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要約

ここでは、土壌サンプルから病原性真菌(EPF)を単離・選択するために用いたミミズ(テネブリオモリター)-ベイトシステムに基づくプロトコルを提示する。有効なコニディア数(ECN)式は、現場での害虫微生物制御のための生理学的特性に基づいて高い耐ストレスEPFを選択するために使用される。

要約

病原性真菌(EPF)は、一体化した害虫管理のための微生物制御剤の1つである。局所的または侵襲的な害虫を制御するには、先住民族のEPFを分離して選択することが重要です。そこで、この土壌餌法と昆虫餌(ミミズ、 テネブリオモリター)システムを組み合わせて、いくつかの修正を行った。その後、単離されたEPFは、農業害虫 スポドプテラリトゥラに対する毒性試験を受けた。さらに、電位EPF株は形態学的および分子同定を行った。さらに、コニディア生産および耐熱性アッセイを有望なEPF株に対して行い、比較した。これらのデータは、実験室の順位付けに有効なコニディア数(ECN)の式にさらに置換された。土壌餌-ミミズシステムとECN式は、昆虫種を置き換え、商業化とフィールドアプリケーションの評価のためのより多くのストレス要因を統合することによって改善することができます。このプロトコルは、EPF選択のための迅速かつ効率的なアプローチを提供し、生物学的制御剤の研究を改善します。

概要

現在、エントモ病原性真菌(EPF)は、農業、森林、園芸害虫の微生物管理に広く使用されています。EPFの利点は、その広い宿主範囲、良好な環境適応性、環境に優しい性質、および統合された害虫管理のための相乗効果を示すために他の化学物質と使用することができる1,2です。害虫防除剤としての適用のためには、病気の昆虫または自然環境のいずれかから多数のEPFを単離する必要がある。

これらの生物をホストからサンプリングすることは、自然なホスト3,4,5におけるEPFの地理的分布と有病率を理解するのに役立ちます。しかし、真菌感染昆虫の収集は、通常、フィールド4の環境要因および昆虫集団によって制限される。昆虫宿主がEPF感染後に死んで土壌に落ちることを考えると、土壌サンプルからのEPFの単離は安定した資源である可能性があります3,6。例えば、窒息物は、成長のためのそれらのリソースとして死んだ宿主を使用することが知られている。土壌餌および選択的培地システムは、土壌からEPFを検出し、分離するために広く使用されています3,4,7,8,9,10.

選択的培地法では、希釈された土壌溶液を広域スペクトル抗生物質(例えば、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン)を含む培地にメッキされ、細菌2、3、9、11の増殖を阻害する。しかし、この方法は株の多様性と密度を歪め、多くの微生物群集の過大評価または過小推定を引き起こす可能性があると報告されています6。さらに、単離株は病原性が低く、単離中に窒息死と競合する。希釈土液3からEPFを分離することは困難である。選択的培地を使用する代わりに、土壌ベイト法は、感染した死んだ昆虫からEPFを分離し、2〜3週間保存することができ、それによってより効率的で標準的なEPF分離方法3、4、7、6を提供する。この方法は操作が容易であるため、種々の病原性株を低コスト4で単離することができる。そのため、多くの研究者に広く使用されています。

異なる種類の昆虫餌システムを比較すると、ボーベリアバシアナとメタリジウムアニソピアは、ヘミプテラ、レピドプテラ、ブラッテラ、コレオプテラ6、12、13,14に属する昆虫に見られる最も一般的なEPF種です。これらの昆虫の餌の中で、ガレリアメロネラ(順序レピドプテラ)とテネブリオモリター(オーダーコレオプテラ)は、他の昆虫と比較すると、ボーベリアとメタリジウムsppのより高い回復率を示す。そのため、G. メロネラと T. モリターは、昆虫の餌付けに一般的に使用されます。長年にわたり、 米国農務省(USDA)は、4081種のボーベリア属、18種のクロノスタチ属、878種のコダイセプス属、2473種のメタフイジウムspp.,226種を含む多種多様な種を含むEPF図書館(EPF培養物の農業研究サービスコレクション、ARSEF)を設立しました。 他の15の間でポチョニア属の13種。もう一つのEPF図書館は、米国バーモント大学から昆虫学研究所(ERL)によって30年間建設されました。米国、ヨーロッパ、アジア、アフリカ、中東16からのEPFの1345株が含まれています。

台湾の局所的または侵略的な害虫を制御するには、先住民族EPFの隔離と選択が必要です。したがって、このプロトコルでは、土壌餌法の手順を修正して説明し、昆虫餌(ミミズ、 テネブリモリター)system17と組み合わせました。このプロトコルに基づいて、EPF ライブラリが確立されました。予備EPF分離物に対して2ラウンドのスクリーニング(接種の定量化)を行った。EPF分離株は昆虫に対する病原性を示した。潜在的株は形態学的および分子同定を行い、さらに熱寛容および円錐形生産アッセイによって分析された。また、有効なコニディア数(ECN)の概念も提案された。ECN式と主成分分析(PCA)を用いて、EPFライブラリの確立とスクリーニングのプロセスを完了するために、環境圧力のシミュレーション下で潜在的な歪を分析した。続いて、有望なEPF株の病原性を標的害虫(例えば 、スポドプテラリトゥラ)について試験した。現在のプロトコルは、ECNの式とPCA分析に熱寛容と同音量の生産データを統合し、EPF関連研究のための標準のランキングシステムとして使用することができます。

プロトコル

注: 図 1 にフローチャート全体を示します。

1. 潜在的な病原性真菌(EPF)の分離と選択

  1. 土壌サンプルを収集する
    1. 表面の土の1cmを取り除き、各サンプリング部位からシャベルを使用して5〜10cmの深さの中の土を集めます。
      注:サンプリングサイトは、人工的に散布されたEPF株の汚染を避けるために、山、森林、またはまばらな人口の領域になります。土壌サンプル採取の領域が表面の雑草で覆われていることを確認します。乾燥した土壌や湿った土壌は、この実験には適していません。
    2. GPS、標高、フィールドの種類、年間気温、年間降水量、収集時間(季節)、土壌タイプ、pH値など、各サンプリング部位の詳細を記録します。
    3. 100gの土壌サンプルをビニール袋に集め、3時間以内に実験室の真菌分離プロトコルに従う場合は室温で維持します。
      注:サンプルを3時間以内に使用できない場合は、暗い状態で室温で土壌を保管してください。実験が直ちに行われない場合、土壌試料は、プロトコル18,19の開始まで1週間4°Cで保存することができる。
  2. 餌とミミズでEPFを分離 (テネブリオモリター)
    1. 100gの土壌サンプルをプラスチックカップ(キャップ径=8.5cm、高さ=12.5cm)に入れ、暗い暗い場所で土壌の表面に5ミミズを2週間置きます。
      注:他のタイプのプラスチックカップ容器も使用できます。土壌が乾燥しすぎている場合(ひび割れまたは砂質)、土壌上のddH2O(約5〜10mL)をスプレーします。T.モリター幼虫の体長c.a.2.5cm(14番目のインスター)は、真菌分離スクリーン20に役立ちます。
    2. 死亡率と真菌症のために毎日幼虫を観察し、記録します。真菌の分離のために2週間までカップに死んだ幼虫を保ちます。
      注:土壌サンプル中の真菌のコニジア胞毛は、上記のプロセス中にミミズの幼虫に付着します。真菌性真菌症は、ヒファエがセグメント間膜から成長するにつれて観察され、その後、全身が菌糸体で覆われる。胞子は7日後に開始され、真菌感染の色は、コニディア塊の色に変化します。
    3. きれいなベンチに死んだ昆虫を移し、コニディアを収集するために無菌爪楊枝を使用しています。実験室21の4分の1の強さのサボローデキストロース寒天媒体(1/4 SDA)版(55のmm)にそれらをストリーク。培養プレートを25°Cで7日間インキュベートし、真菌の一次培養を得た。
      注:1/4 SDAプレートは以下のように調製されます:200 mL H2Oにサボローデキストローススープ1.5gと寒天3gを混ぜ、20分間殺菌します。アリコート1/4 SDAを固化前に55mmのペトリ皿に入れます。固化した1/4 SDAプレートは、使用するまで4°Cで保存されます。
    4. 各一次培養菌を1本の55mm 1/4 SDAプレート上の層流に再ストリークし、培養プレートを25°Cで7日間インキュベートし、真菌の単一コロニーを得る。
    5. この再分離を〜2〜3回繰り返し、光顕微鏡下で観察して、単一および純粋な形態学的真菌コロニーを得る。
      注: T. モリター ベイトを使用してすべての EPF を分離し、次のセクションで説明するとおりに保存します。分離、保存、純粋な培養、およびストリーキングは、後続のセクションで層流で行われなければならない。
  3. EPF 分離を保存する
    1. コルクボーラーを使用して、各単離純粋な真菌培養プレートの端に5mm寒天ブロックの3をカットし、1つの複製として1.5 mLマイクロ遠心分離管に置きます。
      注:各真菌分離物のための3つの複製は、第2の 毒性試験後にEPF株の貯蔵のために推奨される。保存スペースが限られている場合は、分子同定も推奨されます。
    2. マイクロピペットを使用して、0.03%の界面活性剤溶液(材料表)の250 μLと60%グリセロールの250 μLを1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに加えます。その後、10 sの渦。
    3. 1.5 mLマイクロ遠心分離チューブをパラフィンフィルムで密封し、-20°Cの冷蔵庫で24時間予冷します。その後、冷凍保存のために-80°C冷蔵庫に予め冷却された真菌ストックを移します。
      注:余分な純粋な真菌培養プレート(クライオ保存サンプルを除く)は、セクション1.4で使用されました。
  4. 真菌分離株のための第1の 病原性スクリーン
    1. 25°Cの各純粋な真菌培養プレートの表面に直接5つの T.モリター 幼虫を置きます。
    2. 真菌症と死亡率を10日間観察し記録する。さらに分析するために、真菌分離を選択します。
      注:100%の死亡率を引き起こす真菌分離株は、T.モリター幼虫への毒性を確認するために第2の毒性試験のために選択されます。あるいは、研究者は自分の研究に従って基準を調整することができます。
  5. 真菌分離株の第 2の毒性試験
    注:第 1病原性スクリーンに基づいて、第2 の病原性試験のために-80°Cから選択した真菌の分離物を回復する。第2の 病原性試験の目的は、スクリーニングの第 1回の後に選択された真菌分離株の病原性を定量化することです。
    1. 各真菌の収穫コニディアは、1分間の渦を分離し、ヘモサイトメーターを用いてコニディアの数をカウントする。
    2. 0.03%界面活性剤溶液(材料表)で1 x 107 conidia/mLの濃度にコニディア懸濁液を調整します。
    3. 真菌懸濁液の10 μLを55 mm 1/4 SDAプレートに広げ、暗闇の中で25°Cで7日間成長させます。
    4. 各純粋な真菌培養プレート(c.a. 6 x 107 conidia)の表面に直接5つのT.モリター幼虫を置きます。パラフィンフィルムでプレートを密封し、暗闇の中で25°Cでインキュベートします。
    5. 真菌症と死亡率を10日間観察し記録する。
    6. 各真菌分離液に対して三重で(ステップ1.51から1.5.5まで)試験を繰り返します。
      注:100%の死亡率を引き起こす真菌分離株は、害虫を標的とする毒性を確認するために第 3の毒性試験のために選択される。
  6. 標的害虫の真菌分離株の第3回 病原性試験(例としてスポドプテラリトゥラ )
    1. 第2病 原性から選択した分離株でステップ1.5.2から1.5.6を繰り返し、標的害虫に対する毒性をテストする。
    2. 各真菌分離のLT50 を計算します22。
      注:各真菌分離株のLT50 は、Rスタジオ(バージョン3.4.1)を使用して一般化線形モデル(GLM)を介して計算されました。準誤差分布とログリンク関数を使用して、過分散を考慮することができます。

2. EPFの分子同定

  1. 真菌ゲノムDNAの抽出
    1. 7日1/4 SDAプレートからc.a. 1 cm2 EPFを収集します。
    2. 製造者の指示に従って真菌ゲノムDNA抽出キットを使用して真菌 ゲノムDNAを抽出する23 (材料表)。
  2. PCR 増幅と DNA シーケンシング
    1. PCRマスターミックス(2x)を用いたDNAサンプル21 のPCRによる真菌ITS領域の増幅、ITS1F/ITS4Rプライマーセット24 (表1)は、次のPCRプログラムで94°C、30sの場合は94°C、30sの場合は55°C、72°Cの72°Cの最終延長°Cで72°C
      注意: ITS1F/ITS4R プライマーセットは、属レベルの識別用です。
    2. 商用シーケンシングサービスにより PCR をシーケンスします。
    3. NCBI データベース内の同様の真菌の NCBI BLAST 検索を使用し、系統的解析のための相対的な真菌タイプの種を選択します。
      注:メタリジウムまたはボーベリア属に属する真菌種は、tef-983F/tef-2218Rプライマーset25(ステップ2.1.1〜2.2.3を繰り返す)で種レベルにさらに同定する必要があります。メタリジウム属またはボーベリア属ではない真菌の場合、DNAリアーゼ(APN2)、ベータチューブリン(BTUB)、RNAポリメラーゼII最大サブユニット(RPB1)、RNAポリメラーゼII番目に大きいサブユニット(RPB2)、および3'翻訳伸び因子1アルファ(TEF)25,25,2500を含む種を同定するために他の分子マーカーを使用することができます。.
  3. 系統解析
    1. ClustalX 2.1 ソフトウェア27 を使用して、ステップ 2.2.2 および 2.2.3 の複数のシーケンスを整列します。保存された配列領域をGeneDoc28で手動でトリミングします。
    2. 最小進化(ME)、近隣結合(NJ)、および最尤(ML)法に基づいてMEGA7ソフトウェア29 による系統解析を行う。
      注: 3 つの方法をすべて実行すると、分類ステータスを確認し、正確に確定できます。第 1病原性スクリーンによってスクリーニングされた真菌分離株は、属レベルでの分子同定に使用される。第 2の病原性試験によってスクリーニングされた真菌分離株は、種レベルの分子および形態学的同定のために使用される。

3. EPFの形態学的同定

  1. 真菌コロニー形態の観察
    1. カメラを使用して、7日間の真菌培養コロニーの成長をキャプチャし、コロニーの成長、形態(ふわふわ、しっかりした)、および色を記録します。
  2. コニディアとコニディオフォアの観察
    1. 接種ループを有する純粋な培養真菌コロニーからコニディアを削り取り、0.1%Tween 80溶液で胞子をガラススライドに移します。次に、コニディアの光顕微鏡観察用カバースリップで覆います。
    2. メスを使用して、真菌コロニーの端にあるヒファー鎖の5mm2 寒天ブロックを切断し、寒天ブロックをガラススライドに移します。
    3. 次のように洗浄を行う:プラスチックドロッパーで寒天ブロックに0.1%Tween 80溶液を追加し、ピンセットを使用して余分なコニディアのほとんどを洗い流します。次に、軽顕微鏡観察用のカバースリップで覆います。
      注:0.1%Tween 80は、真菌種および疎水性に応じて、別のより強力な界面活性剤(材料表)で置き換えることができます。
    4. 異なる真菌分離株間の違いを比較するために、コニディアとコニディオフォアの幅と長さを測定し、記録します。
    5. ウェルチのANOVA検定とゲームハウエルテスト(ポストホックテスト)を使用して、Rスタジオ(バージョン3.4.1)を使用して各株の半径幅と長さを分析します。
      注: 形態学的文字のデータ解析は、ケースによって調整することができます。第3の 毒性試験でスクリーニングされた真菌分離株は、セクション4および5の生理学的特徴付けおよびECNランキングに使用される。

4. 心の生産性と耐熱性の調査

  1. コニジアル生産アッセイ
    1. 選択した真菌を1/4 SDA培地上で1/4のSDA培地で10日間暗く±1°Cで培養する。
    2. 真菌分離液の1mLを0.03%界面活性剤溶液に調製し、上記のように1 x 107 conidia/mLに調整します。
    3. 1/4 SDAの10μLの3滴のコンディアル懸濁液を滴下し、暗闇の中で25°Cで7、10、14日間インキュベートし、真菌の胞子を数えます。
      注:10 μLは、7-14日間の真菌増殖後も真菌胞子を伴う5mmブロックを収集するのに最適なボリュームです。
    4. コルクボーラーを使用してコロニーの中心から5mm寒天ブロックを取り外し、各時点で1.5 mLマイクロ遠心管内の0.03%界面活性剤溶液(材料表)の1mLに移します。
    5. 15分間室温で3,000rpmでチューブを渦、コニディアの数を数えるためにヘモサイトメーターを使用します。
      注: カウントに使用される数式は、最小セルの 25 乗分あたりの conidia の数です (サイズ = 0.025 mm2; 部屋の深さ = 0.1 mm):
      5つの正方形のコニディアの合計いいえ 80 ×÷ (4 × 106)
    6. 各分離について 3 回繰り返します。
  2. 耐熱性アッセイ
    1. 選択した真菌を1/4 SDA培地上で1/4のSDA培地で10日間暗く±1°Cで培養する。
    2. 真菌分離液の1mLを0.03%界面活性剤溶液に調製し、上記のように1 x 107 のconidia/mLに調整します。
    3. コンディアルサスペンションをボルテックスし、45°Cの乾燥浴で0、30、60、90、および120分間加熱します。熱暴露後の各時点で55mm 1/4 SDA媒体上に5μLの5μLの3つの液滴を投げ、25±1°Cで18時間インキュベートする。
      注:より良い領域に集中できるように真菌液滴を広げないようにしてください。
    4. 発芽率を決定するために、200x光顕微鏡下で5つのランダムに選択されたフィールドを持つ発芽したコニディア胞子の数を数えます。
    5. 各隔離に対して 3 つのレプリケートを実行します。

5. 有効なコニディア番号(ECN)ランキング

  1. ECN 計算
    注:合計ECN21を計算する前に、各潜在的な真菌株の円錐生産および耐熱性データを取得してください。
    1. 各時点での経音生産の折り畳み変化(FC)を計算します。
      figure-protocol-7410
      ここで、x = データ収集の時間ポイント。ncp = 成長の各日の後のコニディアの数。そしてI =シードされたコニディアの初期数。
    2. 次の式を使用して、各時点でのストレス処理の下での conidia 数を計算します。
      figure-protocol-7640
      ここで、y = 治療中の時点のECN;TT0 = 熱ストレスを受けていないコニディアの発芽率 (= 発芽率 0 分熱処理);TTz=応力係数は、熱処理の異なる時間(z)におけるコニディア発芽率である。
    3. 次の式を使用して、合計 ECN を計算します。
      figure-protocol-7907
    4. 各真菌株のECNを比較してください。
  2. 真菌株の主成分分析(PCA)
    注:PCA分析はECNのランキングを確認し、生理学的特徴値間の相関関係を理解するのに役立ちます。ECN 値を比較し、ECN 値が高い EPF 分離を選択します。
  3. R ソフトウェアを使用して、次のコーディングで PCA を作成します。
    PCA データ ファイル#Input
    a = read.table("PCA.csv",sep=',ヘッダー=T)
    1. # サンプルデータの処理
      row.names(a) X=行名(a)
      df<- a[2:11]
    2. #PCA計算
      pca <- prcomp(df、中央 = 真、スケール = 真)
      vars <- (pca$sdev)^2
      pc1_percent = vars[1] / 合計(vars)
      pc2_percent = vars[2] / 合計(vars)
      値 = pca$x
    3. PCA の視覚化ファイル#Output
      png(ファイル = 'pca.png'、高さ = 2000、幅 = 2000、res = 300)
      注: ECN ランキングを確認するために、7 日から 14 日間の円錐生産とすべての温度許容データを使用して主成分分析 (PCA) を実行します。
  4. ECNまたはPCAに基づいて最もパフォーマンスの高い真菌株を選択し、さらなる研究のために標的害虫の毒性試験を行う。

結果

潜在的な病原性真菌(EPF)の単離と選択
テネブリオモリトリオ介在性エントモ病原性真菌(EPF)ライブラリ構築法を用いることで、昆虫殺し活性のない真菌の数は除外される。したがって、EPFの絶縁効率と選択が大幅に向上する可能性があります。この方法の適用中に、サンプリング部位の情報、土壌サンプル、および真菌発芽率を記録した(?...

ディスカッション

昆虫防除にはエントモ病原性真菌(EPF)が用いられている。EPF30,31,32 を分離、選択、識別する方法はいくつかあります。異なる種類の昆虫餌法を比較すると、ボーベリアバシアナとメタリジウムアニソピアは、昆虫の餌6,12,13,14

開示事項

著者らは、この研究に関与する利益相反はないと宣言している。

謝辞

この研究は、科学技術省(MOST)のグラント109-2313-B-005-005-048-MY3によって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
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AGAROSE, Biotechnology GradeBIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.AGA001For DNA electrophoresis.
BioGreen Safe DNA Gel BufferBIOMANSDB001T
Brass cork borerDoggerD89A-44001
Canon kiss x2CanonEOS 450DFor record strain colony morphology
Constant temperature incubatorYihder Co., Ltd.LE-509RDFungal keeping.
cubee Mini-CentrifugeGeneReachMC-CUBEE
DigiGel 10 Digital Gel Image SystemTOPBIODGIS-12S
Finnpipette F2 0.2 to 2 µL PipetteThermo Scientific4642010
Finnpipette F2 1 to 10 µL PipetteThermo Scientific4642030
Finnpipette F2 10 to 100 µL PipetteThermo Scientific4642070
Finnpipette F2 100 to 1000 µL PipetteThermo Scientific4642090
Finnpipette F2 2 to 20 µL PipetteThermo Scientific4642060
Finnpipette F2 20 to 200 µL PipetteThermo Scientific4642080
GeneAmp PCR System 9700Applied Biosystems4342718
GenepHlow Gel/PCR KitGeneaidDFH100
Genius Dry Bath IncubatorMajor ScienceMD-01N
Graduated Cylinder Custom A 100mLSIBATASABP-1195906Measure the volume of reagents.
Hand tally counterSDINO.1055
HemocytometerbiomanAP-0650010Calculate the number of spore
Inoculating loopDoggerD8GA-23000
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-20°C FreezerFRIGIDAIREFrigidaire FFFU21M1QW-20°C sample and experimental reagents stored.
2X SuperRed PCR Master MixTOOLSTE-SR01
50X TAE BufferBIOMANTAE501000

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