Monitoramento do crescimento do câncer de mama e formação de colônia metastática em camundongos usando bioluminescência

Resumo

Aqui, descrevemos um método de monitoramento não invasivo envolvendo expressão de luciferase e proteína fluorescente verde em várias linhas de células cancerígenas de mama. Este protocolo fornece uma técnica para monitorar a formação de tumores e a colonização metastática em tempo real em camundongos.

Resumo

O câncer de mama é uma malignidade heterogênea frequente e a segunda principal causa de mortalidade em mulheres, principalmente devido à metástase de órgãos distantes. Vários modelos animais foram gerados, incluindo os modelos de camundongos ortotópicos amplamente utilizados, onde células cancerígenas são injetadas na almofada de gordura mamária. No entanto, esses modelos não podem ajudar a monitorar cinética de crescimento tumoral e colonização metastática. Ferramentas de ponta para monitorar células cancerígenas em tempo real em camundongos avançarão significativamente na compreensão da biologia tumoral.

Aqui, foram estabelecidas linhas de células cancerígenas de mama expressando a luciferase e a proteína fluorescente verde (GFP). Especificamente, esta técnica contém duas etapas sequenciais iniciadas pela medição da atividade luciferase in vitro e seguida pela implantação das células cancerosas em almofadas de gordura mamária de camundongos de imunodeficiência combinada (NOD-SCID) de nonobese. Após a injeção, tanto o crescimento do tumor quanto a colonização metastática são monitorados em tempo real pelo sistema de imagem de bioluminescência não invasiva. Em seguida, a quantificação das metástases expressas por GFP nos pulmões será examinada por microscopia de fluorescência para validar os resultados de bioluminescência observados. Este sofisticado sistema que combina ferramentas de detecção baseadas em luciferase e fluorescência avalia a metástase do câncer in vivo, que tem grande potencial para uso em terapêutica do câncer de mama e manejo de doenças.

Introdução

Os cânceres de mama são tipos frequentes de câncer em todo o mundo, com aproximadamente 250.000 novos casos diagnosticados a cada ano nos Estados Unidos¹. Apesar de sua alta incidência, um novo conjunto de medicamentos anticancerígenos melhorou significativamente os resultados de pacientes com câncer^{de mama 2}. No entanto, esses tratamentos ainda são inadequados, pois muitos pacientes experimentam recaída da doença e propagação metastática para órgãos vitais², que é a principal causa de morbidade e mortalidade do paciente. Portanto, um dos principais desafios na pesquisa sobre câncer de mama é iden....

Protocolo

Todos os experimentos com camundongos foram realizados sob o protocolo MD-21-16429-5, aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso da Universidade Hebraica. Além disso, a Universidade Hebraica é certificada pela Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados Com Animais Laboratoriais (AAALAC).

1. Manutenção da linha celular

NOTA: As linhas de células cancerígenas de mama humanas (MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231) foram utilizadas neste protocolo.

1. Cultura todas as linhas de células cancerígenas de mama no meio de Águia modificada (DMEM) modificada de Dulbecco, suplementada com 10% de soro bovino....

Resultados

Geramos linhas celulares de câncer de mama (MDA-MB-231, MCF-7 e MDA-MB-468) expressando vetores GFP e luciferase. Especificamente, isso foi conseguido por uma infecção sequencial. Primeiro, as linhas de células cancerígenas de mama foram infectadas com um vetor de lentivírus expressando GFP fluorescente. As células GFP-positive (GFP⁺) foram classificadas 2 dias após a infecção (Figura 1A,B) e infectadas com o vetor pLX304 Luciferase-V5. Em seguida, blast.......

Discussão

Experimentos em animais são obrigatórios para a pesquisa sobre câncer ^7,8,9, e de fato muitos protocolos foram desenvolvidos ^{3,6,10,11,12,13,14}. No entanto, a maioria desses estudos determinou o .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL eppendorf tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 µL tips	Lifegene	LRT10
1000 µL tips	Lifegene	LRT1000
15 mL tubes	Lifegene	LTB15-500
200 µL tips	Lifegene	LRT200
6 well cell culture plate	COSTAR	3516
96 well Plates BLACK flat bottom	Bar Naor	BN30496
Automated Cell Counters	Thermofisher	A50298
BD FACSAria III sorter	BD
BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'')	BD	302200
BD Plastipak Syringes 1 mL x 120	BD	303172
Corning 100 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430167
Corning 150 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430599
Countess cell counting chamber slides	Thermofisher	C10228
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine	Biological Industries	01-055-1A
Eclipse 80i microscope	Nikon
eppendorf Centrifuge 5810 R	Sigma Aldrich	EP5820740000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	04-127-1A
FUW GFP			Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
HEK293T			Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
Isoflurane, USP Terrell	Piramal	NDC 66794-01-25
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
L-Glutamine Solution	Biological industries	03-020-1A
Living Image Software	PerkinElmer		bioluminescence measurement
MCF-7	ATCC	ATCC HTB-22
MDA-MB-231	ATCC	ATCC HTB-26
MDA-MB-468	ATCC	ATCC HTB-132
Pasteur pipettes	NORMAX	2430-475
PBS	Hylabs	BP655/500D
pCMV-dR8.2-dvpr	Addgene	#8455	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
pCMV-VSV-G	Addgene	#8454	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
Petri dish 90 mm (90x15)	MINI PLAST	820-090-01-017
Pipettes 10ml	Lifegene	LG-GSP010010S
Pipettes 25ml	Lifegene	LG-GSP010050S
Pipettes 5ml	Lifegene	LG-GSP010005S
pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid	Addgene	#98580
Polybrene	Sigma Aldrich	#107689
Prism 9	GraphPad
Reagent Reservoirs	Bar Naor	BN20621STR200TC
SMZ18 Stereo microscopes	Nikon
Sodium Chloride	Bio-Lab	190359400
Syringe filters	Lifegene	LG-FPV403030S
Trypan Blue 0.5% solution	Biological industries	03-102-1B
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries	03-052-1a
Vacuum driven Filters	SOFRA LIFE SCIENCE	SPE-22-500
Virusolve		disinfectant
VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade	Promega	P1043
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent	Sigma Aldrich	#6366236001