Monitoramento do crescimento do câncer de mama e formação de colônia metastática em camundongos usando bioluminescência

Resumo

Aqui, descrevemos um método de monitoramento não invasivo envolvendo expressão de luciferase e proteína fluorescente verde em várias linhas de células cancerígenas de mama. Este protocolo fornece uma técnica para monitorar a formação de tumores e a colonização metastática em tempo real em camundongos.

Resumo

O câncer de mama é uma malignidade heterogênea frequente e a segunda principal causa de mortalidade em mulheres, principalmente devido à metástase de órgãos distantes. Vários modelos animais foram gerados, incluindo os modelos de camundongos ortotópicos amplamente utilizados, onde células cancerígenas são injetadas na almofada de gordura mamária. No entanto, esses modelos não podem ajudar a monitorar cinética de crescimento tumoral e colonização metastática. Ferramentas de ponta para monitorar células cancerígenas em tempo real em camundongos avançarão significativamente na compreensão da biologia tumoral.

Aqui, foram estabelecidas linhas de células cancerígenas de mama expressando a luciferase e a proteína fluorescente verde (GFP). Especificamente, esta técnica contém duas etapas sequenciais iniciadas pela medição da atividade luciferase in vitro e seguida pela implantação das células cancerosas em almofadas de gordura mamária de camundongos de imunodeficiência combinada (NOD-SCID) de nonobese. Após a injeção, tanto o crescimento do tumor quanto a colonização metastática são monitorados em tempo real pelo sistema de imagem de bioluminescência não invasiva. Em seguida, a quantificação das metástases expressas por GFP nos pulmões será examinada por microscopia de fluorescência para validar os resultados de bioluminescência observados. Este sofisticado sistema que combina ferramentas de detecção baseadas em luciferase e fluorescência avalia a metástase do câncer in vivo, que tem grande potencial para uso em terapêutica do câncer de mama e manejo de doenças.

Introdução

Os cânceres de mama são tipos frequentes de câncer em todo o mundo, com aproximadamente 250.000 novos casos diagnosticados a cada ano nos Estados Unidos¹. Apesar de sua alta incidência, um novo conjunto de medicamentos anticancerígenos melhorou significativamente os resultados de pacientes com câncer^{de mama 2}. No entanto, esses tratamentos ainda são inadequados, pois muitos pacientes experimentam recaída da doença e propagação metastática para órgãos vitais², que é a principal causa de morbidade e mortalidade do paciente. Portanto, um dos principais desafios na pesquisa sobre câncer de mama é identificar os mecanismos moleculares que regulam a formação de metástases distais para desenvolver novos meios para inibir seu desenvolvimento.

A metástase do câncer é um processo dinâmico no qual as células se desprendem do tumor primário e invadem tecidos vizinhos através da circulação sanguínea. Assim, modelos animais em que as células sofrem uma cascata metastática semelhante podem facilitar a identificação dos mecanismos que regem esse processo ^3,4. Além disso, esses modelos in vivo são essenciais para o desenvolvimento de agentes terapêuticos de câncer de mama ^5,6. No entanto, esses modelos ortotópicos não podem indicar a cinética real do crescimento do tumor, pois o efeito só é determinado após o término. Por isso, estabelecemos uma ferramenta baseada em luciferase para detectar o desenvolvimento de tumores e a colonização metastática em tempo real. Além disso, essas células expressam GFP para detectar as colônias metastáticas. Esta abordagem é relativamente simples e não envolve nenhum procedimento invasivo³. Assim, combinar a detecção de luciferase e fluorescência é uma estratégia útil para avançar nos estudos pré-clínicos de terapêutica do câncer de mama e manejo de doenças.

Protocolo

Todos os experimentos com camundongos foram realizados sob o protocolo MD-21-16429-5, aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso da Universidade Hebraica. Além disso, a Universidade Hebraica é certificada pela Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados Com Animais Laboratoriais (AAALAC).

1. Manutenção da linha celular

NOTA: As linhas de células cancerígenas de mama humanas (MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231) foram utilizadas neste protocolo.

1. Cultura todas as linhas de células cancerígenas de mama no meio de Águia modificada (DMEM) modificada de Dulbecco, suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina a 37 °C em uma incubadora de dióxido de carbono umidificado (5% CO₂).
   NOTA: Verifique regularmente a densidade celular; dividir e expandir para uso futuro quando atingir 70% de confluência.

2. Preparação de vírus

1. Trate as células HEK293T com 1 mL de trippsina até que se desprendem.
2. Adicione 10 mL de DMEM (10% FBS) para neutralizar a atividade de trippsina e transfira a suspensão celular para um novo tubo de centrífugas de 15 mL.
3. Centrífuga a 150 × g por 5 min para sedimentar as células. Descarte o supernatante após a centrifugação e adicione 1 mL de meio DMEM fresco.
4. Determine a concentração celular e a semente 1,2 × 10⁶ células/poço em uma placa de seis poços.
5. No dia seguinte, pré-aquecimento todos os reagentes necessários, incluindo reagente de transfecção, DMEM sem soro, plasmídeo envelope plasmídeo (VSV-G), plasmídeo de embalagem de lentivírus (ΔVPR) e plágio de explosão pLX304 Luciferase-V5 ou plasmídeo FUW GFP.
6. Em um tubo de centrífuga autoclaved de 1,5 mL, misture 50 μL de DMEM sem soro com 0,3 μg de plasmídeo VSV-G, 1 μg de ΔVPR e 1,2 μg de pLX304 Luciferase-V5 plasmid ou plasmídeo fuw gfp.
7. Depois de misturar bem esses plasmídeos com o meio, adicione 5 μL do reagente de transfecção, misture suavemente e incubar a mistura em temperatura ambiente por 15 minutos.
8. Após a incubação, adicione a mistura dropwise às células HEK293T.
9. Após 24h, substitua o meio de crescimento por 2 mL de (30% FBS) DMEM. No dia seguinte (48 h pós-transfecção), colhe o meio contendo os vírus ("pLX304 Luciferase-V5 ou os vírus FUW GFP").
   NOTA: O uso de 30% de FBS aumenta a eficiência de produção do vírus.
10. Para evitar quaisquer resíduos de células HEK293T, passe o meio contendo vírus através de um filtro de seringa de 0,45 μm ou centrífuga a 150 × g por 5 min, e colete o supernatante.
    NOTA: Para armazenamento a longo prazo, mantenha as alíquotas de trabalho do vírus a -80 °C.

3. Estabelecer células expressando stably GFP e luciferase ("Células GFP ⁺ Luc⁺ ")

1. Um dia antes de infectar as células, a semente 8 × 10⁵ células por poço em uma placa de seis poços.
2. Após a incubação durante a noite, substitua o meio de crescimento por meio fresco contendo 8 μg/mL de polibrene. Adicione 200 μL de vírus FUW GFP dropwise às células.
3. Opcional: Para aumentar a eficiência do vírus, centrifugar a placa a 560 × g por 30 min (37 °C) (infecção por giro).
4. Incubar as células por 48 h e verificar a expressão GFP por microscopia de fluorescência.
5. Classifique as células expressas por GFP por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) (GFP⁺) (Figura 1A).
6. Infecte as células classificadas por GFP com os vírus da explosão pLX304 Luciferase-V5, conforme descrito na etapa 3.2.
7. Trate as células com blasticidina (10 μg/mL) 30 h pós-infecção para enriquecer para células de expressão de explosão pLX304 Luciferase-V5 (células GFP⁺, Luc⁺ ). Em seguida, a cada dois dias, substitua por meio fresco contendo blasticidina. Além disso, como controle, trate células ingênuas com o mesmo meio contendo blasticidina.
   NOTA: Uma clara diferença entre as células infectadas e de controle deve ser observada após alguns dias de tratamento com blasticidina. Este efeito é dependente de linha celular e geralmente leva ~8-10 dias. Uma baixa taxa de sobrevivência indicará um baixo rendimento de produção viral. Se assim for, produzir um novo lote de vírus, pois a baixa eficiência pode afetar experimentos futuros.

4. Validação da atividade de luciferase in vitro

1. Cresça as células MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231 GFP⁺ Luc⁺ em uma placa de 15 cm a 80% de confluência. Colher as células por trippsinização, conforme descrito nas etapas 2.1-2.2.
2. Semente um número crescente de células em cada poço (0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 × 10⁴) em uma placa preta de 96 poços.
   NOTA: As placas pretas de 96 poços são mais adequadas para medir os níveis de luciferase, pois placas brancas ou transparentes produzirão sinais de autoluminescência. Como controle, use salina tamponada com fosfato (PBS) sozinha em um poço para garantir que não haja autoluminescência da PBS.
3. Encha todos os poços com 100 μL de DMEM e incubar por 16-24 h.
4. Prepare a solução de luciferina em PBS a uma concentração de 1,5 mg/mL a partir do estoque de 30 mg/mL. Aliquot o estoque da solução de luciferina e armazene a -20 °C.
5. Lave as células uma vez com PBS suavemente, adicione 100 μL de solução de luciferina em cada poço e espere por 2 min. Por fim, meça a atividade da luciferase em todas as células cancerígenas de mama utilizando bioluminescência.
   NOTA: Examinar a expressão in vitro de GFP e luciferase antes de experimentos em animais é crucial. Além disso, poços em branco são usados para subtrair o fundo.

5. Injetando camundongos com células GFP⁺ Luc⁺

1. Transferir 5 × 10⁶ (MCF-7 e MDA-MB-468) ou 2 × 10⁶ (MDA-MB-231) células GFP⁺ Luc⁺ em 200 μL ou 100 μL PBS, respectivamente.
2. Antes da injeção, limpe a capa biológica estéril com 5% de solução desinfetante (veja a Tabela de Materiais). Em seguida, anestesia os camundongos com ar filtrado (0,2 μm) contendo 4% de isoflurane a uma taxa de fluxo de ar de 1 L/min por 2-3 min.
   NOTA: É essencial confirmar a anestesia adequada; beliscar o dedo do mouse e procurar qualquer resposta.
3. Coloque um cone sobre a cabeça do rato anestesiado em uma posição supina. Aplique pomada veterinária aos olhos para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia.
4. Limpe a área abdominal do rato, acima da glândula mamária, com etanol usando um cotonete e levante a^4ª glândula mamária com fórceps.
5. Insira a agulha 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) sob a almofada de gordura e injete lentamente 100 μL da suspensão celular.
   NOTA: Uma protuberância redonda aparecerá sob a pele. Além disso, uma injeção inadequada pode levar a desvio na taxa de crescimento do tumor ou ausência de tumor no mesmo grupo experimental.
6. Após o procedimento de injeção, tire os ratos do capô e transfira-os para uma nova gaiola. Monitore os ratos até que eles retornem à consciência.
   NOTA: Certifique-se de que todas as agulhas e seringas usadas sejam descartadas na caixa afiada.

6. Medir os níveis de luciferase em camundongos GFP⁺ Luc⁺

1. Antes da detecção da bioluminescência, contenha o rato consciente segurando seu pescoço com a mão esquerda. Em seguida, incline a mão para a esquerda, resultando na face do rato para cima com a parte inferior do corpo em uma posição supina.
2. Injete 100 μL de luciferina (30 mg/mL) intraperitoneally (i.p.) na superfície abdominal do camundongo no quadrante abdominal inferior esquerdo usando uma seringa de 1,0 mL com tamanho de agulha 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm).
   NOTA: A ponta da agulha não deve ser inserida a mais de 3-5 mm da parede abdominal, pois pode penetrar órgãos viscerais. Além disso, recomenda-se realizar injeção i.p. sem anestesia, pois a distribuição de luciferina no corpo de camundongos anestesiados é mais lenta do que em camundongos conscientes. Assim, monitorar os níveis de luciferase em camundongos conscientes é um procedimento mais rápido.
3. Mantenha o rato por 7 minutos sem anestesia seguido por 3 minutos dentro da câmara de anestesia antes de medir a cinética tumoral.
   NOTA: O tempo de incubação varia entre os diferentes experimentos, linhas celulares e espécies para espécies. Assim, recomenda-se calibrar o tempo de incubação antes de iniciar os experimentos.
4. Anestesiar os camundongos conforme descrito nas etapas 5.2-5.3.
5. Abra o software (Tabela de Materiais) durante a incubação, inicialize o sistema de imagem e clique no botão Initialize .
   NOTA: Esteja ciente de que a câmera levará ~10 min para esfriar e atingir -90 °C. Além disso, como controle de fundo, meça os níveis de luciferase em camundongos ingênuos (ou seja, camundongos GFP⁺ injetados com células que não expressam o gene da luciferase).
6. Mantenha a configuração em exposição automática usando as seguintes configurações: tempo de exposição auto, 60 s; Binning Medium, F/Stop 1; Filtro de excitação bloqueado; Filtro de emissão aberto. Quando a inicialização terminar, selecione | do assistente de imagem Bioluminescência e clique em Next | | de filtro aberto selecionar Mouse no assunto imagem.
7. Em Field View, selecione o estágio C (10 cm) e a Altura do Assunto: 1,50 cm.
8. Clique em Configuração de imagem Estágio para C e antes de clicar no botão Adquirir , certifique-se de que o mouse seja colocado no palco na posição supina adequada.
9. Feche a porta, clique no botão Adquirir e aguarde que uma imagem apareça na tela.
   NOTA: Com a opção Auto-Exposição , um sinal forte leva de 5 a 20 s dependendo do sinal; um sinal fraco levará em torno de 60 s.
10. Repita este passo para os outros ratos.
11. Para detectar a metástase pulmonar, cubra o forte sinal do tumor primário usando papel de papelão preto espesso e exponha apenas o lado ventral dos pulmões em direção à câmera. Capture a imagem usando os mesmos parâmetros descritos acima.

7. Aquisição de imagem ex vivo usando bioluminescência e fluorescência

1. Eutanize os camundongos usando inalação de dióxido de carbono (CO₂) no desiccador e disseque os camundongos usando tesouras autoclavadas e fórceps.
2. Perfunda os camundongos usando 0,9% de soro fisiológico, colhe os órgãos e enxágue com 1x PBS para eliminar manchas de sangue do órgão.
3. Transfira o órgão enxaguado para uma placa de Petri e coloque-o no estágio da máquina de bioluminescência. Aplique a mesma configuração de bioluminescência descrita nas etapas 6.2-6.6.
   NOTA: Devido à diminuição do sinal de luciferase, esta etapa é limitante. Assim, após eutanásia de camundongos, visualize imediatamente o órgão por bioluminescência.
4. Para imagens GFP, aplique a mesma configuração descrita na etapa 6.3, usando filtro GFP de Fluorescência em vez de Bioluminescência.
5. Tire imagens pulmonares usando um microscópio estéreo para examinar a presença de colônias GFP⁺ .

8. Análise de dados de bioluminescência

1. Clique duas vezes no software e selecione Abrir no menu Arquivo .
2. Abra todos os arquivos e minimize-os. Certifique-se de que todas as unidades são Radiance (Fótons). Além disso, clique em Aplicar a Todos para manter os mesmos parâmetros para todas as imagens.
3. No menu Exibir , selecione a Paleta de ferramentas, que abrirá uma nova janela.
4. Na janela Paleta de ferramentas , selecione a guia Ferramentas do ROI e, em Tipo, escolha o ROI Bkg médio.
5. A partir das ferramentas do ROI, selecione Circle e desenhe um pequeno círculo na área torácica do mouse.
6. Clique duas vezes no círculo, selecione o Usar como BKG para futura opção ROIs na guia ROI de fundo e clique em Fazer.

9. Medir o fluxo total

1. Na janela Paleta de ferramentas , selecione a guia Ferramentas do ROI e digite, escolha a medição do ROI.
2. A partir das ferramentas do ROI, selecione Circle e desenhe um grande círculo sobre o tumor primário do mouse.
3. Clique com o botão direito do mouse no ROI e clique com o botão direito do mouse no ROI de cada arquivo individual de cada mouse.
4. Clique em Medir ROIs da guia FERRAMENTAS ROI , que abrirá uma nova janela chamada ROI Measurements. A partir desta guia, mantenha os Tipos de Medição como Radiance (Fótons) e Atributos de Imagem como Todos os Valores Povoados.
5. Exporte o arquivo como arquivo de medição (*.txt) ou formato Csv (*.csv).
6. Abra os dados exportados em uma planilha e pegue o Fluxo Total (p/s) e os valores para as semanas.
   NOTA: Esta etapa pode ser usada para medir diferentes grupos. Por exemplo, camundongos tratados com um veículo versus aqueles tratados com uma droga.
7. Gere um plot XY, onde o Tempo é apresentado ao longo do eixo X e fluxo total (p/s) ao longo do eixo Y. Para cada semana, pegue o parâmetro Total Flux (p/s) para cada grupo amostral e determine quaisquer diferenças significativas usando o teste t do Aluno não paramétrico.

Resultados

Geramos linhas celulares de câncer de mama (MDA-MB-231, MCF-7 e MDA-MB-468) expressando vetores GFP e luciferase. Especificamente, isso foi conseguido por uma infecção sequencial. Primeiro, as linhas de células cancerígenas de mama foram infectadas com um vetor de lentivírus expressando GFP fluorescente. As células GFP-positive (GFP⁺) foram classificadas 2 dias após a infecção (Figura 1A,B) e infectadas com o vetor pLX304 Luciferase-V5. Em seguida, blast...

Discussão

Experimentos em animais são obrigatórios para a pesquisa sobre câncer ^7,8,9, e de fato muitos protocolos foram desenvolvidos ^{3,6,10,11,12,13,14}. No entanto, a maioria desses estudos determinou o ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL eppendorf tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 µL tips	Lifegene	LRT10
1000 µL tips	Lifegene	LRT1000
15 mL tubes	Lifegene	LTB15-500
200 µL tips	Lifegene	LRT200
6 well cell culture plate	COSTAR	3516
96 well Plates BLACK flat bottom	Bar Naor	BN30496
Automated Cell Counters	Thermofisher	A50298
BD FACSAria III sorter	BD
BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'')	BD	302200
BD Plastipak Syringes 1 mL x 120	BD	303172
Corning 100 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430167
Corning 150 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430599
Countess cell counting chamber slides	Thermofisher	C10228
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine	Biological Industries	01-055-1A
Eclipse 80i microscope	Nikon
eppendorf Centrifuge 5810 R	Sigma Aldrich	EP5820740000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	04-127-1A
FUW GFP			Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
HEK293T			Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
Isoflurane, USP Terrell	Piramal	NDC 66794-01-25
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
L-Glutamine Solution	Biological industries	03-020-1A
Living Image Software	PerkinElmer		bioluminescence measurement
MCF-7	ATCC	ATCC HTB-22
MDA-MB-231	ATCC	ATCC HTB-26
MDA-MB-468	ATCC	ATCC HTB-132
Pasteur pipettes	NORMAX	2430-475
PBS	Hylabs	BP655/500D
pCMV-dR8.2-dvpr	Addgene	#8455	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
pCMV-VSV-G	Addgene	#8454	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
Petri dish 90 mm (90x15)	MINI PLAST	820-090-01-017
Pipettes 10ml	Lifegene	LG-GSP010010S
Pipettes 25ml	Lifegene	LG-GSP010050S
Pipettes 5ml	Lifegene	LG-GSP010005S
pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid	Addgene	#98580
Polybrene	Sigma Aldrich	#107689
Prism 9	GraphPad
Reagent Reservoirs	Bar Naor	BN20621STR200TC
SMZ18 Stereo microscopes	Nikon
Sodium Chloride	Bio-Lab	190359400
Syringe filters	Lifegene	LG-FPV403030S
Trypan Blue 0.5% solution	Biological industries	03-102-1B
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries	03-052-1a
Vacuum driven Filters	SOFRA LIFE SCIENCE	SPE-22-500
Virusolve		disinfectant
VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade	Promega	P1043
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent	Sigma Aldrich	#6366236001