基于荧光的连续核酸内切酶偶联DNA甲基化测定，用于筛选DNA甲基转移酶抑制剂

摘要

DNA甲基转移酶是潜在的癌症药物靶标。在这里，提出了一个协议来评估DNA甲基转移酶抑制的小分子。该测定利用核酸内切酶将DNA甲基化与荧光生成偶联，并允许实时监测酶活性。

摘要

DNA甲基化是表观遗传基因调控的一种形式，对正常的细胞功能很重要。在细胞中，称为DNA甲基转移酶（DNMT）的蛋白质建立并维持DNA甲基化模式。正常DNA甲基化模式的变化与癌症的发展和进展有关，使DNMT成为潜在的癌症药物靶标。因此，鉴定和表征这些酶的新型小分子抑制剂非常重要。本文提出了一种可用于筛选DNA甲基转移酶抑制剂的方案。连续偶联动力学测定允许在存在和不存在潜在小分子抑制剂的情况下确定DNA甲基化的初始速度。该测定使用甲基敏感的核酸内切酶Gla I将半甲基化DNA底物的甲基化偶联到荧光生成。

这种连续测定允许实时监测酶活性。在微量滴定板中进行小体积测定可降低试剂成本。使用该测定方法，对DNMT1抑制剂进行了小型示例筛选，DNMT1是人类中最丰富的DNMT同工酶。高度取代的蒽醌天然产物乳酸A是一种有效的DNA竞争性DNMT1抑制剂。在这里，我们检查三种潜在的小分子抑制剂 - 蒽醌或具有一到三个取代基的蒽醌样分子 - 在两种浓度下描述测定方案。初始速度用于计算在每个分子存在下观察到的活性百分比。检查的三种化合物中的一种表现出DNMT1活性的浓度依赖性抑制，表明它是DNMT1的潜在抑制剂。

引言

DNA甲基化是调节基因表达和染色质结构的重要表观遗传标记。甲基化主要发生在 CpG 二核苷酸中——胞嘧啶，然后是鸟苷;将甲基加入到胞嘧啶的5位。正确的DNA甲基化模式，从而正确的基因表达，对于适当的细胞发育和功能是必需的。许多疾病状态与正常甲基^化模式的改变有关1，^2，3。例如，癌症的发生和进展以及DNA甲基化模式的改变之间存在联系。通常，癌细胞表现出较低的甲基胞嘧啶总体水平，这会导致基因组不稳定。同时，存在于基因组中的甲基胞嘧啶集中在肿瘤抑制基因的启动子区域，这导致这些重要蛋白质的基因沉默。值得注意的是，表观遗传变化是动态和可逆的，这与与肿瘤发生相关的DNA突变不同。这使得参与表观遗传基因调控的蛋白质成为有趣的药物靶点^2，4。

DNA甲基转移酶（DNMT）是负责产生和维持DNA甲基化模式的蛋白质。三种催化活性同工酶DNMT1，DNMT3a和DNMT3b存在于人类中。在发育和分化过程中， 从头 甲基转移酶DNMT3a和DNMT3b建立甲基化模式。两种酶都可以结合催化无活性的DNMT3L蛋白，形成活性增加的复合物¹....

研究方案

1. 为屏幕准备检测解决方案

注意：可以调整该测定中使用的底物浓度。对于缺乏RFTS的DNMT1，实验确定的发夹DNA底物和SAM的K_m 值分别为1-2 nM和2μM，分别为^26，40。

1. 准备 600 μL 在冰上的微量离心管中测试的每个测定条件。
   注意：所需的测定溶液总量取决于正在进行的重复次数。对于该协议，每个测定条件一式三份运行。
   1. 向每个试管中加入ddH₂O和5x甲基化缓冲液（250 mM Tris pH 7.5，5 mM MgCl₂，500 mM谷氨酸钾，5 mM二硫苏糖醇（DTT），25%甘油），以达到1x缓冲液的终浓度。对于含有 20 μM 化合物的测定，加入 472 μL ddH₂O 和 120 μL 5x 缓冲液。对于含有 50 μM 化合物的测定，加入 470 μL ddH₂O 和 120 μL 5x 缓冲液。
   2. 向每个样品中加入 3.15 μL 20 mg/mL 牛血清白蛋白 （BSA）。
   3. 向每个样品中加入 2 μL 3.15 μM 发夹 DNA 底物和 1.33 μL 4.75 mM SAM。
      注意：测定溶液混....

结果

活动 DNMT1 是此分析的先决条件。缺乏RFTS的DNMT1在 大肠杆菌 中表达，并按照先前发表的程序纯化至均一性⁴¹。为了确保纯化的酶具有活性，使用不连续的核酸内切酶偶联测定来检查DNA甲基化活性³⁶。该测定利用位于Sau3A1切割位点的32个碱基对双链DNA和单个半甲基化CpG。Sau3A1可以切割半甲基化的底物DNA;然而，当DNA完全甲基化时，切割被阻断。将缺乏RFTS的DNMT1.......

讨论

为了鉴定和表征DNA甲基转移酶的抑制剂，必须测量酶的活性。存在几种检查DNA甲基转移酶活性的方法。通常使用放射性监测活动;SAM标记甲基的转移可以定量为²⁹，30，³¹，32，^33，34。利用甲基敏感核酸内切酶的基于凝胶的测定也已被描述为

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	3694
96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates	ThermoFisher	249570
Bovine Serum Albumin	NEB	B9000S
compound 1	ChemBridge	5812086	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 2	ChemBridge	6722175	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 3	ChemBridge	5249376	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
Dithiothreitol	Sigma	D0632
Gla I	SibEnzyme	E494	methyl-sensitive endonuclease
Glycerol	RPI	G22025
Magnesium Chloride	Sigma	M0250
Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher)	IDT	custom synthesized	internally quenched hairpin DNA (substrate)
Potassium Glutamate	Sigma	G1501
S-adenosylmethionine	Sigma	A4377	methyl-donating co-factor (substrate)
Tris Base	RPI	T60040