Monitoreo del crecimiento del cáncer de mama y la formación de colonias metastásicas en ratones utilizando bioluminiscencia

Resumen

Aquí, describimos un método de monitoreo no invasivo que involucra la expresión de luciferasa y proteína fluorescente verde en varias líneas celulares de cáncer de mama. Este protocolo proporciona una técnica para monitorizar la formación tumoral y la colonización metastásica en tiempo real en ratones.

Resumen

El cáncer de mama es una neoplasia maligna heterogénea frecuente y la segunda causa de mortalidad en las mujeres, principalmente debido a la metástasis de órganos a distancia. Se han generado varios modelos animales, incluidos los modelos de ratón ortotópicos ampliamente utilizados, donde se inyectan células cancerosas en la almohadilla de grasa mamaria. Sin embargo, estos modelos no pueden ayudar a monitorear la cinética de crecimiento tumoral y la colonización metastásica. Las herramientas de vanguardia para monitorear las células cancerosas en tiempo real en ratones avanzarán significativamente en la comprensión de la biología del tumor.

Aquí, se establecieron líneas celulares de cáncer de mama que expresan de manera estable luciferasa y proteína fluorescente verde (GFP). Específicamente, esta técnica contiene dos pasos secuenciales iniciados por la medición de la actividad de la luciferasa in vitro y seguidos por la implantación de las células cancerosas en almohadillas de grasa mamaria de ratones de inmunodeficiencia combinada (NOD-SCID) diabéticos-graves no obesos. Después de la inyección, tanto el crecimiento del tumor como la colonización metastásica son monitoreados en tiempo real por el sistema de imágenes de bioluminiscencia no invasiva. Luego, la cuantificación de las metástasis que expresan GFP en los pulmones se examinará mediante microscopía de fluorescencia para validar los resultados de bioluminiscencia observados. Este sofisticado sistema que combina luciferasa y herramientas de detección basadas en fluorescencia evalúa la metástasis del cáncer in vivo, que tiene un gran potencial para su uso en la terapéutica del cáncer de mama y el manejo de enfermedades.

Introducción

Los cánceres de mama son tipos frecuentes de cáncer en todo el mundo, con aproximadamente 250,000 nuevos casos diagnosticados cada año en los Estados Unidos¹. A pesar de su alta incidencia, un nuevo conjunto de medicamentos contra el cáncer ha mejorado significativamente los resultados de las pacientes con cáncer de mama². Sin embargo, estos tratamientos siguen siendo inadecuados, ya que muchos pacientes experimentan recaída de la enfermedad y diseminación metastásica a órganos vitales², que es la causa principal de morbilidad y mortalidad del paciente. Por lo tanto, uno de los principales desafíos en la investigación del cáncer de mama es identificar los mecanismos moleculares que regulan la formación de metástasis distales para desarrollar nuevos medios para inhibir su desarrollo.

La metástasis del cáncer es un proceso dinámico en el que las células se desprenden del tumor primario e invaden los tejidos vecinos a través de la circulación sanguínea. Así, los modelos animales en los que las células sufren una cascada metastásica similar pueden facilitar la identificación de los mecanismos que rigen este proceso ^3,4. Además, estos modelos in vivo son esenciales para el desarrollo de agentes terapéuticos contra el cáncer de mama ^5,6. Sin embargo, estos modelos ortotópicos no pueden indicar la cinética real del crecimiento tumoral, ya que el efecto solo se determina al finalizar. Por lo tanto, establecimos una herramienta basada en luciferasa para detectar el desarrollo tumoral y la colonización metastásica en tiempo real. Además, estas células expresan GFP para detectar las colonias metastásicas. Este enfoque es relativamente simple y no implica ningún procedimiento invasivo³. Por lo tanto, la combinación de la luciferasa y la detección de fluorescencia es una estrategia útil para avanzar en los estudios preclínicos de la terapéutica del cáncer de mama y el manejo de la enfermedad.

Protocolo

Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo bajo el protocolo MD-21-16429-5 aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Hebrea. Además, la Universidad Hebrea está certificada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC).

1. Mantenimiento de la línea celular

NOTA: Las líneas celulares de cáncer de mama humano (MCF-7, MDA-MB-468 y MDA-MB-231) se utilizaron en este protocolo.

1. Cultive todas las líneas celulares de cáncer de mama en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% y penicilina-estreptomicina al 37 °C en una incubadora de dióxido de carbono humidificado (5% CO₂).
   NOTA: Compruebe la densidad celular con regularidad; dividir y expandir para uso futuro cuando alcancen el 70% de confluencia.

2. Preparación del virus

1. Trate las células HEK293T con 1 ml de tripsina hasta que se desprendan.
2. Agregue 10 ml de DMEM (10% FBS) para neutralizar la actividad de tripsina y transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo centrífugo de 15 ml.
3. Centrifugar a 150 × g durante 5 min para sedimentar las células. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación y agregue 1 ml de medio DMEM fresco.
4. Determine la concentración celular y la semilla 1.2 × 10⁶ células / pozo en una placa de seis pocillos.
5. Al día siguiente, precalentar todos los reactivos necesarios, incluido el reactivo de transfección, el DMEM sin suero, el plásmido de la envoltura (VSV-G), el plásmido de empaque de lentivirus (ΔVPR) y el plásmido blástico pLX304 Luciferase-V5 o el plásmido FUW GFP.
6. En un tubo centrífugo en autoclave de 1,5 ml, mezcle 50 μL de DMEM sin suero con 0,3 μg de plásmido VSV-G, 1 μg de ΔVPR y 1,2 μg de plásmido blásico pLX304 Luciferasa-V5 o plásmido FUW GFP.
7. Después de mezclar bien estos plásmidos con el medio, agregue 5 μL del reactivo de transfección, mezcle suavemente e incube la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min.
8. Después de la incubación, agregue la mezcla gota a gota a las células HEK293T.
9. Después de 24 h, reemplace el medio de crecimiento con 2 ml de (30% FBS) DMEM. Al día siguiente (48 h después de la transfección), recolecte el medio que contiene los virus ("pLX304 Luciferase-V5 o los virus FUW GFP").
   NOTA: El uso de 30% de FBS mejora la eficiencia de producción de virus.
10. Para evitar cualquier residuo de células HEK293T, pase el medio que contiene el virus a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm o centrífuga a 150 × g durante 5 min, y recoja el sobrenadante.
    NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo, mantenga las alícuotas de trabajo del virus a -80 °C.

3. Establecimiento de células que expresen de manera estable GFP y luciferasa ("^células GFP ⁺ Luc+")

1. El día antes de infectar las células, sembra 8 × 10⁵ células por pozo en una placa de seis pocillos.
2. Después de la incubación durante la noche, reemplace el medio de crecimiento con un medio fresco que contenga 8 μg / ml de polibreno. Agregue 200 μL de virus FUW GFP gota a gota a las células.
3. Opcional: Para mejorar la eficiencia del virus, centrífuga la placa a 560 × g durante 30 min (37 °C) (infección por espín).
4. Incubar las células durante 48 h, y verificar la expresión de GFP por microscopía de fluorescencia.
5. Clasificar las células que expresan GFP por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (GFP⁺) (Figura 1A).
6. Infectar las células clasificadas por GFP con los virus blastocitos pLX304 Luciferasa-V5 como se describe en el paso 3.2.
7. Tratar las células con blasticidina (10 μg/mL) 30 h después de la infección para enriquecer las células que expresan blastos de luciferasa-V5 pLX304 (células GFP⁺, Luc⁺ ). Luego, cada dos días, reemplace con un medio fresco que contenga blasticidina. Además, como control, trate las células naïve con el mismo medio que contiene blasticidina.
   NOTA: Se debe observar una clara diferencia entre las células infectadas y las células de control después de unos días de tratamiento con blasticidina. Este efecto depende de la línea celular y generalmente toma ~ 8-10 días. Una tasa de supervivencia pobre indicará un bajo rendimiento de producción viral. Si es así, produzca un nuevo lote de virus, ya que la baja eficiencia puede afectar a futuros experimentos.

4. Validación de la actividad de la luciferasa in vitro

1. Cultive las células MCF-7, MDA-MB-468 y MDA-MB-231 GFP⁺ Luc⁺ en una placa de 15 cm con una confluencia del 80%. Cosechar las células por tripsinización, como se describe en los pasos 2.1-2.2.
2. Sembra un número creciente de células en cada pozo (0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 × 10⁴) en una placa negra de 96 pocillos.
   NOTA: Las placas negras de 96 pocillos son más adecuadas para medir los niveles de luciferasa, ya que las placas blancas o transparentes producirán señales de autoluminiscencia. Como control, use solución salina tamponada con fosfato (PBS) sola en un pozo para asegurarse de que no haya autoluminiscencia de PBS.
3. Llene todos los pozos con 100 μL de DMEM e incube durante 16-24 h.
4. Preparar la solución de luciferina en PBS a una concentración de 1,5 mg/ml a partir del caldo de 30 mg/ml. Alícuota el caldo de solución de luciferina y guárdelo a -20 °C.
5. Lave las células una vez con PBS suavemente, agregue 100 μL de solución de luciferina en cada pocillo y espere 2 min. Finalmente, mida la actividad de la luciferasa en todas las células de cáncer de mama utilizando bioluminiscencia.
   NOTA: Examinar la expresión in vitro de GFP y luciferasa antes de los experimentos con animales es crucial. Además, se utilizan pozos en blanco para restar el fondo.

5. Inyectar ratones con células GFP⁺ Luc⁺

1. Transfiera 5 × 10⁶ (MCF-7 y MDA-MB-468) o 2 × 10⁶ (MDA-MB-231) células GFP⁺ Luc⁺ a 200 μL o 100 μL PBS, respectivamente.
2. Antes de la inyección, limpie la campana biológica estéril con una solución desinfectante al 5% (consulte la Tabla de materiales). Luego, anestesiar a los ratones con aire filtrado (0,2 μm) que contenga 4% de isoflurano a una velocidad de flujo de aire de 1 L / min durante 2-3 min.
   NOTA: Es esencial confirmar la anestesia adecuada; pellizque el dedo del pie del ratón y busque cualquier respuesta.
3. Coloque un cono sobre la cabeza del ratón anestesiada en posición supina. Aplique ungüento veterinario en sus ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
4. Limpie el área abdominal del ratón, por encima de la glándula mamaria, con etanol usando un hisopo de algodón y levante la^4ª glándula mamaria con fórceps.
5. Inserte la aguja 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) debajo de la almohadilla de grasa e inyecte lentamente 100 μL de la suspensión celular.
   NOTA: Aparecerá una protuberancia redonda debajo de la piel. Además, una inyección inadecuada puede conducir a una desviación en la tasa de crecimiento del tumor o a la ausencia de tumor en el mismo grupo experimental.
6. Después del procedimiento de inyección, saque a los ratones de la capucha y transfiéralos a una nueva jaula. Monitorea a los ratones hasta que vuelvan a la conciencia.
   NOTA: Asegúrese de que todas las agujas y jeringas usadas se desechen en la caja de objetos punzantes.

6. Medición de los niveles de luciferasa en ratones GFP⁺ Luc⁺

1. Antes de la detección de bioluminiscencia, sujete al ratón consciente sosteniendo su cuello con la mano izquierda. Luego, incline la mano hacia la izquierda, lo que resulta en la cara del ratón hacia arriba con la parte inferior del cuerpo en posición supina.
2. Inyecte 100 μL de luciferina (30 mg/ml) por vía intraperitoneal (i.p.) en la superficie abdominal del ratón en el cuadrante abdominal inferior izquierdo con una jeringa de 1,0 ml con aguja de tamaño 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm).
   NOTA: La punta de la aguja no debe insertarse a más de 3-5 mm de la pared abdominal, ya que podría penetrar en los órganos viscerales. Además, se recomienda realizar la inyección i.p. sin anestesia, ya que la distribución de luciferina en el cuerpo de ratones anestesiados es más lenta que en ratones conscientes. Por lo tanto, el monitoreo de los niveles de luciferasa en ratones conscientes es un procedimiento más rápido.
3. Mantenga al ratón durante 7 minutos sin anestesia seguido de 3 minutos dentro de la cámara de anestesia antes de medir la cinética del tumor.
   NOTA: El tiempo de incubación varía entre los diferentes experimentos, líneas celulares y de una especie a otra. Por lo tanto, se recomienda calibrar el tiempo de incubación antes de comenzar los experimentos.
4. Anestesiar a los ratones como se describe en los pasos 5.2-5.3.
5. Abra el software (Tabla de materiales) durante la incubación, inicialice el sistema de imágenes y haga clic en el botón Inicializar .
   NOTA: Tenga en cuenta que la cámara tardará ~ 10 minutos en enfriarse y alcanzar los -90 ° C. Además, como control de fondo, mida los niveles de luciferasa en ratones ingenuos (es decir, ratones GFP ⁺ inyectados con células que no expresan el gen de la luciferasa).
6. Mantenga la configuración en exposición automática utilizando los siguientes ajustes: tiempo de exposición automático, 60 s; Medio de binificación, F/Stop 1; Filtro de excitación bloqueado; Filtro de emisión abierto. Cuando finalice la inicialización , seleccione Asistente para imágenes | Bioluminiscencia y, a continuación, haga clic en Siguiente | Abrir | de filtro seleccione Ratón en el asunto de la imagen.
7. En la vista de campo, seleccione la etapa C (10 cm) y la altura del sujeto: 1,50 cm.
8. Haga clic en Etapa de configuración de imagen en C y, antes de hacer clic en el botón Adquirir , asegúrese de que el mouse esté colocado en el escenario en la posición supina adecuada.
9. Cierre la puerta, haga clic en el botón Adquirir y espere a que aparezca una imagen en la pantalla.
   NOTA: Con la opción de exposición automática, una señal fuerte tarda de 5 a 20 s dependiendo de la señal; una señal débil tardará alrededor de 60 s.
10. Repita este paso para los otros ratones.
11. Para detectar metástasis pulmonares, cubra la señal fuerte del tumor primario con papel de cartón negro grueso y exponga solo el lado ventral de los pulmones hacia la cámara. Capture la imagen utilizando los mismos parámetros descritos anteriormente.

7. Adquisición de imagen ex vivo mediante bioluminiscencia y fluorescencia

1. Sacrificar a los ratones usando la inhalación de dióxido de carbono (CO₂) en el desecador y diseccionar a los ratones usando tijeras y fórceps en autoclave.
2. Perfundir a los ratones usando solución salina al 0.9%, cosechar los órganos y enjuagar con 1x PBS para eliminar las manchas de sangre del órgano.
3. Transfiera el órgano enjuagado a una placa de Petri y colóquelo en la etapa de la máquina de bioluminiscencia. Aplique el mismo ajuste de bioluminiscencia que se describe en los pasos 6.2-6.6.
   NOTA: Debido a la disminución de la señal de luciferasa, este paso limita el tiempo. Por lo tanto, después de la eutanasia de ratones, visualice inmediatamente el órgano por bioluminiscencia.
4. Para las imágenes GFP, aplique la misma configuración que se describe en el paso 6.3, utilizando el filtro GFP de fluorescencia en lugar de Bioluminiscencia.
5. Tome imágenes pulmonares con un microscopio estereoscópico para examinar la presencia de colonias de GFP⁺ .

8. Análisis de datos de bioluminiscencia

1. Haga doble clic en el software y seleccione Abrir en el menú Archivo .
2. Abra todos los archivos y minimícelos. Asegúrese de que todas las unidades sean Radiancia (Fotones).. Además, haga clic en Aplicar a todos para mantener los mismos parámetros para todas las imágenes.
3. En el menú Ver , seleccione la Paleta de herramientas, que abrirá una nueva ventana.
4. En la ventana Paleta de herramientas , seleccione la pestaña Herramientas de ROI y, en Tipo, elija el ROI promedio de Bkg.
5. En las herramientas de ROI, seleccione Círculo y dibuje un círculo pequeño en el área torácica del mouse.
6. Haga doble clic en el círculo, seleccione la opción Usar como BKG para futuros ROI en la pestaña ROI en segundo plano y haga clic en Listo.

9. Medición del flujo total

1. En la ventana Paleta de herramientas , seleccione la pestaña Herramientas de ROI y, en Tipo, elija La medición del ROI.
2. En las herramientas de ROI, seleccione Círculo y dibuje un círculo grande en el tumor primario del ratón.
3. Haga clic con el botón derecho en Copiar ROI y haga clic con el botón derecho en Pegar ROI en cada archivo individual de cada mouse.
4. Haga clic en Medir ROI en la pestaña Herramientas de ROI , que abrirá una nueva ventana denominada Mediciones de ROI. En esta pestaña, mantenga los tipos de medición como radiancia (fotones) y los atributos de imagen como todos los valores rellenados.
5. Exporte el archivo como formato de archivo de medidas (*.txt) o Csv (*.csv).
6. Abra los datos exportados en una hoja de cálculo y tome el flujo total (p / s) y los valores de las semanas.
   NOTA: Este paso se puede utilizar para medir diferentes grupos. Por ejemplo, los ratones tratados con un vehículo frente a los tratados con un medicamento.
7. Genere una gráfica XY, donde el Tiempo se presenta a lo largo del eje X y el Flujo Total (p/s) a lo largo del eje Y. Para cada semana, tome el parámetro flujo total (p / s) para cada grupo de muestra y determine cualquier diferencia significativa utilizando la prueba t de Student no paramétrica.

Resultados

Generamos líneas celulares de cáncer de mama (MDA-MB-231, MCF-7 y MDA-MB-468) que expresan vectores de GFP y luciferasa. Específicamente, esto se logró mediante una infección secuencial. Primero, las líneas celulares de cáncer de mama se infectaron con un vector de lentivirus que expresa GFP fluorescente. Las células GFP-positivas (GFP⁺) se clasificaron 2 días después de la infección (Figura 1A, B) y se infectaron con el vector pLX304 Luciferasa-V5. Lue...

Discusión

Los experimentos con animales son obligatorios para la investigación del cáncer ^7,8,9, y de hecho se han desarrollado muchos protocolos ^{3,6,10,11,12,13,14}. Sin embargo, la mayoría de estos estudi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL eppendorf tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 µL tips	Lifegene	LRT10
1000 µL tips	Lifegene	LRT1000
15 mL tubes	Lifegene	LTB15-500
200 µL tips	Lifegene	LRT200
6 well cell culture plate	COSTAR	3516
96 well Plates BLACK flat bottom	Bar Naor	BN30496
Automated Cell Counters	Thermofisher	A50298
BD FACSAria III sorter	BD
BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'')	BD	302200
BD Plastipak Syringes 1 mL x 120	BD	303172
Corning 100 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430167
Corning 150 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430599
Countess cell counting chamber slides	Thermofisher	C10228
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine	Biological Industries	01-055-1A
Eclipse 80i microscope	Nikon
eppendorf Centrifuge 5810 R	Sigma Aldrich	EP5820740000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	04-127-1A
FUW GFP			Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
HEK293T			Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
Isoflurane, USP Terrell	Piramal	NDC 66794-01-25
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
L-Glutamine Solution	Biological industries	03-020-1A
Living Image Software	PerkinElmer		bioluminescence measurement
MCF-7	ATCC	ATCC HTB-22
MDA-MB-231	ATCC	ATCC HTB-26
MDA-MB-468	ATCC	ATCC HTB-132
Pasteur pipettes	NORMAX	2430-475
PBS	Hylabs	BP655/500D
pCMV-dR8.2-dvpr	Addgene	#8455	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
pCMV-VSV-G	Addgene	#8454	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
Petri dish 90 mm (90x15)	MINI PLAST	820-090-01-017
Pipettes 10ml	Lifegene	LG-GSP010010S
Pipettes 25ml	Lifegene	LG-GSP010050S
Pipettes 5ml	Lifegene	LG-GSP010005S
pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid	Addgene	#98580
Polybrene	Sigma Aldrich	#107689
Prism 9	GraphPad
Reagent Reservoirs	Bar Naor	BN20621STR200TC
SMZ18 Stereo microscopes	Nikon
Sodium Chloride	Bio-Lab	190359400
Syringe filters	Lifegene	LG-FPV403030S
Trypan Blue 0.5% solution	Biological industries	03-102-1B
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries	03-052-1a
Vacuum driven Filters	SOFRA LIFE SCIENCE	SPE-22-500
Virusolve		disinfectant
VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade	Promega	P1043
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent	Sigma Aldrich	#6366236001