생체 발광을 사용하여 마우스의 유방암 성장 및 전이성 콜로니 형성 모니터링

요약

여기에서, 우리는 다양한 유방암 세포주에서 루시퍼라제 및 녹색 형광 단백질 발현을 수반하는 비침습적 모니터링 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 마우스에서 실시간으로 종양 형성 및 전이성 콜로니화를 모니터링하는 기술을 제공한다.

초록

유방암은 빈번한 이질적인 악성 종양이며 주로 먼 장기 전이로 인해 여성의 사망률의 두 번째 주요 원인입니다. 암세포가 유선지방 패드에 주입되는 널리 사용되는 동위원소 마우스 모델을 포함하여 여러 동물 모델이 생성되었다. 그러나, 이들 모델은 종양 성장 동역학 및 전이성 콜로니화를 모니터링하는 것을 도울 수 없다. 생쥐에서 실시간으로 암세포를 모니터링하는 최첨단 도구는 종양 생물학에 대한 이해를 크게 향상시킬 것입니다.

여기서, 루시퍼라아제와 녹색 형광 단백질(GFP)을 안정적으로 발현하는 유방암 세포주가 확립되었다. 구체적으로, 이 기술은 시험관 내에서 루시퍼라제 활성을 측정하고 이어서 비비만 당뇨병-중증 복합 면역결핍(NOD-SCID) 마우스의 유선지방 패드에 암세포를 이식함으로써 개시되는 두 개의 순차적 단계를 포함한다. 주사 후, 종양 성장 및 전이성 콜로니화 둘 모두는 비침습적 생체발광 이미징 시스템에 의해 실시간으로 모니터링된다. 이어서, 폐에서 GFP 발현 전이의 정량화는 관찰된 생체발광 결과를 검증하기 위해 형광 현미경에 의해 검사될 것이다. 루시퍼라아제와 형광 기반 검출 도구를 결합한 이 정교한 시스템은 유방암 치료제 및 질병 관리에 사용할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있는 생체 내 암 전이를 평가합니다.

서문

유방암은 전 세계적으로 빈번한 유형의 암으로, 미국에서 매년 약 250,000 건의 새로운 사례가 진단됩니다¹. 높은 발생률에도 불구하고 새로운 항암제 세트는 유방암 환자 결과를 크게 개선했습니다². 그러나 많은 환자들이 질병 재발과 전이성이 환자의 이환률과 사망률의 주요 원인 인 중요한 장기로 전이되어^전이성 확산을 경험하기 때문에 이러한 치료법은 여전히 부적절합니다. 따라서, 유방암 연구의 주요 과제 중 하나는 원위 전이의 형성을 조절하는 분자 메커니즘을 규명하여 이들의 발달을 억제하는 새로운 수단을 개발하는 것이다.

암 전이는 세포가 원발성 종양에서 분리되어 혈액 순환을 통해 이웃 조직을 침범하는 역동적 인 과정입니다. 따라서, 세포가 유사한 전이성 캐스케이드를 겪는 동물 모델은 이러한 과정^(3,4)을 지배하는 메카니즘의 식별을 용이하게 할 수 있다. 추가적으로, 이러한 생체내 모델은 유방암 치료제^(5,6)를 개발하는데 필수적이다. 그러나, 이들 동위원소 모델은 효과가 종결시에 결정되기 때문에 실제 종양 성장 동역학을 나타낼 수 없다. 따라서 우리는 종양 발생과 전이성 식민지화를 실시간으로 탐지하는 루시페라아제 기반 도구를 확립했습니다. 추가적으로, 이들 세포는 GFP를 발현하여 전이성 콜로니를 검출한다. 이 접근법은 비교적 간단하며 어떠한 침습적 절차도 수반하지 않는다³. 따라서, 루시퍼라아제와 형광 검출을 결합하는 것은 유방암 치료제 및 질병 관리의 전임상 연구를 진전시키는 데 유용한 전략이다.

프로토콜

모든 마우스 실험은 히브리 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회-승인 프로토콜 MD-21-16429-5 하에 수행되었다. 또한, 히브리 대학은 실험실 동물 관리의 평가 및 인증을위한 협회 (AAALAC)의 인증을 받았습니다.

1. 세포주 정비

참고: 인간 유방암 세포주(MCF-7, MDA-MB-468 및 MDA-MB-231)가 이 프로토콜에 사용되었다.

1. 모든 유방암 세포주를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 배양하고, 가습된 이산화탄소(5%_CO2) 배양기에서 37°C에서 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충하였다.
   참고 : 정기적으로 세포 밀도를 확인하십시오. 70 % 합류율에 도달 할 때 향후 사용을 위해 분할하고 확장하십시오.

2. 바이러스 준비

1. HEK293T 세포가 분리될 때까지 1mL의 트립신으로 치료하십시오.
2. 트립신 활성을 중화시키기 위해 DMEM (10% FBS) 10 mL를 첨가하고, 세포 현탁액을 새로운 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
3. 150 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 침전시킨다. 원심분리 후 상층액을 버리고 신선한 DMEM 배지 1 mL를 첨가한다.
4. 세포 농도를 결정하고 6 웰 플레이트에서 10⁶ 세포 / 웰× 1.2 종자.
5. 다음 날, 형질감염 시약, 무혈청 DMEM, 엔벨로프 플라스미드 (VSV-G), 렌티바이러스 패키징 플라스미드 (ΔVPR), 및 pLX304 루시페라제-V5 블라스트 플라스미드 또는 FUW GFP 플라스미드를 포함하는 필요한 모든 시약을 예열한다.
6. 1.5 mL 오토클레이브 원심분리 튜브에서, 50 μL의 무혈청 DMEM을 0.3 μg의 VSV-G 플라스미드, 1 μg의 ΔVPR, 및 1.2 μg의 pLX304 루시페라제-V5 블라스트 플라스미드 또는 FUW GFP 플라스미드와 혼합한다.
7. 이들 플라스미드를 배지와 완전히 혼합한 후, 형질감염 시약 5 μL를 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
8. 인큐베이션 후, 상기 혼합물을 HEK293T 세포에 적가한다.
9. 24시간 후, 성장 배지를 2 mL의 (30% FBS) DMEM으로 교체한다. 다음날(형질감염 후 48시간)에, 바이러스("pLX304 루시페라제-V5 또는 FUW GFP 바이러스")를 함유하는 배지를 수확한다.
   참고: 30% FBS를 사용하면 바이러스 생산 효율성이 향상됩니다.
10. 임의의 HEK293T 세포 잔기를 피하기 위해, 바이러스 함유 배지를 0.45 μm 시린지 필터 또는 원심분리기를 통해 5분 동안 150 × g 에서 통과시키고, 상청액을 수집한다.
    참고: 장기간 보관하려면 바이러스의 작동 분취량을 -80°C에서 유지하십시오.

3. GFP와 루시퍼라아제를 안정적으로 발현하는 세포 확립 ("GFP ⁺ Luc⁺ 세포")

1. 세포를 감염시키기 전날, 6 웰 플레이트에 웰 당 8 개의 × 10 개의^{5 개의} 세포를 시드하십시오.
2. 하룻밤 동안 배양한 후, 성장 배지를 8 μg/mL의 폴리브렌을 함유하는 신선한 배지로 교체한다. 200 μL의 FUW GFP 바이러스를 세포에 적가한다.
3. 선택사항: 바이러스 효율을 향상시키기 위해, 플레이트를 560 × g 에서 30분 동안 원심분리(37°C)한다(스핀 감염).
4. 세포를 48시간 동안 인큐베이션하고, GFP 발현을 형광 현미경으로 검증한다.
5. GFP 발현 세포를 형광 활성화 세포 분류 (FACS) (GFP⁺)에 의해 정렬한다 (도 1A).
6. GFP 분류된 세포를 단계 3.2에 기재된 바와 같이 pLX304 루시페라제-V5 블라스트 바이러스로 감염시킨다.
7. 세포를 감염 후 30시간 후에 블라스티시딘(10μg/mL)으로 처리하여 pLX304 루시페라제-V5 블라스트 발현 세포(GFP+, Luc⁺ 세포)를 풍부하게 합니다. 그런 다음 이틀마다 블라스티시딘을 함유 한 신선한 배지로 교체하십시오. 추가적으로, 대조군으로서, 나이브 세포를 동일한 블라스티시딘 함유 배지로 치료한다.
   참고 : 감염된 세포와 대조 세포 간의 명확한 차이는 블라스티시딘 치료 며칠 후에 관찰되어야합니다. 이 효과는 세포주에 의존적이며 보통 ~ 8-10 일이 걸립니다. 열악한 생존율은 낮은 바이러스 생산 수율을 나타낼 것이다. 그렇다면 낮은 효율로 새로운 바이러스 배치를 생산하면 향후 실험에 영향을 줄 수 있습니다.

4. 체외 루시퍼라아제 활성 검증

1. MCF-7, MDA-MB-468, 및 MDA-MB-231 GFP⁺ Luc⁺ 세포를 15 cm 플레이트에서 80% 컨플루언시로 성장시킨다. 단계 2.1-2.2에 기재된 바와 같이 트립신화에 의해 세포를 수확한다.
2. 각 웰 (0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 × 10⁴)에서 증가하는 세포 수를 검정색 96-웰 플레이트에 시드한다.
   참고: 검은색 96웰 플레이트는 흰색 또는 투명 플레이트가 자동 발광 신호를 생성하므로 루시퍼라제 수준을 측정하는 데 더 적합합니다. 대조군으로서, PBS로부터의 자가발광이 없는지 확인하기 위해 하나의 웰에 인산완충식염수(PBS)를 단독으로 사용한다.
3. 모든 웰을 100 μL의 DMEM으로 채우고 16-24 h 동안 인큐베이션한다.
4. PBS 중의 루시페린 용액을 30 mg/mL의 스톡으로부터 1.5 mg/mL 농도로 준비한다. 루시페린 용액의 스톡을 분취액하고 -20°C에서 보관한다.
5. 세포를 PBS로 1회 부드럽게 세척하고, 각 웰에 루시페린 용액 100 μL를 첨가하고, 2분 동안 기다린다. 마지막으로, 생체발광을 이용하여 모든 유방암 세포에서 루시퍼라제 활성을 측정한다.
   참고: 동물 실험 전에 시험관내 GFP 및 루시퍼라제 발현을 검사하는 것이 중요합니다. 또한 빈 웰은 배경을 뺀 데 사용됩니다.

5. GFP^{+ Luc+} 세포에 쥐 주입하기

1. 5 × 10⁶ (MCF-7 및 MDA-MB-468) 또는 2 × 10⁶ (MDA-MB-231) GFP⁺ Luc⁺ 세포를 각각 200 μL 또는 100 μL PBS 내로 옮긴다.
2. 주사하기 전에 멸균 된 생물학적 후드를 5 % 소독제 용액으로 청소 하십시오 (자료 표 참조). 이어서, 마우스를 2-3분 동안 1 L/min의 기류 속도로 4% 이소플루란을 함유하는 여과된(0.2 μm) 공기로 마취시킨다.
   주: 적절한 마취를 확인하는 것이 필수적입니다. 마우스의 발가락을 꼬집고 어떤 반응을 찾으십시오.
3. 마취 된 마우스 머리 위에 원뿔을 수핀 위치에 놓습니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 바르십시오.
4. 면봉을 사용하여 에탄올로 유선의 위 마우스의 복부 부위를 닦고 포셉으로 4^번째 유선을 들어 올립니다.
5. 바늘 27 G x 3/4 (0.4 x 19 mm)를 지방 패드 아래에 넣고 세포 현탁액 100 μL를 천천히 주입하십시오.
   참고: 피부 아래에 둥근 팽창이 나타납니다. 또한, 부적절한 주사는 동일한 실험군에서 종양 성장 속도 또는 종양의 부재에 편차를 초래할 수 있다.
6. 주사 절차가 끝나면 마우스를 후드에서 꺼내 새 케이지로 옮깁니다. 그들이 의식으로 돌아갈 때까지 생쥐를 모니터링하십시오.
   주: 사용된 바늘과 주사기가 모두 날카로운 상자에 버려졌는지 확인하십시오.

6. GFP⁺ Luc⁺ 마우스의 루시퍼라제 수준 측정

1. 생체 발광 검출 전에 왼손으로 목을 잡고 의식이있는 마우스를 억제하십시오. 그런 다음 손을 왼쪽으로 기울이면 마우스가 위쪽으로 향하게되고 하체가 수핀 위치에 있습니다.
2. 바늘 크기가 27G x 3/4(0.4 x 19mm)인 1.0 mL 주사기를 사용하여 왼쪽 아래 복부 사분면의 마우스 복부 표면에 복강내(i.p.) 루시페린(30mg/mL) 100μL를 주입합니다.
   참고 : 바늘 끝은 내장 장기에 침투 할 수 있으므로 복벽에서 3-5mm 이상 삽입해서는 안됩니다. 또한, 마취 된 마우스의 체내에서 루시페린 분포가 의식이있는 마우스보다 느리기 때문에 마취없이 i.p. 주사를 수행하는 것이 좋습니다. 따라서, 의식이있는 마우스에서 루시퍼라제 수준을 모니터링하는 것이 더 빠른 절차입니다.
3. 마우스를 마취 없이 7분 동안 유지한 다음, 종양 동역학을 측정하기 전에 마취 챔버 내에서 3분 동안 유지하였다.
   참고 : 배양 시간은 실험, 세포주 및 종마다 다릅니다. 따라서 실험을 시작하기 전에 배양 시간을 교정하는 것이 좋습니다.
4. 단계 5.2-5.3에 기재된 바와 같이 마우스를 마취시킨다.
5. 인큐베이션 중에 소프트웨어(재료 테이블)를 열고 이미징 시스템을 초기화한 다음 초기화 버튼을 클릭합니다.
   참고 : 카메라가 식히고 -90 °C에 도달하는 데 ~ 10 분이 걸립니다. 추가적으로, 배경 대조군으로서, 순진한 마우스(즉, 루시퍼라제 유전자를 발현하지 않는 세포를 주입한 GFP⁺ 마우스)에서 루시퍼라제 수준을 측정한다.
6. 다음 설정을 사용하여 자동 노출 설정을 유지하십시오 : 노출 시간 자동, 60 초; 비닝 매체, F / 정지 1; 차단된 여기 필터; 방출 필터가 열려 있습니다. 초기화 가 끝나면 이미징 마법사를 선택| 생체 발광을 클릭하고 다음 |를 클릭하십시오. 필터 | 열기 이미지 제목에서 마우스 를 선택합니다.
7. 필드 뷰에서 스테이지 C(10cm)와 피사체 높이: 1.50cm를 선택합니다.
8. 이미지 설정 스테이지를 C로 클릭하고 획득 버튼을 클릭하기 전에 마우스가 적절한 수핀 위치의 스테이지에 배치되어 있는지 확인합니다.
9. 도어를 닫고 획득 단추를 클릭한 다음 이미지가 화면에 나타날 때까지 기다립니다.
   참고: 자동 노출 옵션을 사용하면 신호에 따라 강한 신호가 5-20초가 걸립니다. 약한 신호는 약 60 초가 소요됩니다.
10. 다른 마우스에 대해 이 단계를 반복합니다.
11. 폐 전이를 감지하려면 두꺼운 검은 판지 종이를 사용하여 원발성 종양의 강한 신호를 덮고 폐의 복부 측면 만 카메라 쪽으로 노출시킵니다. 위에서 설명한 것과 동일한 매개 변수를 사용하여 이미지를 캡처합니다.

7. 생체 발광 및 형광을 이용한 생체 외 이미지 획득

1. 데시케이터에서 이산화탄소(_CO2) 흡입을 사용하여 마우스를 안락사시키고 오토클레이브 가위와 포셉을 사용하여 마우스를 해부한다.
2. 0.9% 식염수를 사용하여 마우스를 관류시키고, 장기를 수확하고, 1x PBS로 헹구어 장기로부터 혈액 얼룩을 제거한다.
3. 헹굼 된 장기를 페트리 접시에 옮겨 생체 발광 기계의 무대에 놓습니다. 단계 6.2-6.6에 설명된 것과 동일한 생체발광 설정을 적용한다.
   참고: 루시퍼라아제 신호의 감소로 인해 이 단계는 시간 제한이 있습니다. 따라서, 마우스를 안락사시킨 후, 즉시 생체 발광에 의해 장기를 시각화한다.
4. GFP 이미지의 경우, 생체 발광 대신 형광 GFP 필터를 사용하여 단계 6.3에서 설명한 것과 동일한 설정을 적용합니다.
5. 스테레오 현미경을 사용하여 폐 이미지를 촬영하여 GFP⁺ 콜로니의 존재를 검사합니다.

8. 생체 발광 데이터 분석

1. 소프트웨어를 두 번 클릭하고 파일 메뉴에서 열기를 선택합니다.
2. 모든 파일을 열고 최소화하십시오. 모든 유닛이 래디언스(광자)인지 확인하십시오. 또한 모두에 적용을 클릭하여 모든 이미지에 대해 동일한 매개 변수를 유지합니다.
3. 보기 메뉴에서 도구 팔레트를 선택하면 새 창이 열립니다.
4. 도구 팔레트 창에서 ROI 도구 탭을 선택하고 유형에서 평균 Bkg ROI를 선택합니다.
5. ROI 도구에서 원을 선택하고 마우스의 흉부 영역에 작은 원을 그립니다.
6. 원을 두 번 클릭하고 백그라운드 ROI 탭에서 향후 ROI를 위해 BKG로 사용 옵션을 선택한 다음 완료를 클릭합니다.

9. 총 플럭스 측정

1. 공구 팔레트 창에서 ROI 도구 탭을 선택하고 유형에서 ROI 측정을 선택합니다.
2. ROI 도구에서 원을 선택하고 마우스의 원발성 종양에 큰 원을 그립니다.
3. ROI 복사를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 ROI 붙여넣기를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 각 마우스의 모든 개별 파일에 넣습니다.
4. ROI 도구 탭에서 ROI 측정을 클릭하면 ROI 측정이라는 새 창이 열립니다. 이 탭에서 측정 유형을 광도(광자)로, 이미지 속성을 모든 채워진 값으로 유지합니다.
5. 파일을 측정 파일 (*.txt) 또는 Csv(*.csv) 형식으로 내보냅니다.
6. 스프레드시트에서 내보낸 데이터를 열고 총 플럭스(p/s) 와 주 값을 가져옵니다.
   참고: 이 단계는 다른 그룹을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 , 비히 클로 치료받은 마우스와 약물로 치료받은 마우스.
7. 시간이 Y축을 따라 X축과 총 플럭스(p/s)를 따라 표시되는 XY 플롯을 생성합니다. 매주 각 표본 그룹에 대한 총 플럭스(p/s) 매개 변수를 취하고 비모수 스튜던트 t-검정을 사용하여 유의한 차이를 확인합니다.

결과

우리는 GFP 및 루시퍼라제 벡터를 발현하는 유방암 세포주 (MDA-MB-231, MCF-7 및 MDA-MB-468)를 생성하였다. 구체적으로, 이것은 순차적 감염에 의해 달성되었다. 먼저, 유방암 세포주를 형광 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 감염시켰다. GFP 양성 세포(GFP⁺)를 감염 2일 후(도 1A, B) 분류하고 pLX304 루시페라제-V5 벡터에 감염시켰다. 이어서, 블라스티시딘을 사용?...

토론

동물 기반 실험은 암 연구 7,8,9에 필수적이며, 실제로 많은 프로토콜이 개발되었습니다 3,6,10,11,12,13,14. 그러나, 이들 연구의 대부분은 실험의 끝에?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL eppendorf tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 µL tips	Lifegene	LRT10
1000 µL tips	Lifegene	LRT1000
15 mL tubes	Lifegene	LTB15-500
200 µL tips	Lifegene	LRT200
6 well cell culture plate	COSTAR	3516
96 well Plates BLACK flat bottom	Bar Naor	BN30496
Automated Cell Counters	Thermofisher	A50298
BD FACSAria III sorter	BD
BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'')	BD	302200
BD Plastipak Syringes 1 mL x 120	BD	303172
Corning 100 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430167
Corning 150 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430599
Countess cell counting chamber slides	Thermofisher	C10228
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine	Biological Industries	01-055-1A
Eclipse 80i microscope	Nikon
eppendorf Centrifuge 5810 R	Sigma Aldrich	EP5820740000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	04-127-1A
FUW GFP			Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
HEK293T			Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
Isoflurane, USP Terrell	Piramal	NDC 66794-01-25
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
L-Glutamine Solution	Biological industries	03-020-1A
Living Image Software	PerkinElmer		bioluminescence measurement
MCF-7	ATCC	ATCC HTB-22
MDA-MB-231	ATCC	ATCC HTB-26
MDA-MB-468	ATCC	ATCC HTB-132
Pasteur pipettes	NORMAX	2430-475
PBS	Hylabs	BP655/500D
pCMV-dR8.2-dvpr	Addgene	#8455	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
pCMV-VSV-G	Addgene	#8454	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
Petri dish 90 mm (90x15)	MINI PLAST	820-090-01-017
Pipettes 10ml	Lifegene	LG-GSP010010S
Pipettes 25ml	Lifegene	LG-GSP010050S
Pipettes 5ml	Lifegene	LG-GSP010005S
pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid	Addgene	#98580
Polybrene	Sigma Aldrich	#107689
Prism 9	GraphPad
Reagent Reservoirs	Bar Naor	BN20621STR200TC
SMZ18 Stereo microscopes	Nikon
Sodium Chloride	Bio-Lab	190359400
Syringe filters	Lifegene	LG-FPV403030S
Trypan Blue 0.5% solution	Biological industries	03-102-1B
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries	03-052-1a
Vacuum driven Filters	SOFRA LIFE SCIENCE	SPE-22-500
Virusolve		disinfectant
VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade	Promega	P1043
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent	Sigma Aldrich	#6366236001