使用生物发光监测小鼠乳腺癌生长和转移集落形成

摘要

在这里，我们描述了一种涉及荧光素酶和绿色荧光蛋白在各种乳腺癌细胞系中表达的非侵入性监测方法。该协议提供了一种在小鼠中实时监测肿瘤形成和转移定植的技术。

摘要

乳腺癌是一种常见的异质性恶性肿瘤，也是女性死亡的第二大原因，主要是由于远处的器官转移。已经产生了几种动物模型，包括广泛使用的原位小鼠模型，其中癌细胞被注射到乳腺脂肪垫中。然而，这些模型不能帮助监测肿瘤生长动力学和转移定植。在小鼠中实时监测癌细胞的尖端工具将显着促进对肿瘤生物学的理解。

在这里，建立了稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白（GFP）的乳腺癌细胞系。具体而言，该技术包含两个连续的步骤，通过在 体外 测量荧光素酶活性而启动，然后将癌细胞植入非肥胖严重联合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠的乳腺脂肪垫中。注射后，通过无创生物发光成像系统实时监测肿瘤生长和转移定植。然后，通过荧光显微镜检查肺部表达GFP转移的定量，以验证观察到的生物发光结果。这种复杂的系统结合了荧光素酶和基于荧光的检测工具，可评估体内的癌症转移 ， 这在乳腺癌治疗和疾病管理中具有巨大的应用潜力。

引言

乳腺癌是全世界常见的癌症类型，美国每年诊断出约250，000例新病例¹。尽管发病率很高，但一套新的抗癌药物显着改善了乳腺癌患者的预后²。然而，这些治疗仍然不足，因为许多患者经历疾病复发和转移扩散到重要器官²，这是患者发病和死亡的主要原因。因此，乳腺癌研究的主要挑战之一是确定调节远端转移形成的分子机制，以开发抑制其发展的新方法。

癌症转移是一个动态过程，其中细胞从原发肿瘤中分离并通过血液循环侵入邻近组织。因此，其中细胞经历类似转移级联反应的动物模型可以促进识别控制该过程的机制^3，4。此外，这些 体内 模型对于开发乳腺癌治疗剂^5，6是必不可少的。然而，这些原位模型不能指示实际的肿瘤生长动力学，因为效果仅在终止时确定。因此，我们建立了一种基于荧光素酶的工具，以实时检测肿瘤发展和转移定植。此外，这些细胞表达GFP以检测转移集落。这种方法相对简单，不涉及任何侵入性操作³。因此，结合荧光素酶和荧光检测是推进乳腺癌治疗和疾病管理的临床前研究的有用策略。

研究方案

所有小鼠实验均在希伯来大学机构动物护理和使用委员会批准的协议MD-21-16429-5下进行。此外，希伯来大学还获得了实验动物护理评估和认证协会（AAALAC）的认证。

1. 细胞系维持

注意:本方案中使用了人乳腺癌细胞系（MCF-7，MDA-MB-468和MDA-MB-231）。

1. 在Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）中培养所有乳腺癌细胞系，并在37°C下在加湿的二氧化碳（5%CO 2）培养箱中补充10%胎牛血清（FBS）和₁%青霉素 - 链霉素。
   注意:定期检查细胞密度;拆分并扩展，以便在它们达到 70% 汇合度时将来使用。

2. 病毒制备

1. 用1毫升胰蛋白酶处理HEK293T细胞，直到它们分离。
2. 加入10mL DMEM（10%FBS）以中和胰蛋白酶活性，并将细胞悬浮液转移到新的15mL离心管中。
3. 以150× g 离心5分钟以沉淀细胞。离心后弃去上清液，加入1mL新鲜DMEM培养基。
4. 测定细胞浓度，并在六孔板中×10⁶ 个细胞/孔中接种1.2个细胞。
5. 第二天，预热所有必需的试剂，包括转染试剂、无血清 DMEM、包膜质粒 （VSV-G）、慢病毒包装质粒 （ΔVPR） 和 pLX304 荧光素酶-V5 原始质粒或 FUW GFP 质粒。
6. 在1.5mL高压灭菌离心管中，将50μL无血清DMEM与0.3μgVSV-G质粒，1μgΔVPR和1.2μgp304荧光素酶-V5原始质粒或FUW GFP质粒混合。
7. 将这些质粒与培养基充分混合后，加入5μL转染试剂，轻轻混合，并将混合物在室温下孵育15分钟。
8. 孵育后，将混合物滴加到HEK293T细胞中。
9. 24小时后，用2mL（30%FBS）DMEM替换生长培养基。第二天（转染后48小时），收获含有病毒的培养基（"pLX304荧光素酶-V5或FUW GFP病毒"）。
   注意:使用30%的FBS可提高病毒生产效率。
10. 为避免任何HEK293T细胞残留物，将含病毒的培养基通过0.45μm注射器过滤器或以150× g 离心5分钟，并收集上清液。
    注意:对于长期储存，请将病毒的工作等分试样保持在-80°C。

3. 建立稳定表达GFP和荧光素酶的细胞（"GFP ⁺ Luc⁺ 细胞"）

1. 在感染细胞的前一天，在六孔板中每孔接种8×^{10 5} 个细胞。
2. 过夜孵育后，用含有8μg/ mL聚苯乙烯的新鲜培养基替换生长培养基。向细胞中滴加200μLFUGFP病毒。
3. 可选:为了提高病毒效率，将板以560× g 离心30分钟（37°C）（旋转感染）。
4. 将细胞孵育48小时，并通过荧光显微镜验证GFP表达。
5. 通过荧光活化细胞分选（FACS）（GFP ⁺）对表达GFP的细胞进行分类（图1A）。
6. 如步骤3.2所述，用pLX304荧光素酶-V5原始病毒感染GFP分选的细胞。
7. 感染后30小时用杀卵杆菌素（10μg/ mL）处理细胞，以富集pLX304荧光素酶-V5原始细胞表达细胞（GFP ⁺，Luc ⁺ 细胞）。然后，每两天，用含有杀菌素的新鲜培养基替换。此外，作为对照，用相同的含杀菌素的培养基处理幼稚细胞。
   注意:在喷枪鱼苷治疗几天后，应观察到感染细胞和对照细胞之间的明显差异。这种效果是细胞系依赖性的，通常需要约8-10天。存活率低表明病毒产量低。如果是这样，产生新一批病毒，因为低效率可能会影响未来的实验。

4. 验证 体外 荧光素酶活性

1. 在15厘米的平板中生长MCF-7，MDA-MB-468和MDA-MB-231 GFP ⁺ Luc ⁺ 细胞至80%汇合。通过胰蛋白酶消化收获细胞，如步骤2.1-2.2中所述。
2. 将每个孔中越来越多的细胞（0.1，0.5，1，2，3，4×10⁴）接种到黑色96孔板中。
   注意:黑色96孔板更适合测量荧光素酶水平，因为白色或透明板会产生自发光信号。作为对照，在一个孔中单独使用磷酸盐缓冲盐水（PBS），以确保PBS没有自发光。
3. 用100μLDMEM填充所有孔并孵育16-24小时。
4. 从30mg / mL的储备中以1.5mg / mL浓度制备PBS中的荧光素溶液。等分荧光素溶液的储备并储存在-20°C。
5. 用PBS轻轻洗涤细胞一次，向每个孔中加入100μL荧光素溶液，等待2分钟。最后，使用生物发光测量所有乳腺癌细胞中的荧光素酶活性。
   注意:在动物实验之前检查 体外 GFP和荧光素酶表达至关重要。此外，空白孔用于减去背景。

5. 给小鼠注射GFP⁺ Luc⁺ 细胞

1. 将5×10⁶ （MCF-7和MDA-MB-468）或2×10⁶ （MDA-MB-231）GFP⁺ Luc⁺ 细胞分别转移到200μL或100μL PBS中。
2. 注射前，用5%消毒剂溶液清洁无菌生物罩（见 材料表）。然后，用过滤的（0.2μm）含有4%异氟醚的空气以1 L / min的气流速率麻醉小鼠2-3分钟。
   注意:必须确认适当的麻醉;捏住鼠标的脚趾，寻找任何反应。
3. 以仰卧姿势在麻醉的鼠标头上放置一个锥体。将兽医软膏涂抹在眼睛上，以防止麻醉时干燥。
4. 用棉签用乙醇擦拭小鼠的腹部区域，在乳腺上方，并用镊子抬起^第 4个乳腺。
5. 将针头27 G x 3/4（0.4 x 19 mm）插入脂肪垫下，然后缓慢注射100μL细胞悬浮液。
   注意:皮肤下方将出现圆形凸起。此外，注射不当可能导致肿瘤生长速率的偏差或同一实验组中肿瘤的缺失。
6. 注射程序后，将小鼠从罩中取出并将其转移到新的笼子中。监测小鼠，直到它们恢复意识。
   注意:确保所有用过的针头和注射器都丢弃在利器盒中。

6. 测量GFP⁺ Luc⁺ 小鼠中的荧光素酶水平

1. 在生物发光检测之前，用左手握住有意识的小鼠脖子来抑制有意识的小鼠。然后，将手向左倾斜，使鼠标正面朝上，下半身处于仰卧位置。
2. 使用针头尺寸为27 G x 3/4（0.4 x 19 mm）的1.0mL注射器，腹膜内注射100μL荧光素（30mg / mL）腹膜内（ip）到左下腹象限的小鼠腹面。
   注意:针尖不应插入距离腹壁超过3-5毫米，因为它可能穿透内脏器官。此外，建议在没有麻醉的情况下进行ip注射，因为荧光素在麻醉小鼠体内的分布比有意识的小鼠慢。因此，监测有意识的小鼠中的荧光素酶水平是一种更快的过程。
3. 在没有麻醉的情况下将小鼠保持7分钟，然后在麻醉室内保持3分钟，然后测量肿瘤动力学。
   注意:孵育时间因不同实验、细胞系和物种而异。因此，建议在开始实验之前校准孵育时间。
4. 按照步骤5.2-5.3中描述的麻醉小鼠。
5. 在孵育过程中打开软件（材料表），初始化成像系统，然后单击" 初始化 "按钮。
   注意:请注意，相机需要大约10分钟才能冷却并达到-90°C。 此外，作为背景对照，测量幼鼠（即注射 了不表达荧光素酶基因的细胞的GFP ⁺ 小鼠）中的荧光素酶水平。
6. 使用以下设置将设置保持在自动曝光状态:曝光时间自动，60秒;分档介质，F/停止 1;励磁滤波器堵塞;发射滤光片打开。 初始化 结束后，选择" 映像向导"|生物发光 ，然后单击" 下一步|打开"筛选器 |在图像主体中选择 鼠标 。
7. 在 "视场"中，选择舞台 C（10 厘米）和 拍摄对象高度:1.50 厘米。
8. 单击" 图像设置舞台 "到 C，在单击" 采集 "按钮之前，请确保将鼠标放置在舞台上正确的仰卧位置。
9. 关闭门，单击" 获取 "按钮，然后等待屏幕上显示图像。
   注意:使用 自动曝光 选项，强信号需要5-20秒，具体取决于信号;微弱的信号大约需要60秒。
10. 对其他鼠标重复此步骤。
11. 为了检测肺转移，请使用厚厚的黑色纸板纸覆盖原发性肿瘤的强信号，并且仅将肺部的腹侧朝向相机暴露。使用上述相同参数捕获图像。

7. 使用生物发光和荧光获取 离体 图像

1. 在干燥器中使用二氧化碳（CO₂）吸入对小鼠实施安乐死，并使用高压灭菌的剪刀和镊子解剖小鼠。
2. 使用0.9%盐水灌注小鼠，收获器官，并用1x PBS冲洗以消除器官中的血迹。
3. 将冲洗的器官转移到培养皿中，并将其放入生物发光机的阶段。应用步骤6.2-6.6中所述的相同生物发光设置。
   注意:由于荧光素酶信号的减少，此步骤是有时间限制的。因此，在对小鼠实施安乐死后，立即通过生物发光可视化器官。
4. 对于GFP图像，应用与步骤6.3中所述相同的设置，使用 荧光GFP滤光片 代替 生物发光。
5. 使用体视显微镜拍摄肺部图像以检查GFP ⁺ 菌落的存在。

8. 生物发光数据分析

1. 双击该软件，然后从"文件"菜单中选择"打开"。
2. 打开所有文件并将其最小化。确保所有单位均为 辐射度（光子）。此外，单击" 全部应用 "以为所有图像保留相同的参数。
3. 从" 视图 "菜单中，选择" 工具选项板"，这将打开一个新窗口。
4. 从 "工具选项板" 窗口中，选择" ROI 工具 "选项卡，然后在 "类型"中选择" Bkg 平均 ROI"。
5. 从 ROI 工具中，选择" 圆"，然后在鼠标的胸部区域绘制一个小圆圈。
6. 双击圆圈，从"后台 ROI"选项卡中选择"用作 BKG 以供将来的 ROI"选项，然后单击"完成"。

9. 测量总通量

1. 从 "工具选项板 "窗口中，选择" ROI 工具 "选项卡，然后在 "类型"中选择 "ROI 的度量"。
2. 从 ROI工具中，选择 "圆圈"，然后在鼠标的原发肿瘤上绘制一个大圆圈。
3. 右键单击" 复制 ROI "，然后右键单击" 将 ROI 粘贴 到每个鼠标的每个单独文件中"。
4. 单击 ROI 工具选项卡中的"测量 ROI"，这将打开一个名为"ROI 度量"的新窗口。在此选项卡中，将"测量类型"保留为"辐射度（光子）"，将"图像属性"保留为"所有填充值"。
5. 将文件导出为 测量文件 （*.txt） 或 Csv （*.csv） 格式。
6. 在电子表格中打开导出的数据，并获取 总通量 （p/s） 和周的值。
   注意:此步骤可用于测量不同的组。例如，用载体治疗的小鼠与用药物治疗的小鼠。
7. 生成 XY 图，其中 时间 沿 X 轴显示， 总通量 （p/s） 沿 Y 轴显示。对于每周，获取每个样本组 的总通量 （p/s） 参数，并使用非参数学生 t 检验确定任何显著差异。

结果

我们生成了表达GFP和荧光素酶载体的乳腺癌细胞系（MDA-MB-231，MCF-7和MDA-MB-468）。具体来说，这是通过顺序感染实现的。首先，乳腺癌细胞系感染了表达荧光GFP的慢病毒载体。GFP阳性细胞（GFP⁺）在感染后2天进行分类（图1A，B）并感染pLX304荧光素酶-V5载体。然后，使用杀菌素选择荧光素酶以产生指示的（GFP ⁺，Luc ⁺）细胞。为了验证 体?...

讨论

基于动物的实验是癌症研究的必要条件^7，8，9，实际上已经开发了许多方案^{3，6，10，11，12，13，14}。然而，这些研究中的大多数仅在实验结束时确定了...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL eppendorf tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 µL tips	Lifegene	LRT10
1000 µL tips	Lifegene	LRT1000
15 mL tubes	Lifegene	LTB15-500
200 µL tips	Lifegene	LRT200
6 well cell culture plate	COSTAR	3516
96 well Plates BLACK flat bottom	Bar Naor	BN30496
Automated Cell Counters	Thermofisher	A50298
BD FACSAria III sorter	BD
BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'')	BD	302200
BD Plastipak Syringes 1 mL x 120	BD	303172
Corning 100 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430167
Corning 150 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430599
Countess cell counting chamber slides	Thermofisher	C10228
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine	Biological Industries	01-055-1A
Eclipse 80i microscope	Nikon
eppendorf Centrifuge 5810 R	Sigma Aldrich	EP5820740000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	04-127-1A
FUW GFP			Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
HEK293T			Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
Isoflurane, USP Terrell	Piramal	NDC 66794-01-25
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
L-Glutamine Solution	Biological industries	03-020-1A
Living Image Software	PerkinElmer		bioluminescence measurement
MCF-7	ATCC	ATCC HTB-22
MDA-MB-231	ATCC	ATCC HTB-26
MDA-MB-468	ATCC	ATCC HTB-132
Pasteur pipettes	NORMAX	2430-475
PBS	Hylabs	BP655/500D
pCMV-dR8.2-dvpr	Addgene	#8455	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
pCMV-VSV-G	Addgene	#8454	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
Petri dish 90 mm (90x15)	MINI PLAST	820-090-01-017
Pipettes 10ml	Lifegene	LG-GSP010010S
Pipettes 25ml	Lifegene	LG-GSP010050S
Pipettes 5ml	Lifegene	LG-GSP010005S
pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid	Addgene	#98580
Polybrene	Sigma Aldrich	#107689
Prism 9	GraphPad
Reagent Reservoirs	Bar Naor	BN20621STR200TC
SMZ18 Stereo microscopes	Nikon
Sodium Chloride	Bio-Lab	190359400
Syringe filters	Lifegene	LG-FPV403030S
Trypan Blue 0.5% solution	Biological industries	03-102-1B
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries	03-052-1a
Vacuum driven Filters	SOFRA LIFE SCIENCE	SPE-22-500
Virusolve		disinfectant
VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade	Promega	P1043
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent	Sigma Aldrich	#6366236001