Мониторинг роста рака молочной железы и метастатического колониеобразования у мышей с использованием биолюминесценции

Резюме

Здесь мы описываем неинвазивный метод мониторинга, включающий экспрессию люциферазы и зеленого флуоресцентного белка в различных клеточных линиях рака молочной железы. Этот протокол обеспечивает технику мониторинга образования опухоли и метастатической колонизации в режиме реального времени у мышей.

Аннотация

Рак молочной железы является частым гетерогенным злокачественным новообразованием и второй по значимости причиной смертности у женщин, в основном из-за отдаленных метастазов в органы. Было создано несколько моделей на животных, в том числе широко используемые ортотопические мышиные модели, где раковые клетки вводятся в жировую прокладку молочной железы. Однако эти модели не могут помочь контролировать кинетику роста опухоли и метастатическую колонизацию. Передовые инструменты для мониторинга раковых клеток в режиме реального времени у мышей значительно улучшат понимание биологии опухоли.

Здесь были установлены клеточные линии рака молочной железы, стабильно экспрессирующие люциферазу и зеленый флуоресцентный белок (GFP). В частности, этот метод содержит два последовательных шага, инициированных измерением активности люциферазы in vitro и сопровождаемых имплантацией раковых клеток в подушечки молочного жира мышей с комбинированным иммунодефицитом (NOD-SCID). После инъекции как рост опухоли, так и метастатическая колонизация контролируются в режиме реального времени неинвазивной системой визуализации биолюминесценции. Затем количественная оценка GFP-экспрессирующих метастазов в легких будет исследована флуоресцентной микроскопией для подтверждения наблюдаемых результатов биолюминесценции. Эта сложная система, сочетающая в себе люциферазу и инструменты обнаружения на основе флуоресценции, оценивает метастазирование рака in vivo, что имеет большой потенциал для использования в терапии рака молочной железы и лечении заболеваний.

Введение

Рак молочной железы является частым типом рака во всем мире, причем в Соединенных Штатах ежегодно диагностируется около 250 000 новых случаев¹. Несмотря на высокую заболеваемость, новый набор противоопухолевых препаратов значительно улучшил исходы лечения рака молочной железы². Тем не менее, эти методы лечения по-прежнему неадекватны, так как многие пациенты испытывают рецидив заболевания и метастатическое распространение на жизненно важные органы², что является основной причиной заболеваемости и смертности пациентов. Поэтому одной из основных задач в исследованиях рака молочной железы является выявление молекулярных механизмов, регулирующих образование дистальных метастазов, для разработки новых средств для ингибирования их развития.

Метастазирование рака – это динамический процесс, при котором клетки отделяются от первичной опухоли и вторгаются в соседние ткани через кровообращение. Таким образом, животные модели, в которых клетки подвергаются подобному метастатическому каскаду, могут облегчить идентификацию механизмов, управляющих этим процессом ^3,4. Кроме того, эти модели in vivo необходимы для разработки терапевтических агентов рака молочной железы ^5,6. Однако эти ортотопические модели не могут указывать фактическую кинетику роста опухоли, поскольку эффект определяется только после прекращения. Поэтому мы создали инструмент на основе люциферазы для обнаружения развития опухоли и метастатической колонизации в режиме реального времени. Кроме того, эти клетки экспрессируют GFP для обнаружения метастатических колоний. Этот подход относительно прост и не предполагает каких-либо инвазивных процедур³. Таким образом, сочетание люциферазы и обнаружения флуоресценции является полезной стратегией для продвижения доклинических исследований терапии рака молочной железы и лечения заболеваний.

протокол

Все эксперименты на мышах проводились в соответствии с протоколом MD-21-16429-5, одобренным Комитетом по уходу и использованию животных Еврейского университета. Кроме того, Еврейский университет сертифицирован Ассоциацией по оценке и аккредитации по уходу за лабораторными животными (AAALAC).

1. Обслуживание клеточной линии

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовались клеточные линии рака молочной железы человека (MCF-7, MDA-MB-468 и MDA-MB-231).

1. Культивируйте все клеточные линии рака молочной железы в модифицированной среде Eagle 's Dulbecco's (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином при 37 °C в увлажненном инкубаторе углекислого газа (5% CO₂).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярно проверяйте плотность ячеек; разделение и расширение для будущего использования, когда они достигнут 70% слияния.

2. Подготовка к вирусам

1. Обработайте клетки HEK293T 1 мл трипсина до тех пор, пока они не отделятся.
2. Добавьте 10 мл DMEM (10% FBS) для нейтрализации активности трипсина и перенесите клеточную суспензию в новую 15 мл центрифужную трубку.
3. Центрифуга при 150 × г в течение 5 мин для осаждения клеток. Выбросьте супернатант после центрифугирования и добавьте 1 мл свежей среды DMEM.
4. Определяют концентрацию клеток и семена 1,2 × 10⁶ клеток/лунку в шестилуночной пластине.
5. На следующий день предваряют все необходимые реагенты, включая трансфекционный реагент, бессывороточный DMEM, плазмиду оболочки (VSV-G), плазмиду упаковки лентивируса (ΔVPR) и бластную плазмиду pLX304 Люциферазы-V5 или плазмиду FUW GFP.
6. В 1,5 мл автоклавной центрифужной трубки смешайте 50 мкл бессывороточного DMEM с 0,3 мкг плазмиды VSV-G, 1 мкг ΔVPR и 1,2 мкг pLX304 Люциферазы-V5 бластной плазмиды или плазмиды FUW GFP.
7. После тщательного смешивания этих плазмид со средой добавляют 5 мкл трансфекционного реагента, аккуратно перемешивают и инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 15 мин.
8. После инкубации добавьте смесь по каплям в клетки HEK293T.
9. Через 24 ч заменить питательную среду 2 мл (30% FBS) DMEM. На следующий день (через 48 ч после трансфекции) соберите среду, содержащую вирусы («pLX304 Luciferase-V5 или вирусы FUW GFP»).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 30% FBS повышает эффективность производства вирусов.
10. Чтобы избежать остатков клеток HEK293T, пропустите вируссодержащую среду через шприцевой фильтр или центрифугу 0,45 мкм при 150 × г в течение 5 мин и соберите супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения держите рабочие аликвоты вируса при -80 °C.

3. Создание клеток, стабильно экспрессирующих GFP и люциферазу («GFP ⁺ Luc⁺ клетки»)

1. За день до заражения клеток семена 8 × 10⁵ клеток на лунку в шестилуночной пластине.
2. После ночной инкубации замените питательную среду свежей средой, содержащей 8 мкг/мл полибрена. Добавьте 200 мкл вирусов FUW GFP по каплям в клетки.
3. Дополнительно: Для повышения эффективности вируса центрифугируйте пластину при 560 × г в течение 30 мин (37 °C) (спиновая инфекция).
4. Инкубируют клетки в течение 48 ч и проверяют экспрессию GFP с помощью флуоресцентной микроскопии.
5. Сортируйте GFP-экспрессирующие клетки с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) (GFP⁺) (рисунок 1A).
6. Заразите клетки, отсортированные по GFP, бластными вирусами pLX304 Люциферазы-V5, как описано в шаге 3.2.
7. Обрабатывайте клетки бластицидином (10 мкг/мл) через 30 ч после заражения для обогащения бласт-экспрессирующих клеток pLX304 Люциферазы-V5 (клетки GFP⁺, Luc⁺ ). Затем, каждые два дня, заменяйте свежей средой, содержащей бластицидин. Дополнительно, в качестве контроля, обрабатывайте наивные клетки той же бластицидинсодержащей средой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Четкая разница между инфицированными и контрольными клетками должна наблюдаться после нескольких дней лечения бластицидином. Этот эффект зависит от клеточной линии и обычно занимает ~ 8-10 дней. Плохая выживаемость будет указывать на низкий выход вирусной продукции. Если это так, произведите новую партию вирусов, так как низкая эффективность может повлиять на будущие эксперименты.

4. Подтверждение активности люциферазы in vitro

1. Увеличьте ячейки MCF-7, MDA-MB-468 и MDA-MB-231 GFP⁺ Luc⁺ в пластине 15 см до 80% слияния. Собирают клетки путем трипсинизации, как описано в шагах 2.1-2.2.
2. Посейте все большее количество клеток в каждой лунке (0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 × 10⁴) в черную 96-луночную пластину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Черные 96-луночные пластины больше подходят для измерения уровней люциферазы, поскольку белые или прозрачные пластины будут производить сигналы автолюминесценции. В качестве контроля используйте фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) только в одной скважине, чтобы убедиться, что нет автолюминесценции от PBS.
3. Заполните все колодцы 100 мкл DMEM и инкубируйте в течение 16-24 ч.
4. Готовят раствор люциферина в PBS в концентрации 1,5 мг/мл из запаса 30 мг/мл. Аликвот на складе раствора люциферина и хранить при -20 °С.
5. Аккуратно промыть клетки PBS, добавить 100 мкл раствора люциферина в каждую лунку и подождать 2 мин. Наконец, измерьте активность люциферазы во всех клетках рака молочной железы, используя биолюминесценцию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изучение экспрессии GFP и люциферазы in vitro до экспериментов на животных имеет решающее значение. Кроме того, пустые колодцы используются для вычитания фона.

5. Инъекция мышам клеток GFP⁺ Luc⁺

1. Перенос 5 × 10⁶ (MCF-7 и MDA-MB-468) или 2 × 10⁶ (MDA-MB-231) клеток GFP⁺ Luc⁺ в 200 мкл или 100 мкл PBS соответственно.
2. Перед инъекцией очистите стерильную биологическую вытяжку 5% дезинфицирующим раствором (см. Таблицу материалов). Затем обезболивают мышей фильтрованным (0,2 мкм) воздухом, содержащим 4% изофлурана со скоростью воздушного потока 1 л/мин в течение 2−3 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно подтвердить надлежащую анестезию; зажмите палец мыши и найдите любой ответ.
3. Поместите конус над головкой анестезированной мыши в лежачем положении. Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
4. Протрите брюшную область мыши, над молочной железой, этанолом ватным тампоном и поднимите^4-ю молочную железу щипцами.
5. Вставьте иглу 27 G x 3/4 (0,4 x 19 мм) под жировую прокладку и медленно введите 100 мкл клеточной суспензии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Под кожей появится круглая выпуклость. Кроме того, неправильная инъекция может привести к отклонению скорости роста опухоли или отсутствию опухоли в той же экспериментальной группе.
6. После процедуры инъекции выньте мышей из капюшона и перенесите их в новую клетку. Следите за мышами, пока они не вернутся в сознание.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все использованные иглы и шприцы выброшены в коробку с острыми предметами.

6. Измерение уровня люциферазы у мышей GFP⁺ Luc⁺

1. Перед обнаружением биолюминесценции удерживайте сознательную мышь, держа ее шею левой рукой. Затем наклоните руку влево, в результате чего мышь лицом вверх с нижней частью тела в положении лежа.
2. Вводят 100 мкл люциферина (30 мг/мл) внутрибрюшинно (т..) в брюшную поверхность мыши в нижнем левом брюшном квадранте с помощью шприца объемом 1,0 мл с размером иглы 27 Г х 3/4 (0,4 х 19 мм).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кончик иглы не следует вводить более чем на 3-5 мм от брюшной стенки, так как он может проникнуть в висцеральные органы. Кроме того, рекомендуется выполнять инъекции без анестезии, так как распределение люциферина в организме анестезируемых мышей происходит медленнее, чем у мышей в сознании. Таким образом, мониторинг уровня люциферазы у сознательных мышей является более быстрой процедурой.
3. Держите мышь в течение 7 минут без анестезии, а затем 3 минуты в анестезиологической камере перед измерением кинетики опухоли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации варьируется между различными экспериментами, клеточными линиями и видами к видам. Таким образом, перед началом экспериментов рекомендуется откалибровать время инкубации.
4. Обезболивают мышей, как описано в шагах 5.2-5.3.
5. Откройте программное обеспечение (Таблицу материалов) во время инкубации, инициализируйте систему обработки изображений и нажмите кнопку Инициализировать .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что камере потребуется ~ 10 минут, чтобы остыть и достичь -90 ° C. Кроме того, в качестве фонового контроля измерьте уровни люциферазы у наивных мышей (то есть у мышей GFP⁺ , которым вводили клетки, которые не экспрессируют ген люциферазы).
6. Сохраните настройку в автоматической экспозиции, используя следующие настройки: время экспозиции авто, 60 с; Биннинг Средний, F/Stop 1; Фильтр возбуждения заблокирован; Эмиссионный фильтр открыт. По окончании инициализации выберите Мастер создания образов | Биолюминесценция и нажмите кнопку Далее | Открыть | фильтра выберите Мышь в теме изображения.
7. В поле «Вид поля» выберите стадию C (10 см) и высоту объекта: 1,50 см.
8. Щелкните Этап настройки изображения на C и перед нажатием кнопки Получить убедитесь, что мышь помещена на рабочую область в правильном положении лежа.
9. Закройте дверь, нажмите кнопку «Получить» и дождитесь появления изображения на экране.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С опцией Auto-Exposure сильный сигнал занимает 5-20 с в зависимости от сигнала; слабый сигнал займет около 60 с.
10. Повторите этот шаг для других мышей.
11. Чтобы обнаружить метастазы в легкие, накройте сильный сигнал первичной опухоли толстой черной картонной бумагой и обнажите только вентральную сторону легких по направлению к камере. Захват изображения с использованием тех же параметров, которые описаны выше.

7. Получение изображения ex vivo с использованием биолюминесценции и флуоресценции

1. Усыпляйте мышей с помощью вдыхания углекислого газа (CO₂) в осушителе и рассекайте мышей с помощью автоклавных ножниц и щипцов.
2. Перфьюзируйте мышей, используя 0,9% физиологического раствора, извлекайте органы и промывайте 1x PBS, чтобы устранить пятна крови из органа.
3. Перенесите промытый орган в чашку Петри и поместите его в стадию биолюминесцентной машины. Применяют ту же настройку биолюминесценции, как описано в шагах 6.2-6.6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за снижения сигнала люциферазы этот шаг ограничен по времени. Таким образом, после эвтаназии мышей сразу же визуализируют орган по биолюминесценции.
4. Для изображений GFP примените ту же настройку, что и в шаге 6.3, используя флуоресцентный фильтр GFP вместо биолюминесценции.
5. Делайте снимки легких с помощью стереомикроскопа для изучения наличия колоний GFP⁺ .

8. Анализ данных биолюминесценции

1. Дважды щелкните программное обеспечение и выберите Открыть в меню Файл .
2. Откройте все файлы и сверните их. Убедитесь, что все единицы измерения являются излучением (фотонами). Кроме того, нажмите кнопку Применить ко всем , чтобы сохранить одинаковые параметры для всех изображений.
3. В меню Вид выберите инструментальную палитру, которая откроет новое окно.
4. В окне Инструментальная палитра перейдите на вкладку Инструменты окупаемости инвестиций и в поле Тип выберите Среднюю рентабельность инвестиций в Bkg.
5. В инструментах ROI выберите Круг и нарисуйте небольшой круг на грудной области мыши.
6. Дважды щелкните по кругу, выберите параметр Использовать как BKG для будущих ROI на вкладке Фоновая рентабельность инвестиций и нажмите кнопку Готово.

9. Измерение общего потока

1. В окне Инструментальная палитра перейдите на вкладку Инструменты окупаемости инвестиций и в поле Тип выберите Измерение окупаемости инвестиций.
2. В инструментах ROI выберите Круг и нарисуйте большой круг на первичной опухоли мыши.
3. Щелкните правой кнопкой мыши Копировать ROI и щелкните правой кнопкой мыши Вставить ROI в каждый отдельный файл каждой мыши.
4. Щелкните Измерить рентабельность инвестиций на вкладке Инструменты окупаемости инвестиций , которая откроет новое окно с именем Измерения окупаемости инвестиций. На этой вкладке сохраните Типы измерений как Излучение (фотоны) и Атрибуты изображения как Все заполненные значения.
5. Экспортируйте файл в формате Файла измерений (*.txt) или Csv (*.csv).
6. Откройте экспортированные данные в электронной таблице и возьмите общий поток (p/s) и значения за недели.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно использовать для измерения различных групп. Например, мыши, обработанные транспортным средством , по сравнению с теми, кого лечили препаратом.
7. Создайте график XY, где время представлено вдоль оси X, а общий поток (p/s) вдоль оси Y. Для каждой недели принимайте параметр Total Flux (p/s) для каждой выборочной группы и определяйте любые существенные различия с помощью t-теста непараметрического студента.

Результаты

Мы сгенерировали клеточные линии рака молочной железы (MDA-MB-231, MCF-7 и MDA-MB-468), экспрессирующие векторы GFP и люциферазы. В частности, это было достигнуто путем последовательной инфекции. Во-первых, клеточные линии рака молочной железы были инфицированы лентивирусным вектором, экспрессирующ...

Обсуждение

Эксперименты на животных являются обязательными для исследования рака ^7,8,9, и действительно было разработано много протоколов ^{3,6,10,11,12,13,14<...}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL eppendorf tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 µL tips	Lifegene	LRT10
1000 µL tips	Lifegene	LRT1000
15 mL tubes	Lifegene	LTB15-500
200 µL tips	Lifegene	LRT200
6 well cell culture plate	COSTAR	3516
96 well Plates BLACK flat bottom	Bar Naor	BN30496
Automated Cell Counters	Thermofisher	A50298
BD FACSAria III sorter	BD
BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'')	BD	302200
BD Plastipak Syringes 1 mL x 120	BD	303172
Corning 100 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430167
Corning 150 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430599
Countess cell counting chamber slides	Thermofisher	C10228
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine	Biological Industries	01-055-1A
Eclipse 80i microscope	Nikon
eppendorf Centrifuge 5810 R	Sigma Aldrich	EP5820740000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	04-127-1A
FUW GFP			Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
HEK293T			Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
Isoflurane, USP Terrell	Piramal	NDC 66794-01-25
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
L-Glutamine Solution	Biological industries	03-020-1A
Living Image Software	PerkinElmer		bioluminescence measurement
MCF-7	ATCC	ATCC HTB-22
MDA-MB-231	ATCC	ATCC HTB-26
MDA-MB-468	ATCC	ATCC HTB-132
Pasteur pipettes	NORMAX	2430-475
PBS	Hylabs	BP655/500D
pCMV-dR8.2-dvpr	Addgene	#8455	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
pCMV-VSV-G	Addgene	#8454	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
Petri dish 90 mm (90x15)	MINI PLAST	820-090-01-017
Pipettes 10ml	Lifegene	LG-GSP010010S
Pipettes 25ml	Lifegene	LG-GSP010050S
Pipettes 5ml	Lifegene	LG-GSP010005S
pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid	Addgene	#98580
Polybrene	Sigma Aldrich	#107689
Prism 9	GraphPad
Reagent Reservoirs	Bar Naor	BN20621STR200TC
SMZ18 Stereo microscopes	Nikon
Sodium Chloride	Bio-Lab	190359400
Syringe filters	Lifegene	LG-FPV403030S
Trypan Blue 0.5% solution	Biological industries	03-102-1B
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries	03-052-1a
Vacuum driven Filters	SOFRA LIFE SCIENCE	SPE-22-500
Virusolve		disinfectant
VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade	Promega	P1043
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent	Sigma Aldrich	#6366236001