mantar kolonisi elde etmek için kültür plakasını 7 gün boyunca 25 °C'de kuluçkaya yatırın.
    5. Bu yeniden izolasyonu ~2-3 kez tekrarlayın ve tek ve saf morfolojik mantar kolonileri elde etmek için ışık mikroskopisi altında gözlemleyin.
      NOT: T. molitor-bait kullanarak tüm EPF'yi izole edin ve aşağıdaki bölümde açıklandığı gibi saklayın. Ayırma, koruma, saf kültür ve çizgileme sonraki bölümlerde laminer bir akışta yapılmalıdır.
  3. EPF yalıtlarını depolama
    1. Her izole saf mantar kültürlü plakanın kenarındaki 5 mm'lik agar bloklarından 3'ünü mantar boreriyle kesin ve bir kopya olarak 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne yerleştirin.
      NOT: 2. virülans testinden sonra EPF suşlarının depolanması için her mantar yalıtımı için üç çoğaltma önerilir. Depolama alanı sınırlıysa moleküler tanımlama da önerilir.
    2. Bir mikropipette kullanarak 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne 250 μL% 0,03 yüzey aktif çözelti (Malzeme Tablosu) ve 250 μL% 60 gliseol ekleyin; sonra, 10 s için girdap.
    3. 1,5 mL mikro santrifüj tüpünü parafin filmi ile kapatın ve 24 saat boyunca -20 °C buzdolabında ön soğutmayın. Daha sonra, önceden havalandırılmış mantar stoklarını kriyoprezervasyon için -80 °C buzdolabına aktarın.
      NOT: Bölüm 1.4'te ekstra saf mantar kültürü plakaları (kriyo ile korunmuş örneklerin yanı sıra) kullanılmıştır.
  4. Mantar izoleleri için 1. patojeniklik ekranı
    1. Beş T. molitor larvasını doğrudan 25 ° C'deki her saf mantar kültür plakasının yüzeyine yerleştirin.
    2. Mikozu ve mortaliteyi 10 gün boyunca gözlemleyin ve kaydedin. Daha fazla analiz için mantar izole seçin.
      NOT: %100 mortaliteye neden olan mantar izolatları, T. molitor larvalarına virülanslarını doğrulamak için 2. virülans testi için seçilir. Alternatif olarak, araştırmacı kriterleri kendi çalışmalarına göre ayarlayabilir.
  5. Mantar izolatlarının 2. virülans testi
    NOT: 1. patojenite ekranına dayanarak, seçilen mantar izolatlarını 2. virülans testi için -80 °C'den kurtarın. 2. virülans testinin amacı, seçilen mantar izolatlarının 1.
    1. Her mantarın konidiasını 1 dakika boyunca girdapla izole edin ve bir hemositometre kullanarak konidia sayısını sayın.
    2. Konidia süspansiyonu% 0,03 yüzey aktif çözeltisinde (Malzeme Tablosu) 1 x 107 konidia/ mL konsantrasyonuna ayarlayın.
    3. Mantar süspansiyonunun 10 μL'lik kısmını 55 mm 1/4 SDA plakaya yayın ve karanlıkta 25 °C'de 7 gün boyunca büyüyün.
    4. Beş T. molitor larvasını doğrudan her saf mantar kültür plakasının yüzeyine yerleştirin (c.a. 6 x 107 conidia). Plakaları parafin filmi ile kapatın ve karanlıkta 25 °C'de kuluçkaya yatırın.
    5. Mikozu ve mortaliteyi 10 gün boyunca gözlemleyin ve kaydedin.
    6. Her mantar izolesi için testi (adım 1.51'den 1.5.5'e) üç taraflı olarak tekrarlayın.
      NOT: %100 mortaliteye neden olan mantar izolatları, zararlıyı hedeflemek için virülanslarını doğrulamak için 3.
  6. Hedef haşere için mantar izolelerinin 3. virülans testi (örnek olarak Spodoptera litura )
    1. Hedef zararlılara karşı virülansı test etmek için 2. virülanstan seçilen izolatlarla 1.5.2 ile 1.5.6 adımlarını tekrarlayın.
    2. Her mantar izolesinin LT50'sini hesaplayın22.
      NOT: Her mantar izolatının LT50'si , R stüdyosu (sürüm 3.4.1) kullanılarak genelleştirilmiş doğrusal modeller (GLM'ler) aracılığıyla hesaplanmıştır; yarıbinomial hata dağılımı ve günlük bağlantısı işlevi, aşırı dağıtımı hesaba katmak için kullanılabilir.

2. EPF'nin moleküler tanımlaması

  1. Mantar genomik DNA'sının çıkarılması
    1. 7 günlük 1/4 SDA plakadan c.a. 1 cm2 EPF toplayın.
    2. Mantar genomik DNA'sını, üreticinin talimatlarına göre bir mantar genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak çıkarın23 (Malzeme Masası).
  2. PCR amplifikasyonu ve DNA dizilimi
    1. Aşağıdaki PCR programı ile PCR Master Mix (2x), ITS1F /ITS4R astar seti24 (Tablo 1) kullanarak DNA örneğinin PCR'si ile Fungal ITS bölgesini güçlendirin: 1 dakika için 94 °C, ve ardından 30 s için 94 °C 35 döngü, 30 s için 55 °C ve 1 dakika için 72 °C, ardından 72 °C'de 7 dakikalık son uzatma.
      NOT: ITS1F/ITS4R astar seti cins seviyesi tanımlaması içindir.
    2. PCR'yi ticari sıralama hizmetine göre sıralayın.
    3. NCBI veritabanında benzer mantarlar için NCBI BLAST aramasını kullanın ve filogenetik analiz için göreli mantar türü türlerini seçin.
      NOT: Metarhizium veya Beauveria cinsine ait mantar türleri tef-983F/tef-2218R astar seti25 ile tür seviyesine daha fazla tanımlanmalıdır (2.1.1 ila 2.2.3 arası tekrar adımlar). Metarhizium veya Beauveria cinsine ait olmayan mantarlar için, DNA lyase (APN2), beta tubulin (BTUB), RNA polimeraz II en büyük alt ünlem (RPB1), RNA polimeraz II ikinci büyük alt bira (RPB2) ve çeviri uzama faktörü 1 alfanın (TEF)3' kısmı dahil olmak üzere türleri tanımlamak için diğer moleküler belirteçler kullanılabilir. .
  3. Filogenetik analiz
    1. 2.2.2 ve 2.2.3 adımlarındaki birden çok diziyi hizalamak için ClustalX 2.1 software27'yi kullanın. GeneDoc28 ile rezerve edilen diziler bölgesini manuel olarak kırpın.
    2. Mega7 software29 tarafından yapılan filogenetik analizi minimum evrim (ME), Komşu Birleştirme (NJ) ve maksimum olasılık (ML) yöntemlerine göre gerçekleştirin.
      NOT: Her üç yöntemin de gerçekleştirilmesi, sınıflandırma durumunun onaylanmasına ve doğru bir şekilde sonuçlandırılmasına yardımcı olabilir. 1. patojenite ekranı tarafından taranılan mantar izolatları cins düzeyinde moleküler tanımlama için kullanılır. 2. virülans testi ile taranan mantar izolatları tür düzeyinde moleküler ve morfolojik tanımlama için kullanılır.

3. EPF'nin morfolojik tanımlaması

  1. Mantar kolonisi morfolojisinin gözlemlenmesi
    1. Mantar kültürü koloni büyümesini 7 gün boyunca yakalamak ve kolonilerin büyümesini, formunu (kabarık, sıkı) ve rengini kaydetmek için bir kamera kullanın.
  2. Konidia ve konidiophores gözlemi
    1. Konidia'yı aşı döngüsü ile saf kültür mantar kolonisinden kazıyın ve sporları% 0.1 Tween 80 çözeltisi ile cam bir kaydırağa aktarın. Daha sonra, konidianın hafif mikroskobik gözlemi için bir kapakla örtün.
    2. Mantar kolonisinin kenarındaki hyphal telinin 5 mm2'lik bir agar bloğunu kesmek için bir neşter kullanın ve ardından agar bloğunu cam bir kaydırağa aktarın.
    3. Temizliği aşağıdaki gibi yapın: Agar bloğuna% 0.1 Ara 80 çözeltisini plastik bir damlalık ile ekleyin ve fazla konidianın çoğunu cımbız kullanarak yıkayın. Ardından, hafifmikroskopik gözlem için bir kapakla örtün.
      NOT: %0,1 Ara 80, mantar türlere ve hidrofobikliğe bağlı olarak başka bir güçlü yüzey aktif madde (Malzeme Masası) ile değiştirilebilir.
    4. Farklı mantar izolatları arasındaki farkları karşılaştırmak için konidia ve konidiophores'un genişliğini ve uzunluğunu ölçün ve kaydedin.
    5. R stüdyosu (sürüm 3.4.1) kullanarak her bir gerinimin konidiyal genişliğini ve uzunluğunu analiz etmek için Welch'in ANOVA testini ve Games-Howell testini (post-hoc testi) kullanın.
      NOT: Morfolojik karakterlerin veri analizi vakalara göre ayarlanabilir. 3. virülans testi ile taranan mantar izolatları, 4. ve 5. bölümlerde fizyolojik karakterizasyon ve ECN sıralaması için kullanılmaktadır.

4. Konidiyal verimlilik ve termotolerans araştırması

  1. Conidial üretim tahlil
    1. Seçilen mantarı 10 gün boyunca karanlıkta 25 ± 1 °C'de 1/4 SDA ortamında kültüre edin.
    2. Mantar izolesinin konidial süspansiyonunun 1 mL'sini% 0,03 yüzey aktif çözeltide hazırlayın ve yukarıda açıklandığı gibi 1 x 107 konidia / mL'ye ayarlayın.
    3. 1/4 SDA'ya 10 μL konidial süspansiyondan oluşan üç damlacık bırakın ve mantarların sporülasyonunu saymak için 7, 10 ve 14 gün boyunca karanlıkta 25 °C'de kuluçkaya yatırın.
      NOT: 10 μL, 7-14 gün boyunca mantar büyümesinden sonra mantar sporülasyonu ile 5 mm bloğu toplamak için en iyi hacimdir.
    4. Mantar borerini kullanarak 5 mm'lik agar bloğunu koloninin merkezinden ayırın ve her zaman noktasında 1,5 mL mikro santrifüj tüpünde %0,03 yüzey aktif çözeltisinin (Malzeme Masası) 1 mL'sine aktarın.
    5. Tüp 15 dakika boyunca oda sıcaklığında 3.000 rpm'de girdap ve konidia sayısını saymak için bir hemositometre kullanın.
      NOT: Sayım için kullanılan formül, en küçük hücrenin 25 karesi başına konidia sayısıdır (boyut = 0,025 mm2; oda derinliği = 0,1 mm):
      5 karede toplam conidia no ÷ 80 × (4 × 106)
    6. Her ayırma için üç kez tekrarlayın.
  2. Termotolerans tahlil
    1. Seçilen mantarı 10 gün boyunca karanlıkta 25 ± 1 °C'de 1/4 SDA ortamında kültüre edin.
    2. Mantar izolesinin konidial süspansiyonunun 1 mL'sini% 0,03 yüzey aktif çözeltide hazırlayın ve yukarıda açıklandığı gibi 1 x 107 konidia / mL'ye ayarlayın.
    3. Konidial süspansiyonu vorteks edin ve 45 °C kuru banyoda 0, 30, 60, 90 ve 120 dakika ısıtın. 55 mm 1/4 SDA ortamına 5 μL'lik üç damlacık bırakın ve ısıya maruz kalma sonrası her zaman noktasında 18 saat boyunca 25 ± 1 °C'de kuluçkaya yatırın.
      NOT: Bölgeye daha iyi odaklanabilmek için mantar damlacıklarını yaymaktan kaçının.
    4. Çimlenme oranını belirlemek için 200x ışık mikroskopisi altında rastgele seçilmiş beş alana sahip çimlenmiş konidia sporlarının sayısını sayın.
    5. Her yalıt için üç çoğaltma gerçekleştirin.

5. Etkili konidia sayısı (ECN) sıralaması

  1. ECN hesaplaması
    NOT: Toplam ECN21'i hesaplamadan önce her potansiyel mantar suşunun konidiyal üretim ve termotolerans verilerini elde edin.
    1. Her zaman noktasında konidial üretimin kat değişimini (FC) hesaplayın:
      figure-protocol-13873
      burada, x = veri toplama için zaman noktası; ncp = büyümenin her gününden sonra konidia sayısı; ve I = tohumlu conidia'nın ilk sayısı.
    2. Aşağıdaki formülü kullanarak her zaman noktasında stres tedavisi altındaki conidia numarasını hesaplayın:
      figure-protocol-14236
      Nerede, y = tedavi altındaki zaman noktasının ECN'si; TT0 = ısı stresine maruz olmayan konidia çimlenme oranı (= 0 dk ısıl işlem çimlenme oranı); TTz = stres katsayısı, farklı ısıl işlem zamanlarında konidia çimlenme oranıdır (z).
    3. Aşağıdaki formülü kullanarak toplam ECN'yi hesaplayın:
      figure-protocol-14664
    4. Her mantar suşunun ECN'sini karşılaştırın.
  2. Mantar suşlarının ana bileşen analizi (PCA)
    NOT: PCA analizi ECN'nin sıralamasını doğrular ve fizyolojik karakter değerleri arasındaki korelasyonun anlaşılmasına yardımcı olur. ECN değerlerini karşılaştırın ve daha yüksek ECN değerlerine sahip EPF yalıtlarını seçin.
  3. Kodlama ile PCA oluşturmak için R yazılımını kullanın:
    PCA veri dosyasını #Input
    a = read.table("PCA.csv",sep=',',header=T)
    1. # Örnek veriler işlenerek
      row.names(a) <- c("NCHU-9","NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113")
      X=satır.adları(a)
      df<- a[2:11]
    2. #PCA hesaplama
      pca <- prcomp(df, merkez = DOĞRU, ölçek = DOĞRU)
      vars <- (pca$sdev)^2
      pc1_percent = vars[1] / sum(vars)
      pc2_percent = vars[2] / sum(vars)
      değer = pca$x
    3. PCA görselleştirme dosyasını #Output
      png(dosya = 'pca.png', yükseklik = 2000, genişlik = 2000, res = 300)
      NOT: ECN sıralamasını onaylamak için ana bileşen analizini (PCA) yürütmek için 7 ila 14 gün düzenli üretim ve tüm termotolerans verilerini kullanın.
  4. ECN veya PCA'ya dayalı en iyi performans gösteren mantar suşlarını seçin ve daha fazla araştırma için hedef zararlıların virülans testini gerçekleştirin.

Sonuçlar

Potansiyel Entomopathogenic mantarların izolasyonu ve seçimi (EPF)
Tenebrio molitor aracılı Entomopathogenic mantarlar (EPF) kütüphane yapım yöntemi kullanılarak, böcek öldürme aktivitesi olmayan mantarların sayısı hariç tutulur; böylece, EPF'nin izolasyon verimliliği ve seçimi büyük ölçüde artırılabilir. Bu yöntemin uygulanması sırasında örnekleme alanlarının bilgileri, toprak örnekleri ve mantar çimlenme oranları kayded...

Tartışmalar

Böcek kontrolü için entomopatojenik mantarlar (EPF) kullanılmıştır. EPF30,31,32'yi yalıtmak, seçmek ve tanımlamak için çeşitli yöntemler vardır. Farklı böcek yem yöntemlerini karşılaştıran Beauveria bassiana ve Metarhizium anisopliae genellikle böcek yemlerinde bulundu6,12,13,14.

Açıklamalar

Yazarlar bu çalışmada çıkar çatışması olmadığını beyanlarlar.

Teşekkürler

Bu araştırma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan (MOST) Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar Bacteriological gradeBIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.AGR001Suitable in most cell culture/molecular, biology applications.
AGAROSE, Biotechnology GradeBIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.AGA001For DNA electrophoresis.
BioGreen Safe DNA Gel BufferBIOMANSDB001T
Brass cork borerDoggerD89A-44001
Canon kiss x2CanonEOS 450DFor record strain colony morphology
Constant temperature incubatorYihder Co., Ltd.LE-509RDFungal keeping.
cubee Mini-CentrifugeGeneReachMC-CUBEE
DigiGel 10 Digital Gel Image SystemTOPBIODGIS-12S
Finnpipette F2 0.2 to 2 µL PipetteThermo Scientific4642010
Finnpipette F2 1 to 10 µL PipetteThermo Scientific4642030
Finnpipette F2 10 to 100 µL PipetteThermo Scientific4642070
Finnpipette F2 100 to 1000 µL PipetteThermo Scientific4642090
Finnpipette F2 2 to 20 µL PipetteThermo Scientific4642060
Finnpipette F2 20 to 200 µL PipetteThermo Scientific4642080
GeneAmp PCR System 9700Applied Biosystems4342718
GenepHlow Gel/PCR KitGeneaidDFH100
Genius Dry Bath IncubatorMajor ScienceMD-01N
Graduated Cylinder Custom A 100mLSIBATASABP-1195906Measure the volume of reagents.
Hand tally counterSDINO.1055
HemocytometerbiomanAP-0650010Calculate the number of spore
Inoculating loopDoggerD8GA-23000
lidIDEAHOUSERS92004
Micro cover glassMUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD24241
Microscope imaging systemSAGE VISION CO.,LTDSGHD-3.6C
Microscope SlidesDOGGERDG75001-07105
Mupid-2plus DNA Gel ElectrophoresisADVANCEAD110
Nikon optical microscopeSAGE VISION CO.,LTDEclipse CI-L
Plastic cupIDEAHOUSECS60016
Presto Mini gDNA Yeast KitGeneaidGYBY300Fungal genomic DNA extraction kit
Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium)HiMedia Leading BioSciences CompanyM033Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms.
Scalpel Blade No.23Swann-Morton310
Scalpel Handle No.4AGARWAL SURGICALSSSS -FOR-01-91
ShovelSave & SafeA -1580242 -00
Silwet L-77bioman(phytotech)S7777Surfactant
Sorvall Legend Micro 17 MicrocentrifugeThermo Scientific75002403
Steel TweezersSIPEL ELECTRONIC SAGG-SA
Sterile Petri DishBIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.1621Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use.
ThermoCell MixingBlockBIOERMB-101
Tween 80FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation164-21775
TwinGuard ULT FreezerPanasonic Healthcare Holdings Co., Ltd.MDF-DU302VX-80°C sample stored.
Vertical floor type cabinetChih ChinBSC-3Fungal operating culturing.
Vortex Genie IIScientificSIG560
Zipper storage bagsSave & SafeA -1248915 -00
100 bp DNA LadderGeneaidDL007
-20°C FreezerFRIGIDAIREFrigidaire FFFU21M1QW-20°C sample and experimental reagents stored.
2X SuperRed PCR Master MixTOOLSTE-SR01
50X TAE BufferBIOMANTAE501000

Referanslar

  1. Wraight, S. P., Carruthers, R. I. . Biopesticides: use and Delivery. , 233-269 (1999).
  2. Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
  3. Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , 1-18 (2007).
  4. Zimmermann, G. The 'Galleria bait method'for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
  5. Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
  6. Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
  7. Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
  8. Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
  9. Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
  10. Goettel, M., Inglis, D., Lacy, L. . Manual of Techniques in Insect Pathology. , 213-249 (1997).
  11. Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
  12. Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539 (2020).
  13. Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
  14. Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
  15. Castrillo, L. . ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
  16. Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
  17. Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
  18. Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
  19. Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
  20. Chang, J. -. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15 (2021).
  21. Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
  22. . Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17 Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021)
  23. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  24. Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
  25. Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
  26. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
  27. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  28. Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9 (2008).
  29. Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
  30. Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
  31. Shin, T. -. Y., Choi, J. -. B., Bae, S. -. M., Koo, H. -. N., Woo, S. -. D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
  32. Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method'as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1 (2018).
  33. Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
  34. Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
  35. Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
  36. Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
  37. Humber, R. A. . Manual of techniques in insect pathology. , 153-185 (1997).
  38. Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
  39. Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
  40. Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
  41. Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
  42. Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
  43. Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
  44. Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
  45. Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 175entomopatojenik mantarlarTenebrio molitorBeauveriaMetarhiziumetkili konidia say sbiyolojik kontrol ajan

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır