Überwachung des Brustkrebswachstums und der metastasierenden Koloniebildung bei Mäusen mittels Biolumineszenz

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine nichtinvasive Überwachungsmethode, die Luciferase und grün fluoreszierende Proteinexpression in verschiedenen Brustkrebszelllinien beinhaltet. Dieses Protokoll bietet eine Technik zur Überwachung der Tumorbildung und der metastasierenden Besiedlung in Echtzeit bei Mäusen.

Zusammenfassung

Brustkrebs ist eine häufige heterogene Malignität und die zweithäufigste Todesursache bei Frauen, hauptsächlich aufgrund von entfernten Organmetastasen. Es wurden mehrere Tiermodelle erstellt, darunter die weit verbreiteten orthotopen Mausmodelle, bei denen Krebszellen in das Brustfettpolster injiziert werden. Diese Modelle können jedoch nicht dazu beitragen, die Kinetik des Tumorwachstums und die metastasierende Besiedlung zu überwachen. Modernste Werkzeuge zur Echtzeitüberwachung von Krebszellen in Mäusen werden das Verständnis der Tumorbiologie erheblich verbessern.

Hier wurden Brustkrebszelllinien etabliert, die Luziferase und grün fluoreszierendes Protein (GFP) stabil exprimieren. Insbesondere enthält diese Technik zwei aufeinanderfolgende Schritte, die durch die Messung der Luciferase-Aktivität in vitro eingeleitet werden, gefolgt von der Implantation der Krebszellen in Brustfettpolster von nicht fettleibigen diabetisch-schweren kombinierten Immunschwächemäusen (NOD-SCID). Nach der Injektion werden sowohl das Tumorwachstum als auch die metastasierende Besiedlung in Echtzeit durch das nichtinvasive Biolumineszenz-Bildgebungssystem überwacht. Dann wird die Quantifizierung von GFP-exprimierenden Metastasen in der Lunge mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht, um die beobachteten Biolumineszenzergebnisse zu validieren. Dieses ausgeklügelte System, das Luciferase und fluoreszenzbasierte Erkennungswerkzeuge kombiniert, bewertet Krebsmetastasen in vivo, was ein großes Potenzial für den Einsatz in Brustkrebstherapeutika und Krankheitsmanagement hat.

Einleitung

Brustkrebs ist weltweit eine häufige Krebsart, mit etwa 250.000 neuen Fällen, die jedes Jahr in den Vereinigten Staaten diagnostiziert^{werden 1}. Trotz seiner hohen Inzidenz hat eine neue Reihe von Krebsmedikamenten die Ergebnisse von Brustkrebspatientinnen signifikant verbessert². Diese Behandlungen sind jedoch immer noch unzureichend, da viele Patienten einen Krankheitsrückfall und eine metastatische Ausbreitung auf lebenswichtige Organe² erfahren, was die Hauptursache für die Morbidität und Mortalität der Patienten ist. Daher besteht eine der größten Herausforderungen in der Brustkrebsforschung darin, die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die die Bildung von distalen Metastasen regulieren, um neue Mittel zur Hemmung ihrer Entwicklung zu entwickeln.

Krebsmetastasen sind ein dynamischer Prozess, bei dem sich Zellen vom Primärtumor lösen und durch den Blutkreislauf in benachbarte Gewebe eindringen. So können Tiermodelle, in denen die Zellen eine ähnliche metastatische Kaskade durchlaufen, die Identifizierung der Mechanismen erleichtern, die diesen Prozess steuern ^3,4. Darüber hinaus sind diese In-vivo-Modelle für die Entwicklung von Brustkrebstherapeutika^{unerlässlich 5,6}. Diese orthotopen Modelle können jedoch nicht auf die tatsächliche Kinetik des Tumorwachstums hinweisen, da der Effekt erst bei Beendigung bestimmt wird. Daher haben wir ein Luciferase-basiertes Tool entwickelt, um Tumorentwicklung und metastasierende Besiedlung in Echtzeit zu erkennen. Zusätzlich exprimieren diese Zellen GFP, um die metastatischen Kolonien zu erkennen. Dieser Ansatz ist relativ einfach und beinhaltet keine invasiven Verfahren³. Daher ist die Kombination von Luciferase- und Fluoreszenzdetektion eine hilfreiche Strategie, um die präklinischen Studien von Brustkrebstherapeutika und Krankheitsmanagement voranzutreiben.

Protokoll

Alle Mausexperimente wurden unter dem vom Hebrew University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Protokoll MD-21-16429-5 durchgeführt. Darüber hinaus ist die Hebrew University von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) zertifiziert.

1. Pflege der Zelllinie

HINWEIS: Die menschlichen Brustkrebs-Zelllinien (MCF-7, MDA-MB-468 und MDA-MB-231) wurden in diesem Protokoll verwendet.

1. Kultivieren Sie alle Brustkrebszelllinien in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 °C in einem befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator (5% CO₂).
   HINWEIS: Überprüfen Sie die Zelldichte regelmäßig; Teilen und erweitern Sie für die zukünftige Verwendung, wenn sie 70% Konfluenz erreichen.

2. Virenvorbereitung

1. Behandeln Sie die HEK293T-Zellen mit 1 ml Trypsin, bis sie sich lösen.
2. Fügen Sie 10 ml DMEM (10% FBS) hinzu, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
3. Zentrifugieren Sie bei 150 × g für 5 Minuten, um die Zellen zu sedimentieren. Verwerfen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und fügen Sie 1 ml frisches DMEM-Medium hinzu.
4. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und säen Sie 1,2 × 10⁶ Zellen / Well in einer Sechs-Well-Platte.
5. Vorwärmen Sie am folgenden Tag alle notwendigen Reagenzien, einschließlich Transfektionsreagenz, serumfreies DMEM, Hüllplasmid (VSV-G), Lentivirus-Verpackungsplasmid (ΔVPR) und pLX304 Luciferase-V5-Blastenplasmid oder FUW-GFP-Plasmid.
6. Mischen Sie in einem 1,5 ml autoklavierten Zentrifugenröhrchen 50 μL serumfreies DMEM mit 0,3 μg VSV-G-Plasmid, 1 μg ΔVPR und 1,2 μg pLX304 Luciferase-V5-Blastenplasmid oder FUW GFP-Plasmid.
7. Nachdem Sie diese Plasmide gründlich mit dem Medium vermischt haben, fügen Sie 5 μL des Transfektionsreagenzes hinzu, mischen Sie vorsichtig und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 15 min.
8. Nach der Inkubation fügen Sie die Mischung tropfenweise zu den HEK293T-Zellen hinzu.
9. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium nach 24 h durch 2 ml (30% FBS) DMEM. Am folgenden Tag (48 h nach der Transfektion) wird das Medium geerntet, das die Viren ("pLX304 Luciferase-V5 oder die FUW GFP-Viren") enthält.
   HINWEIS: Die Verwendung von 30% FBS erhöht die Effizienz der Virusproduktion.
10. Um HEK293T-Zellrückstände zu vermeiden, lassen Sie das virushaltige Medium 5 min lang mit 150 × g durch einen 0,45 μm Spritzenfilter oder eine Zentrifuge und sammeln den Überstand.
    HINWEIS: Für die Langzeitlagerung halten Sie die Arbeitsaliquoten des Virus bei -80 °C.

3. Etablierung von Zellen, die GFP und Luciferase stabil exprimieren ("GFP ⁺ Luc⁺ Zellen")

1. Am Tag vor der Infektion der Zellen werden 8 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit sechs Vertiefungen ausgesät.
2. Ersetzen Sie nach der Inkubation über Nacht das Wachstumsmedium durch frisches Medium, das 8 μg/ml Polybren enthält. Geben Sie 200 μL FUW-GFP-Viren tropfenweise zu den Zellen.
3. Optional: Um die Viruseffizienz zu verbessern, zentrifen Sie die Platte bei 560 × g für 30 min (37 °C) (Spininfektion).
4. Inkubieren Sie die Zellen für 48 h und überprüfen Sie die GFP-Expression durch Fluoreszenzmikroskopie.
5. Sortieren Sie die GFP-exprimierenden Zellen nach fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) (GFP+) (Abbildung 1A^).
6. Infizieren Sie die GFP-sortierten Zellen mit den Blastviren pLX304 Luciferase-V5, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
7. Behandeln Sie die Zellen mit Blasticidin (10 μg/ml) 30 h nach der Infektion, um sich für pLX304 Luciferase-V5 blast-exprimierende Zellen (GFP+^, Luc⁺ Zellen) anzureichern. Dann alle zwei Tage durch frisches Medium ersetzen, das Blasticidin enthält. Behandeln Sie zusätzlich als Kontrolle naive Zellen mit dem gleichen blastizidinhaltigen Medium.
   HINWEIS: Ein deutlicher Unterschied zwischen den infizierten und Kontrollzellen sollte nach einigen Tagen der Behandlung mit Blasticidin beobachtet werden. Dieser Effekt ist zelllinienabhängig und dauert in der Regel ~8-10 Tage. Eine schlechte Überlebensrate weist auf eine geringe virale Produktionsausbeute hin. Wenn ja, produzieren Sie eine neue Charge von Viren, da eine geringe Effizienz zukünftige Experimente beeinträchtigen kann.

4. Validierung der In-vitro-Luciferase-Aktivität

1. Züchten Sie die MCF-7-, MDA-MB-468- und MDA-MB-231 GFP+ Luc⁺-Zellen in einer 15-cm-Platte auf 80% Konfluenz. Die Zellen werden durch Trypsinisierung geerntet, wie in den Schritten 2.1-2.2 beschrieben.
2. Samen Sie eine zunehmende Anzahl von Zellen in jedem Well (0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 × 10⁴) in eine schwarze 96-Well-Platte.
   HINWEIS: Schwarze 96-Well-Platten eignen sich besser für die Messung von Luciferase-Werten, da weiße oder transparente Platten Autolumineszenzsignale erzeugen. Verwenden Sie als Kontrolle phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) allein in einem Bohrloch, um sicherzustellen, dass es keine Autolumineszenz von PBS gibt.
3. Füllen Sie alle Vertiefungen mit 100 μL DMEM und inkubieren Sie für 16-24 h.
4. Luziferinlösung in PBS in einer Konzentration von 1,5 mg/ml aus dem Bestand von 30 mg/ml herzustellen. Aliquot den Bestand an Luciferinlösung und lagern bei -20 °C.
5. Waschen Sie die Zellen einmal vorsichtig mit PBS, fügen Sie 100 μL Luciferinlösung in jede Vertiefung hinzu und warten Sie 2 Minuten. Messen Sie schließlich die Luciferase-Aktivität in allen Brustkrebszellen mit Biolumineszenz.
   HINWEIS: Die Untersuchung der In-vitro-GFP- und Luciferase-Expression vor Tierversuchen ist von entscheidender Bedeutung. Zusätzlich werden leere Vertiefungen verwendet, um den Hintergrund zu subtrahieren.

5. Injektion von Mäusen mit GFP+ Luc⁺ Zellen

1. Übertragen Sie 5 × 10 6 (MCF-7 und MDA-MB-468) oder 2 ×^{10 6} (MDA-MB-231) GFP+ Luc⁺ Zellen in 200 μL bzw. 100 μL PBS.
2. Reinigen Sie vor der Injektion die sterile biologische Haube mit 5% iger Desinfektionslösung (siehe Materialtabelle). Dann betäuben Sie die Mäuse mit gefilterter (0,2 μm) Luft, die 4% Isofluran enthält, bei einem Luftdurchsatz von 1 l / min für 2-3 min.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die richtige Anästhesie zu bestätigen; Kneifen Sie den Zeh der Maus zusammen und suchen Sie nach einer Antwort.
3. Legen Sie einen Kegel über den betäubten Mauskopf in Rückenlage. Tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
4. Wischen Sie den Bauchbereich der Maus oberhalb der Brustdrüse mit Ethanol mit einem Wattestäbchen ab und heben Sie die 4. Brustdrüse mit einer Pinzette^an.
5. Führen Sie die Nadel 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) unter das Fettpolster ein und injizieren Sie langsam 100 μL der Zellsuspension.
   HINWEIS: Unter der Haut erscheint eine runde Ausbuchtung. Darüber hinaus kann eine unsachgemäße Injektion zu einer Abweichung der Tumorwachstumsrate oder zum Fehlen eines Tumors in derselben experimentellen Gruppe führen.
6. Nehmen Sie nach dem Injektionsverfahren die Mäuse aus der Haube und bringen Sie sie in einen neuen Käfig. Überwachen Sie die Mäuse, bis sie wieder zu Bewusstsein kommen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle verwendeten Nadeln und Spritzen in der Schachtel für scharfe Gegenstände entsorgt werden.

6. Messung der Luciferase-Spiegel in GFP+ Luc⁺ Mäusen

1. Halten Sie vor der Biolumineszenzerkennung die bewusste Maus zurück, indem Sie ihren Hals mit der linken Hand halten. Neigen Sie dann die Hand nach links, was dazu führt, dass die Maus nach oben zeigt, wobei sich der Unterkörper in Rückenlage befindet.
2. Injektion von 100 μL Luciferin (30 mg/ml) intraperitoneal (i.p.) in die Bauchoberfläche der Maus im unteren linken Bauchquadranten mit einer 1,0 ml Spritze mit Nadelgröße 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm).
   HINWEIS: Die Spitze der Nadel sollte nicht mehr als 3-5 mm von der Bauchdecke entfernt eingeführt werden, da sie in viszerale Organe eindringen kann. Darüber hinaus wird empfohlen, eine i.p.-Injektion ohne Anästhesie durchzuführen, da die Luciferinverteilung im Körper von anästhesierten Mäusen langsamer ist als bei bewussten Mäusen. Daher ist die Überwachung der Luciferase-Spiegel in bewussten Mäusen ein schnelleres Verfahren.
3. Halten Sie die Maus für 7 Minuten ohne Anästhesie, gefolgt von 3 Minuten in der Anästhesiekammer, bevor Sie die Tumorkinetik messen.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit variiert zwischen den verschiedenen Experimenten, Zelllinien und Spezies zu Spezies. Daher wird empfohlen, die Inkubationszeit vor Beginn der Experimente zu kalibrieren.
4. Anästhesien der Mäuse wie in den Schritten 5.2-5.3 beschrieben.
5. Öffnen Sie die Software (Table of Materials) während der Inkubation, initialisieren Sie das Imaging-System, und klicken Sie auf die Schaltfläche Initialisieren .
   HINWEIS: Beachten Sie, dass die Kamera ~ 10 Minuten braucht, um abzukühlen und -90 ° C zu erreichen. Zusätzlich messen Sie als Hintergrundkontrolle die Luciferase-Spiegel bei naiven Mäusen (d. H. GFP⁺ -Mäusen, denen Zellen injiziert werden, die das Luciferase-Gen nicht exprimieren).
6. Halten Sie das Setup in der automatischen Belichtung mit den folgenden Einstellungen bei: Belichtungszeit automatisch, 60 s; Binning Medium, F/Stop 1; Anregungsfilter blockiert; Emissionsfilter geöffnet. Wenn die Initialisierung beendet ist, wählen Sie Imaging-Assistent | Biolumineszenz, und klicken Sie dann auf Weiter | Filter-| öffnen Wählen Sie im Bildmotiv die Option Maus aus.
7. Wählen Sie in der Feldansicht Stufe C (10 cm) und Betreffhöhe: 1,50 cm aus.
8. Klicken Sie auf Bildeinrichtungsstufe auf C, und stellen Sie vor dem Klicken auf die Schaltfläche Erfassen sicher, dass die Maus in der richtigen Rückenlage auf der Bühne platziert ist.
9. Schließen Sie die Tür, klicken Sie auf die Schaltfläche Erwerben und warten Sie, bis ein Bild auf dem Bildschirm angezeigt wird.
   HINWEIS: Mit der Option Auto-Exposure dauert ein starkes Signal je nach Signal 5-20 s. Ein schwaches Signal dauert etwa 60 s.
10. Wiederholen Sie diesen Schritt für die anderen Mäuse.
11. Um Lungenmetastasen zu erkennen, decken Sie das starke Signal des Primärtumors mit dickem schwarzem Papppapier ab und legen Sie nur die ventrale Seite der Lunge gegenüber der Kamera frei. Nehmen Sie das Bild mit den gleichen Parametern auf, die oben beschrieben wurden.

7. Ex-vivo-Bilderfassung mittels Biolumineszenz und Fluoreszenz

1. Euthanasie die Mäuse mit Kohlendioxid (CO₂) Inhalation im Exsikkator und sezieren Sie die Mäuse mit autoklavierten Scheren und Pinzetten.
2. Perfusionieren Sie die Mäuse mit 0,9% Kochsalzlösung, ernten Sie die Organe und spülen Sie sie mit 1x PBS ab, um Blutflecken aus dem Organ zu entfernen.
3. Übertragen Sie das gespülte Organ in eine Petrischale und legen Sie es in die Bühne der Biolumineszenzmaschine. Wenden Sie dieselbe Biolumineszenzeinstellung an, die in den Schritten 6.2-6.6 beschrieben ist.
   HINWEIS: Aufgrund der Abnahme des Luciferase-Signals ist dieser Schritt zeitlich begrenzt. So visualisieren Sie nach dem Einschläfern von Mäusen sofort das Organ durch Biolumineszenz.
4. Wenden Sie für GFP-Bilder die gleiche Einstellung wie in Schritt 6.3 beschrieben an, indem Sie den GFP-Filter Fluoreszenz anstelle von Biolumineszenz verwenden.
5. Nehmen Sie Lungenbilder mit einem Stereomikroskop auf, um das Vorhandensein von GFP⁺ -Kolonien zu untersuchen.

8. Analyse der Biolumineszenzdaten

1. Doppelklicken Sie auf die Software und wählen Sie Öffnen aus dem Menü Datei .
2. Öffnen Sie alle Dateien und minimieren Sie sie. Stellen Sie sicher, dass alle Einheiten Radiance (Photonen) sind. Klicken Sie außerdem auf Auf alle anwenden , um die gleichen Parameter für alle Bilder beizubehalten.
3. Wählen Sie im Menü " Ansicht" die Werkzeugpalette aus, wodurch ein neues Fenster geöffnet wird.
4. Wählen Sie im Fenster Werkzeugpalette die Registerkarte ROI-Tools und unter Typ den ROI Average Bkg ROI aus.
5. Wählen Sie in den ROI-Tools Kreis aus, und zeichnen Sie einen kleinen Kreis auf dem Brustbereich der Maus.
6. Doppelklicken Sie auf den Kreis, wählen Sie auf der Registerkarte ROI im Hintergrund die Option Als BKG für zukünftige ROIs verwenden und klicken Sie auf Fertig.

9. Messung des Gesamtflusses

1. Wählen Sie im Fenster Werkzeugpalette die Registerkarte ROI-Tools und unter Typ die Option Messung des ROI aus.
2. Wählen Sie in den ROI-Tools Kreis aus, und zeichnen Sie einen großen Kreis auf den Primärtumor der Maus.
3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ROI kopieren , und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ROI in jede einzelne Datei jeder Maus einfügen.
4. Klicken Sie auf der Registerkarte ROI-Tools auf ROIs messen, um ein neues Fenster mit dem Namen ROI-Messungen zu öffnen. Behalten Sie auf dieser Registerkarte die Messtypen als Strahldichte (Photonen) und Bildattribute als alle aufgefüllten Werte bei.
5. Exportieren Sie die Datei im Format Measurements File (*.txt) oder Csv (*.csv).
6. Öffnen Sie die exportierten Daten in einer Tabelle und nehmen Sie den Gesamtfluss (p/s) und die Werte für die Wochen.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann verwendet werden, um verschiedene Gruppen zu messen. Zum Beispiel Mäuse, die mit einem Vehikel behandelt werden, im Vergleich zu denen, die mit einem Medikament behandelt werden.
7. Generieren Sie ein XY-Diagramm, in dem die Zeit entlang der X-Achse und der Gesamtfluss (p/s) entlang der Y-Achse dargestellt wird. Nehmen Sie für jede Woche den Parameter Total Flux (p/s) für jede Stichprobengruppe und bestimmen Sie signifikante Unterschiede mit dem nicht-parametrischen Student's t-Test.

Ergebnisse

Wir erzeugten Brustkrebs-Zelllinien (MDA-MB-231, MCF-7 und MDA-MB-468), die GFP- und Luciferase-Vektoren exprimieren. Konkret wurde dies durch eine sequentielle Infektion erreicht. Zuerst wurden die Brustkrebszelllinien mit einem Lentivirus-Vektor infiziert, der fluoreszierendes GFP exprimierte. Die GFP-positiven Zellen (GFP⁺) wurden 2 Tage nach der Infektion sortiert (Abbildung 1A,B) und mit dem pLX304 Luciferase-V5-Vektor infiziert. Dann wurde Blasticidin verwen...

Diskussion

Tierversuche sind für die Krebsforschung^{obligatorisch 7,8,9}, und in der Tat wurden viele Protokolle entwickelt 3,6,10,11,12,13,14. Die meisten dieser Studien bestimmten die biologische Wirkung jedo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL eppendorf tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 µL tips	Lifegene	LRT10
1000 µL tips	Lifegene	LRT1000
15 mL tubes	Lifegene	LTB15-500
200 µL tips	Lifegene	LRT200
6 well cell culture plate	COSTAR	3516
96 well Plates BLACK flat bottom	Bar Naor	BN30496
Automated Cell Counters	Thermofisher	A50298
BD FACSAria III sorter	BD
BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'')	BD	302200
BD Plastipak Syringes 1 mL x 120	BD	303172
Corning 100 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430167
Corning 150 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430599
Countess cell counting chamber slides	Thermofisher	C10228
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine	Biological Industries	01-055-1A
Eclipse 80i microscope	Nikon
eppendorf Centrifuge 5810 R	Sigma Aldrich	EP5820740000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	04-127-1A
FUW GFP			Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
HEK293T			Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
Isoflurane, USP Terrell	Piramal	NDC 66794-01-25
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
L-Glutamine Solution	Biological industries	03-020-1A
Living Image Software	PerkinElmer		bioluminescence measurement
MCF-7	ATCC	ATCC HTB-22
MDA-MB-231	ATCC	ATCC HTB-26
MDA-MB-468	ATCC	ATCC HTB-132
Pasteur pipettes	NORMAX	2430-475
PBS	Hylabs	BP655/500D
pCMV-dR8.2-dvpr	Addgene	#8455	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
pCMV-VSV-G	Addgene	#8454	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
Petri dish 90 mm (90x15)	MINI PLAST	820-090-01-017
Pipettes 10ml	Lifegene	LG-GSP010010S
Pipettes 25ml	Lifegene	LG-GSP010050S
Pipettes 5ml	Lifegene	LG-GSP010005S
pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid	Addgene	#98580
Polybrene	Sigma Aldrich	#107689
Prism 9	GraphPad
Reagent Reservoirs	Bar Naor	BN20621STR200TC
SMZ18 Stereo microscopes	Nikon
Sodium Chloride	Bio-Lab	190359400
Syringe filters	Lifegene	LG-FPV403030S
Trypan Blue 0.5% solution	Biological industries	03-102-1B
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries	03-052-1a
Vacuum driven Filters	SOFRA LIFE SCIENCE	SPE-22-500
Virusolve		disinfectant
VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade	Promega	P1043
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent	Sigma Aldrich	#6366236001