토양 샘플에서 내토모 병원성 곰팡이의 격리 및 선택 및 곤충 해충에 대한 곰팡이 독성의 평가

요약

여기서 우리는 토양 샘플에서 entomopathogenic 균류 (EPF)를 분리하고 선택하는 데 사용 된 식사 벌레 (Tenebrio molitor)-미끼 시스템을 기반으로 프로토콜을 제시합니다. 효과적인 코니디아 번호(ECN) 포뮬러는 현장에서 해충 미생물 조절을 위한 생리적 특성에 기초하여 높은 스트레스 내성 EPF를 선택하는 데 사용된다.

초록

내토모병원성 균류(EPF)는 통합 해충 관리를 위한 미생물 방제제 중 하나입니다. 지역 해충 또는 침습 해충을 제어하려면 토착 EPF를 분리하고 선택하는 것이 중요합니다. 따라서, 곤충 미끼(mealworm, Tenebrio molitor) 시스템과 결합된 토양 미끼 방법은 일부 수정과 함께 본 연구에서 사용되었다. 고립된 EPF는 농업 해충 스포드옵테라 리투라에 대한 독성 검사를 받았다. 더욱이, 잠재적인 EPF 균주는 형태학적 및 분자 식별을 실시하였다. 또한, 코니아 생성 및 열온성 분석은 유망한 EPF 균주에 대해 수행되었고 비교; 이러한 데이터는 실험실 순위를 위한 효과적인 코니디아 번호(ECN)의 공식으로 더 대체되었다. 토양 미끼-식사 웜 시스템과 ECN 포뮬러는 곤충 종을 대체하고 상용화 및 현장 응용 평가를 위해 더 많은 스트레스 요인을 통합하여 개선할 수 있습니다. 이 프로토콜은 EPF 선택에 대한 빠르고 효율적인 접근 방식을 제공하고 생물학적 제어 제에 대한 연구를 향상시킬 것입니다.

서문

현재, 내토모병원성 균류(EPF)는 농업, 숲 및 원예 해충의 미생물 대조에 널리 사용되고 있다. EPF의 장점은 넓은 숙주 범위, 좋은 환경 적응성, 환경 친화적 인 특성이며, 통합 해충 관리를위한 시너지 효과를 보여주기 위해 다른 화학 물질과 함께 사용할 수 있다는 것입니다^1,2. 해충 방제제로서 의신청의 경우, 병든 곤충이나 자연 환경으로부터 많은 수의 EPF를 분리할 필요가 있다.

그들의 호스트에서 이 유기체의 견본은 자연 호스트에 있는 EPF의 지리적 분포 그리고 보급 비율을 이해하는 데 도움이 ^3,4,5. 그러나, 곰팡이 감염 곤충의 수집은 일반적으로 분야에서 환경 요인과 곤충 인구에 의해 제한됩니다⁴. 곤충 호스트가 EPF 감염 후 죽고 토양에 빠질 것이라는 점을 고려할 때 토양 샘플에서 EPF를 분리하는 것은 안정적인 자원이 될 수 있습니다^3,6

프로토콜

참고: 전체 순서도는 그림 1에 표시됩니다.

1. 잠재적인 내토모병원성 균류(EPF)의 격리 및 선택

1. 토양 샘플 수집
   1. 표면 토양의 1cm를 제거한 다음 각 샘플링 부위의 삽을 사용하여 5-10cm 깊이 내에 있는 토양을 수집합니다.
      참고: 샘플링 사이트는 인위적으로 분사된 EPF 균주의 오염을 피하기 위해 산, 숲 또는 인구밀도가 낮은 지역이 될 것입니다. 토양 샘플 수집 영역이 표면에 잡초로 덮여 있는지 확인합니다. 건조 토양 또는 습한 토양이 실험에 적합하지 않습니다.
   2. GPS, 고도, 필드 유형, 연간 온도, 연간 강수량, 수집 시간(계절), 토양 유형 및 pH 값을 포함한 각 샘플링 사이트의 세부 정보를 기록합니다.
   3. 토양 샘플 100g을 비닐 봉지에 모아 3시간 이내에 실험실에서 곰팡이 격리 프로토콜을 적용하면 실온에서 유지하십시오.
      참고: 3시간 이내에 시료를 사용할 수 없는 경우, 토양을 어두운 조건에서 실온에 보관하십시오. 실험이 즉시 수행되지 않으면, 토양 샘플은 프로토콜^18,19의 시작까지 ....

결과

격리 및 선택 잠재적 인 엔토모병원성 균류 (EPF)
테네리오 몰리토르 매개 엔토모병원성 균류(EPF) 라이브러리 시공 방법을 사용하여 곤충 살상 활동이 없는 곰팡이의 수는 제외될 것이다. 따라서, EPF의 격리 효율과 선택은 크게 증가 될 수있다. 이 방법의 적용 동안 샘플링 부위, 토양 샘플 및 곰팡이 발아 율의 정보가 기록되었습니다(표 2).......

토론

곤충병원성 균류(EPF)는 곤충 조절에 사용되어 왔다. EPF30,31,32를 분리, 선택 및 식별하는 몇 가지 방법이 ^있습니다. 곤충 미끼 방법의 다른 종류를 비교, 보베리아 bassiana와 Metarhizium 애니소플리아 곤충 미끼에서 일반적으로 발견 되었다6,12,13,14.<.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Bacteriological grade	BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.	AGR001	Suitable in most cell culture/molecular, biology applications.
AGAROSE, Biotechnology Grade	BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.	AGA001	For DNA electrophoresis.
BioGreen Safe DNA Gel Buffer	BIOMAN	SDB001T
Brass cork borer	Dogger	D89A-44001
Canon kiss x2	Canon	EOS 450D	For record strain colony morphology
Constant temperature incubator	Yihder Co., Ltd.	LE-509RD	Fungal keeping.
cubee Mini-Centrifuge	GeneReach	MC-CUBEE
DigiGel 10 Digital Gel Image System	TOPBIO	DGIS-12S
Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette	Thermo Scientific	4642010
Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette	Thermo Scientific	4642030
Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette	Thermo Scientific	4642070
Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette	Thermo Scientific	4642090
Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette	Thermo Scientific	4642060
Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette	Thermo Scientific	4642080
GeneAmp PCR System 9700	Applied Biosystems	4342718
GenepHlow Gel/PCR Kit	Geneaid	DFH100
Genius Dry Bath Incubator	Major Science	MD-01N
Graduated Cylinder Custom A 100mL	SIBATA	SABP-1195906	Measure the volume of reagents.
Hand tally counter	SDI	NO.1055
Hemocytometer	bioman	AP-0650010	Calculate the number of spore
Inoculating loop	Dogger	D8GA-23000
lid	IDEAHOUSE	RS92004
Micro cover glass	MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD	24241
Microscope imaging system	SAGE VISION CO.,LTD	SGHD-3.6C
Microscope Slides	DOGGER	DG75001-07105
Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis	ADVANCE	AD110
Nikon optical microscope	SAGE VISION CO.,LTD	Eclipse CI-L
Plastic cup	IDEAHOUSE	CS60016
Presto Mini gDNA Yeast Kit	Geneaid	GYBY300	Fungal genomic DNA extraction kit
Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium)	HiMedia Leading BioSciences Company	M033	Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms.
Scalpel Blade No.23	Swann-Morton	310
Scalpel Handle No.4	AGARWAL SURGICALS	SSS -FOR-01-91
Shovel	Save & Safe	A -1580242 -00
Silwet L-77	bioman(phytotech)	S7777	Surfactant
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002403
Steel Tweezers	SIPEL ELECTRONIC SA	GG-SA
Sterile Petri Dish	BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.	1621	Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use.
ThermoCell MixingBlock	BIOER	MB-101
Tween 80	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	164-21775
TwinGuard ULT Freezer	Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd.	MDF-DU302VX	-80°C sample stored.
Vertical floor type cabinet	Chih Chin	BSC-3	Fungal operating culturing.
Vortex Genie II	Scientific	SIG560
Zipper storage bags	Save & Safe	A -1248915 -00
100 bp DNA Ladder	Geneaid	DL007
-20°C Freezer	FRIGIDAIRE	Frigidaire FFFU21M1QW	-20°C sample and experimental reagents stored.
2X SuperRed PCR Master Mix	TOOLS	TE-SR01
50X TAE Buffer	BIOMAN	TAE501000