ניטור צמיחת סרטן השד והיווצרות מושבה גרורתית בעכברים באמצעות Bioluminescence

Summary

כאן אנו מתארים שיטת ניטור לא פולשנית הכוללת לוציפראז וביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק בקווים שונים של תאי סרטן השד. פרוטוקול זה מספק טכניקה לניטור היווצרות גידולים והתיישבות גרורתית בזמן אמת בעכברים.

Abstract

סרטן השד הוא ממאירות הטרוגנית תכופה והגורם השני המוביל לתמותה אצל נשים, בעיקר עקב גרורות איברים מרוחקות. מספר מודלים של בעלי חיים נוצרו, כולל מודלים של עכברים אורתוטופיים הנמצאים בשימוש נרחב, שבהם מוזרקים תאים סרטניים לתוך כרית השומן של החלב. עם זאת, מודלים אלה אינם יכולים לסייע במעקב אחר קינטיקה של גדילת גידולים והתיישבות גרורתית. כלים חדשניים לניטור תאים סרטניים בזמן אמת בעכברים יקדמו באופן משמעותי את ההבנה של הביולוגיה של הגידול.

כאן נוצרו קווי תאי סרטן השד המבטאים ביציבות לוציפראז וחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). באופן ספציפי, טכניקה זו מכילה שני שלבים רציפים היזומים על ידי מדידת פעילות הלוציפראז במבחנה ולאחר מכן השתלת התאים הסרטניים לתוך כריות שומן יונקים של עכברי כשל חיסוני משולב (NOD-SCID) שאינם סוכרתיים חמורים. לאחר ההזרקה, הן צמיחת הגידול והן ההתיישבות הגרורתית מנוטרות בזמן אמת על ידי מערכת ההדמיה הביו-לומינסנציה הלא פולשנית. לאחר מכן, הכימות של גרורות המבטאות GFP בריאות ייבדק על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לאמת את תוצאות הביולומינסנציה שנצפו. מערכת מתוחכמת זו המשלבת לוציפראז וכלי גילוי מבוססי פלואורסצנציה מעריכה גרורות סרטניות in vivo, שיש לה פוטנציאל גדול לשימוש בטיפולים בסרטן השד ובניהול מחלות.

Introduction

סרטן השד הוא סוגים שכיחים של סרטן ברחבי העולם, עם כ -250,000 מקרים חדשים מאובחנים מדי שנה בארצות הברית¹. למרות ההיארעות הגבוהה שלה, קבוצה חדשה של תרופות נגד סרטן שיפרה באופן משמעותי את התוצאות של חולות סרטן השד². עם זאת, טיפולים אלה עדיין אינם מספיקים, שכן חולים רבים חווים הישנות מחלות והתפשטות גרורתית לאיברים חיוניים², שהיא הגורם העיקרי לתחלואה ולתמותה של המטופלים. לכן, אחד האתגרים המרכזיים בחקר סרטן השד הוא זיהוי המנגנונים המולקולריים המווסתים את היווצרותן של גרורות דיסטליות כדי לפתח אמצעים חדשים לעיכוב התפתחותן.

גרורות סרטניות הן תהליך דינמי שבו תאים מתנתקים מהגידול הראשוני ופולשים לרקמות שכנות דרך זרימת הדם. לפיכך, מודלים של בעלי חיים שבהם התאים עוברים מפל גרורתי דומה יכולים להקל על זיהוי המנגנונים השולטים בתהליך זה ^3,4. בנוסף, מודלים אלה של in vivo חיוניים לפיתוח חומרים טיפוליים לסרטן השד ^5,6. עם זאת, מודלים אורתוטופיים אלה אינם יכולים להצביע על קינטיקה של גדילת הגידול בפועל מכיוון שההשפעה נקבעת רק עם סיום הלימודים. לכן, הקמנו כלי מבוסס לוציפראז כדי לזהות התפתחות גידולים והתיישבות גרורתית בזמן אמת. בנוסף, תאים אלה מבטאים GFP כדי לזהות את המושבות הגרורות. גישה זו היא פשוטה יחסית ואינה כרוכה בהליכים פולשניים³. לפיכך, שילוב של לוציפראז וזיהוי פלואורסצנציה הוא אסטרטגיה מועילה לקידום המחקרים הפרה-קליניים של טיפולים בסרטן השד וניהול מחלות.

Protocol

כל הניסויים בעכברים בוצעו במסגרת הפרוטוקול המוסדי לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה העברית MD-21-16429-5. בנוסף, האוניברסיטה העברית מוסמכת על ידי האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה (AAALAC).

1. תחזוקת קו סלולרי

הערה: קווי תאי סרטן השד האנושיים (MCF-7, MDA-MB-468 ו- MDA-MB-231) שימשו בפרוטוקול זה.

1. תרבית את כל קווי תאי סרטן השד במדיום הנשר המהונדס של דולבקו (DMEM), בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין ב-37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו-חמצני לחה (5% CO₂).
   הערה: בדוק את צפיפות התא באופן קבוע; להתפצל ולהתרחב לשימוש עתידי כאשר הם מגיעים למפגש של 70%.

2. הכנת וירוסים

1. טפלו בתאי HEK293T עם 1 מ"ל של טריפסין עד שהם מתנתקים.
2. הוסף 10 מ"ל של DMEM (10% FBS) כדי לנטרל את פעילות הטריפסין, ולהעביר את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל.
3. צנטריפוגה ב 150 × גרם במשך 5 דקות כדי לשקוע את התאים. יש להשליך את ה-supernatant לאחר הצנטריפוגה ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום DMEM טרי.
4. קבעו את ריכוז התאים והזרעים 1.2 × 10⁶ תאים/באר בצלחת של שש בארות.
5. ביום שלמחרת, יש לחמם מראש את כל הריאגנטים הדרושים, כולל מגיב טרנספקציה, DMEM ללא סרום, פלסמיד מעטפת (VSV-G), פלסמיד אריזת לנטי-וירוס (ΔVPR) ופלסמיד פיצוץ pLX304 לוציפראז-V5 או פלסמיד פיצוץ FUW GFP.
6. בצינור צנטריפוגה אוטוקלאב של 1.5 מ"ל, יש לערבב 50 μL של DMEM ללא סרום עם 0.3 מיקרוגרם של פלסמיד VSV-G, 1 מיקרוגרם של ΔVPR ו-1.2 מיקרוגרם של פלסמיד פיצוץ pLX304 לוציפראז-V5 או פלסמיד FUW GFP.
7. לאחר ערבוב יסודי של פלסמידים אלה עם המדיום, מוסיפים 5 μL של מגיב הטרנספקציה, מערבבים בעדינות, ומדגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
8. לאחר הדגירה, מוסיפים את התערובת באופן טיפתי לתאי HEK293T.
9. לאחר 24 שעות, החלף את מדיום הצמיחה ב-2 מ"ל של (30% FBS) DMEM. למחרת (48 שעות לאחר הטרנספקציה), לקצור את המדיום המכיל את הנגיפים ("pLX304 לוציפראז-V5 או וירוסי FUW GFP").
   הערה: השימוש ב-30% FBS משפר את יעילות ייצור הנגיף.
10. כדי להימנע משאריות תאי HEK293T, העבירו את המדיום המכיל את הנגיף דרך מסנן או צנטריפוגה של מזרק 0.45 מיקרומטר ב-150 × גרם למשך 5 דקות, ואספו את ה-supernatant.
    הערה: לאחסון לטווח ארוך, שמור את המזונות העובדים של הנגיף בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

3. יצירת תאים המבטאים ביציבות GFP ולוציפראז ("תאי GFP ⁺ Luc⁺ ")

1. יום לפני ההדבקה של התאים, זרע 8 × 10⁵ תאים לבאר בצלחת של שש בארות.
2. לאחר דגירה לילית, החליפו את מדיום הגדילה במדיום טרי המכיל 8 מיקרוגרם/מ"ל של פוליברן. הוסף 200 μL של וירוסי FUW GFP באופן טיפתי לתאים.
3. אופציונלי: כדי לשפר את יעילות הנגיף, צנטריפוגה על הצלחת ב-560 × גרם למשך 30 דקות (37 מעלות צלזיוס) (זיהום ספין).
4. דגירה של התאים למשך 48 שעות, ואמת את ביטוי ה-GFP על-ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
5. מיין את התאים המבטאים GFP על-ידי מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנציה (FACS) (GFP⁺) (איור 1A).
6. הדביקו את התאים הממוינים ב-GFP בנגיפי הפיצוץ pLX304 Luciferase-V5 כמתואר בשלב 3.2.
7. טפלו בתאים עם בלסטיקידין (10 מיקרוגרם/מ"ל) 30 שעות לאחר ההדבקה כדי להעשיר עבור תאים מבטאי פיצוץ pLX304 לוציפראז-V5 (GFP⁺, תאי Luc⁺ ). לאחר מכן, כל יומיים, החליפו עם מדיום טרי המכיל בלסטיקידין. בנוסף, כבקרה, טפלו בתאים נאיביים עם אותו מדיום המכיל בלסטיקידין.
   הערה: יש להבחין בהבדל ברור בין תאי הביקורת הנגועים לתאי הביקורת לאחר מספר ימים של טיפול בבלסטיקידין. השפעה זו תלוית קו תאים ונמשכת בדרך כלל כ-8-10 ימים. שיעור הישרדות ירוד יצביע על תפוקת ייצור נגיפית נמוכה. אם כן, לייצר קבוצה חדשה של וירוסים מכיוון שיעילות נמוכה עשויה להשפיע על ניסויים עתידיים.

4. אימות פעילות במבחנה לוציפראז

1. הגדל את תאי MCF-7, MDA-MB-468 ו-MDA-MB-231 GFP⁺ Luc⁺ בצלחת של 15 ס"מ עד 80% מפגש. קציר את התאים על ידי טריפסיניזציה, כמתואר בשלבים 2.1-2.2.
2. זרעו מספר גדל והולך של תאים בכל באר (0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 × 10⁴) לתוך צלחת שחורה של 96 בארות.
   הערה: לוחות שחורים בני 96 בארות מתאימים יותר למדידת רמות לוציפראז מכיוון שלוחות לבנים או שקופים ייצרו אותות אוטולומינסנציה. כבקרה, השתמשו במלחים עם מאגר פוספט (PBS) בלבד בבאר אחת כדי להבטיח שאין אוטולומינסנציה מ-PBS.
3. מלאו את כל הבארות ב-100 μL של DMEM ודגרו במשך 16-24 שעות.
4. הכינו תמיסת לוציפרין ב-PBS בריכוז של 1.5 מ"ג/מ"ל מהמלאי של 30 מ"ג/מ"ל. Aliquot את המלאי של תמיסת לוציפרין ולאחסן ב -20 °C (76 °F).
5. לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS בעדינות, להוסיף 100 μL של תמיסת לוציפרין לתוך כל באר, ולחכות 2 דקות. לבסוף, מדוד את פעילות הלוציפראז בכל תאי סרטן השד באמצעות ביולומינסנציה.
   הערה: בחינת GFP במבחנה וביטוי לוציפראז לפני ניסויים בבעלי חיים היא חיונית. בנוסף, בארות ריקות משמשות לחיסור הרקע.

5. הזרקת עכברים עם תאי GFP⁺ Luc⁺

1. העברה של 5 × 10⁶ (MCF-7 ו- MDA-MB-468) או 2 × 10⁶ (MDA-MB-231) תאי GFP⁺ Luc⁺ לתוך 200 μL או 100 μL PBS, בהתאמה.
2. לפני ההזרקה, נקו את מכסה המנוע הביולוגי הסטרילי עם תמיסת חיטוי של 5% (ראו טבלת החומרים). לאחר מכן, הרימו את העכברים עם אוויר מסונן (0.2 מיקרומטר) המכיל 4% איזופלורן בקצב זרימת אוויר של 1 ליטר לדקה למשך 2-3 דקות.
   הערה: חיוני לאשר הרדמה נכונה; צבוט את בוהן העכבר וחפש כל תגובה.
3. הניחו חרוט על ראש העכבר המרומם בתנוחת שכיבה. יש למרוח משחה וטרינרית על עיניה כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
4. נגבו את אזור הבטן של העכבר, מעל בלוטת החלב, עם אתנול באמצעות צמר גפן והרימו את בלוטת החלב^{הרביעית} עם מלקחיים.
5. הכנס את המחט 27 G x 3/4 (0.4 x 19 מ"מ) מתחת למשטח השומן והזריק לאט 100 μL של מתלה התא.
   הערה: בליטה עגולה תופיע מתחת לעור. בנוסף, זריקה לא נכונה עלולה להוביל לסטייה בקצב הגדילה של הגידול או להיעדר גידול באותה קבוצת ניסוי.
6. לאחר הליך ההזרקה, מוציאים את העכברים ממכסה המנוע ומעבירים אותם לכלוב חדש. עקוב אחר העכברים עד שהם חוזרים להכרה.
   הערה: ודא שכל המחטים והמזרקים המשומשים מושלכים לתיבת החדות.

6. מדידת רמות הלוציפראז בעכברי GFP⁺ Luc⁺

1. לפני זיהוי הביו-לומינסנציה, לרסן את העכבר המודע על ידי החזקת צווארו ביד שמאל. לאחר מכן, הטה את היד שמאלה, וכתוצאה מכך פני העכבר כלפי מעלה עם פלג הגוף התחתון בתנוחת שכיבה.
2. הזריקו 100 μL של לוציפרין (30 מ"ג/מ"ל) באופן תוך-צפקי (כלומר) למשטח הבטן של העכבר ברביע הבטן השמאלי התחתון באמצעות מזרק 1.0 מ"ל עם גודל מחט 27 G x 3/4 (0.4 x 19 מ"מ).
   הערה: אין להחדיר את קצה המחט יותר מ-3-5 מ"מ מדופן הבטן, שכן היא עלולה לחדור לאיברים הקרביים. בנוסף, מומלץ לבצע הזרקת i.p. ללא הרדמה שכן התפלגות לוציפרין בגוף של עכברים מורדמים איטית יותר מאשר בעכברים מודעים. לפיכך, ניטור רמות לוציפראז בעכברים מודעים הוא הליך מהיר יותר.
3. שמור את העכבר במשך 7 דקות ללא הרדמה ואחריו 3 דקות בתוך תא ההרדמה לפני מדידת הקינטיקה של הגידול.
   הערה: זמן הדגירה משתנה בין הניסויים השונים, קווי התאים ומינים למינים. לכן, מומלץ לכייל את זמן הדגירה לפני תחילת הניסויים.
4. הרדמה את העכברים כמתואר בשלבים 5.2-5.3.
5. פתח את התוכנה (טבלת חומרים) במהלך הדגירה, אתחל את מערכת ההדמיה ולחץ על לחצן אתחול .
   הערה: שים לב שהמצלמה תיקח ~ 10 דקות להתקרר ולהגיע ל - 90 מעלות צלזיוס. בנוסף, כבקרת רקע, מדוד את רמות הלוציפראז בעכברים נאיביים (כלומר, עכברי GFP⁺ שהוזרקו להם תאים שאינם מבטאים את הגן לוציפראז).
6. שמור על ההגדרה בחשיפה אוטומטית באמצעות ההגדרות הבאות: זמן חשיפה אוטומטי, 60 שניות; בנינג מדיום, F/תחנה 1; מסנן עירור חסום; מסנן פליטה פתוח. כאשר האתחול מסתיים, בחר אשף ההדמיה | Bioluminescence ולאחר מכן לחץ על הבא | פתח את | המסנן בחר עכבר בנושא התמונה.
7. בתצוגת שדה, בחר שלב C (10 ס"מ) וגובה נושא: 1.50 ס"מ.
8. לחץ על שלב הגדרת התמונה ל - C, ולפני לחיצה על לחצן רכישה , ודא שהעכבר ממוקם על הבמה במצב שכיבה תקין.
9. סגור את הדלת, לחץ על לחצן רכוש והמתן עד שתופיע תמונה על המסך.
   הערה: עם אפשרות החשיפה האוטומטית , אות חזק לוקח 5-20 שניות בהתאם לאות; אות חלש ייקח בערך 60 שניות.
10. חזור על שלב זה עבור העכברים האחרים.
11. כדי לזהות גרורות בריאות, יש לכסות את האות החזק של הגידול הראשוני באמצעות נייר קרטון שחור עבה ולחשוף רק את הצד הגחוני של הריאות לכיוון המצלמה. צלם את התמונה באמצעות אותם פרמטרים שתוארו לעיל.

7. רכישת תמונת ex vivo באמצעות ביולומינסנציה ופלואורסצנציה

1. המתים את העכברים באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני (CO₂) במייבש הייבוש ונתחו את העכברים באמצעות מספריים ומלקחיים אוטו-קלוביים.
2. מחדירים את העכברים באמצעות 0.9% מלח, קוצרים את האיברים ושוטפים עם 1x PBS כדי למנוע כתמי דם מהאיבר.
3. מעבירים את האיבר השטופ לצלחת פטרי ומכניסים אותו לשלב של מכונת הביולומינסנציה. החל את אותה הגדרת ביולומינסנציה כמתואר בשלבים 6.2-6.6.
   הערה: בשל הירידה באות לוציפראז, שלב זה מגביל את הזמן. לכן, לאחר המתת עכברים, מיד לדמיין את האיבר על ידי bioluminescence.
4. עבור תמונות GFP, החל את אותה הגדרה כמתואר בשלב 6.3, באמצעות מסנן GFP פלואורסצנטי במקום Bioluminescence.
5. צלם תמונות ריאה באמצעות מיקרוסקופ סטריאו כדי לבחון את נוכחותן של מושבות GFP⁺ .

8. ניתוח נתוני ביולומינסנציה

1. לחץ פעמיים על התוכנה ובחר פתח מתפריט קובץ .
2. פתח את כל הקבצים ומזער אותם. ודא שכל היחידות הן זוהר (פוטונים). בנוסף, לחץ על החל על הכל כדי לשמור על אותם פרמטרים עבור כל התמונות.
3. מתפריט תצוגה , בחר את לוח הכלים, אשר יפתח חלון חדש.
4. מחלון לוח הכלים , בחר את הכרטיסיה כלי ROI ובסוג, בחר את ההחזר על ההשקעה הממוצעת של BKG.
5. מתוך כלי ההחזר על ההשקעה, בחר עיגול וצייר עיגול קטן על אזור בית החזה של העכבר.
6. לחץ פעמיים על העיגול, בחר באפשרות השתמש כ- BKG עבור ROIs עתידיים מהכרטיסיה החזר על ההשקעה ברקע ולחץ על סיום.

9. מדידת השטף הכולל

1. מהחלון לוח כלים , בחר את הכרטיסיה כלי ROI וב - Type, בחר את מדידת ההחזר על ההשקעה.
2. מתוך כלי ההחזר על ההשקעה, בחר עיגול וצייר עיגול גדול על הגידול הראשוני של העכבר.
3. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני העתק ROI ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הדבקת החזר ההשקעה בכל קובץ בודד של כל עכבר.
4. לחץ על מדידת ROIs מהכרטיסייה ROI Tools, אשר תפתח חלון חדש בשם ROI Measurements. מכרטיסיה זו, שמור את סוגי המדידות כ-Radiance (פוטונים) ואת תכונות התמונה ככול הערכים המאוכלסים.
5. ייצא את הקובץ כתבנית קובץ מדידות (*.txt) או Csv (*.csv).
6. פתח את הנתונים המיוצאים בגיליון אלקטרוני וקח את ה - Total Flux (p/s) ואת הערכים במשך השבועות.
   הערה: ניתן להשתמש בשלב זה למדידת קבוצות שונות. לדוגמה, עכברים שטופלו ברכב לעומת אלה שטופלו בתרופה.
7. צור עלילת XY, שבה הזמן מוצג לאורך ציר ה-X והשטף הכולל (p/s) לאורך ציר ה-Y. עבור כל שבוע, קח את הפרמטר Total Flux (p/s) עבור כל קבוצת מדגם וקבע את כל ההבדלים המשמעותיים באמצעות מבחן ה- t של התלמיד שאינו פרמטרי.

תוצאות

יצרנו קווי תאים של סרטן השד (MDA-MB-231, MCF-7 ו-MDA-MB-468) המבטאים וקטורים של GFP ולוציפראז. באופן ספציפי, זה הושג על ידי זיהום רציף. ראשית, קווי תאי סרטן השד היו נגועים בווקטור לנטי-וירוס המבטא GFP פלואורסצנטי. התאים החיוביים ל-GFP (GFP⁺) מוינו יומיים לאחר ההדבקה (איור 1A,B) ונדבק?...

Discussion

ניסויים בבעלי חיים הם חובה לחקר הסרטן ^7,8,9, ואכן פותחו פרוטוקולים רבים ^{3,6,10,11,12,13,14}. עם זאת, רוב המחקרים הללו קבעו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL eppendorf tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 µL tips	Lifegene	LRT10
1000 µL tips	Lifegene	LRT1000
15 mL tubes	Lifegene	LTB15-500
200 µL tips	Lifegene	LRT200
6 well cell culture plate	COSTAR	3516
96 well Plates BLACK flat bottom	Bar Naor	BN30496
Automated Cell Counters	Thermofisher	A50298
BD FACSAria III sorter	BD
BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'')	BD	302200
BD Plastipak Syringes 1 mL x 120	BD	303172
Corning 100 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430167
Corning 150 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430599
Countess cell counting chamber slides	Thermofisher	C10228
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine	Biological Industries	01-055-1A
Eclipse 80i microscope	Nikon
eppendorf Centrifuge 5810 R	Sigma Aldrich	EP5820740000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	04-127-1A
FUW GFP			Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
HEK293T			Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
Isoflurane, USP Terrell	Piramal	NDC 66794-01-25
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
L-Glutamine Solution	Biological industries	03-020-1A
Living Image Software	PerkinElmer		bioluminescence measurement
MCF-7	ATCC	ATCC HTB-22
MDA-MB-231	ATCC	ATCC HTB-26
MDA-MB-468	ATCC	ATCC HTB-132
Pasteur pipettes	NORMAX	2430-475
PBS	Hylabs	BP655/500D
pCMV-dR8.2-dvpr	Addgene	#8455	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
pCMV-VSV-G	Addgene	#8454	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
Petri dish 90 mm (90x15)	MINI PLAST	820-090-01-017
Pipettes 10ml	Lifegene	LG-GSP010010S
Pipettes 25ml	Lifegene	LG-GSP010050S
Pipettes 5ml	Lifegene	LG-GSP010005S
pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid	Addgene	#98580
Polybrene	Sigma Aldrich	#107689
Prism 9	GraphPad
Reagent Reservoirs	Bar Naor	BN20621STR200TC
SMZ18 Stereo microscopes	Nikon
Sodium Chloride	Bio-Lab	190359400
Syringe filters	Lifegene	LG-FPV403030S
Trypan Blue 0.5% solution	Biological industries	03-102-1B
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries	03-052-1a
Vacuum driven Filters	SOFRA LIFE SCIENCE	SPE-22-500
Virusolve		disinfectant
VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade	Promega	P1043
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent	Sigma Aldrich	#6366236001