Monitoraggio della crescita del cancro al seno e della formazione di colonie metastatiche nei topi utilizzando la bioluminescenza

Riepilogo

Qui, descriviamo un metodo di monitoraggio non invasivo che coinvolge la luciferasi e l'espressione di proteine fluorescenti verdi in varie linee cellulari di cancro al seno. Questo protocollo fornisce una tecnica per monitorare la formazione del tumore e la colonizzazione metastatica in tempo reale nei topi.

Abstract

Il cancro al seno è una frequente neoplasia eterogenea e la seconda causa di mortalità nelle donne, principalmente a causa di metastasi di organi a distanza. Sono stati generati diversi modelli animali, tra cui i modelli murini ortotopici ampiamente utilizzati, in cui le cellule tumorali vengono iniettate nel cuscinetto di grasso mammario. Tuttavia, questi modelli non possono aiutare a monitorare la cinetica di crescita del tumore e la colonizzazione metastatica. Strumenti all'avanguardia per monitorare le cellule tumorali in tempo reale nei topi faranno progredire significativamente la comprensione della biologia tumorale.

Qui sono state stabilite linee cellulari di cancro al seno che esprimono stabilmente luciferasi e proteina fluorescente verde (GFP). In particolare, questa tecnica contiene due passaggi sequenziali iniziati misurando l'attività della luciferasi in vitro e seguiti dall'impianto delle cellule tumorali in cuscinetti di grasso mammario di topi non obesi diabetici-gravi immunodeficienza combinata (NOD-SCID). Dopo l'iniezione, sia la crescita tumorale che la colonizzazione metastatica vengono monitorate in tempo reale dal sistema di imaging a bioluminescenza non invasivo. Quindi, la quantificazione delle metastasi che esprimono GFP nei polmoni sarà esaminata al microscopio a fluorescenza per convalidare i risultati di bioluminescenza osservati. Questo sofisticato sistema che combina luciferasi e strumenti di rilevamento basati sulla fluorescenza valuta le metastasi del cancro in vivo, che ha un grande potenziale per l'uso nelle terapie del cancro al seno e nella gestione della malattia.

Introduzione

I tumori al seno sono tipi frequenti di cancro in tutto il mondo, con circa 250.000 nuovi casi diagnosticati ogni anno negli Stati Uniti¹. Nonostante la sua alta incidenza, una nuova serie di farmaci antitumorali ha migliorato significativamente gli esiti delle pazienti con cancro al seno². Tuttavia, questi trattamenti sono ancora inadeguati, poiché molti pazienti sperimentano una recidiva della malattia e una diffusione metastatica agli organi vitali², che è la causa principale della morbilità e della mortalità del paziente. Pertanto, una delle principali sfide nella ricerca sul cancro al seno è identificare i meccanismi molecolari che regolano la formazione di metastasi distali per sviluppare nuovi mezzi per inibire il loro sviluppo.

Le metastasi del cancro sono un processo dinamico in cui le cellule si staccano dal tumore primario e invadono i tessuti vicini attraverso la circolazione sanguigna. Pertanto, i modelli animali in cui le cellule subiscono una cascata metastatica simile possono facilitare l'identificazione dei meccanismi che governano questo processo ^3,4. Inoltre, questi modelli in vivo sono essenziali per lo sviluppo di agenti terapeutici per il cancro al seno ^5,6. Tuttavia, questi modelli ortotopici non possono indicare l'effettiva cinetica di crescita del tumore in quanto l'effetto è determinato solo al termine. Pertanto, abbiamo istituito uno strumento basato sulla luciferasi per rilevare lo sviluppo del tumore e la colonizzazione metastatica in tempo reale. Inoltre, queste cellule esprimono GFP per rilevare le colonie metastatiche. Questo approccio è relativamente semplice e non comporta alcuna procedura invasiva³. Pertanto, la combinazione di luciferasi e rilevamento della fluorescenza è una strategia utile per far progredire gli studi preclinici sulle terapie del cancro al seno e sulla gestione della malattia.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati condotti nell'ambito del protocollo MD-21-16429-5 approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università Ebraica. Inoltre, l'Università Ebraica è certificata dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio (AAALAC).

1. Manutenzione della linea cellulare

NOTA: Le linee cellulari del cancro al seno umano (MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231) sono state utilizzate in questo protocollo.

1. Coltivare tutte le linee cellulari del cancro al seno nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina a 37 °C in un incubatore di anidride carbonica umidificata (5% CO₂).
   NOTA: Controllare regolarmente la densità cellulare; dividere ed espandere per un uso futuro quando raggiungono il 70% di confluenza.

2. Preparazione del virus

1. Trattare le cellule HEK293T con 1 mL di tripsina fino a quando non si staccano.
2. Aggiungere 10 ml di DMEM (10% FBS) per neutralizzare l'attività della tripsina e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo centrifugo da 15 mL.
3. Centrifugare a 150 × g per 5 minuti per sedimentare le cellule. Scartare il surnatante dopo la centrifugazione e aggiungere 1 mL di mezzo DMEM fresco.
4. Determinare la concentrazione cellulare e il seme 1,2 × 10⁶ cellule / pozzetto in una piastra a sei pozzetti.
5. Il giorno seguente, pre-riscaldamento tutti i reagenti necessari, tra cui reagente di trasfezione, DMEM privo di siero, plasmide dell'involucro (VSV-G), plasmide di imballaggio del lentivirus (ΔVPR) e plasmide esplosivo di pLX304 Luciferasi-V5 o plasmide GFP FUW.
6. In un tubo di centrifuga autoclavata da 1,5 mL, mescolare 50 μL di DMEM privo di siero con 0,3 μg di plasmide VSV-G, 1 μg di ΔVPR e 1,2 μg di plasmide blastizzato di pLX304 Luciferasi-V5 o plasmide FUW GFP.
7. Dopo aver miscelato accuratamente questi plasmidi con il mezzo, aggiungere 5 μL del reagente di trasfezione, mescolare delicatamente e incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti.
8. Dopo l'incubazione, aggiungere la miscela a goccia alle cellule HEK293T.
9. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo di crescita con 2 ml di DMEM (30% FBS). Il giorno seguente (48 ore dopo la trasfezione), raccogliere il mezzo contenente i virus ("pLX304 Luciferase-V5 o i virus FUW GFP").
   NOTA: l'uso del 30% di FBS migliora l'efficienza di produzione del virus.
10. Per evitare residui di cellule HEK293T, far passare il mezzo contenente virus attraverso un filtro a siringa da 0,45 μm o una centrifuga a 150 × g per 5 minuti e raccogliere il surnatante.
    NOTA: per la conservazione a lungo termine, mantenere le aliquote di lavoro del virus a -80 °C.

3. Stabilire cellule che esprimono stabilmente GFP e luciferasi (^"cellule GFP ⁺ Luc+")

1. Il giorno prima di infettare le cellule, seme 8 × 10⁵ cellule per pozzetto in una piastra a sei pozzetti.
2. Dopo l'incubazione notturna, sostituire il terreno di crescita con un mezzo fresco contenente 8 μg/mL di polibrene. Aggiungere 200 μL di virus FUW GFP a goccia alle cellule.
3. Opzionale: per migliorare l'efficienza del virus, centrifugare la piastra a 560 × g per 30 minuti (37 °C) (infezione da spin).
4. Incubare le cellule per 48 ore e verificare l'espressione della GFP mediante microscopia a fluorescenza.
5. Ordinare le cellule che esprimono GFP mediante lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) (GFP⁺) (Figura 1A).
6. Infettare le cellule selezionate GFP con i virus blasti pLX304 Luciferasi-V5 come descritto nel passaggio 3.2.
7. Trattare le cellule con blasticidina (10 μg/mL) 30 h post-infezione per arricchire le cellule che esprimono blasti pLX304 Luciferasi-V5 ^(cellule GFP⁺, Luc+). Quindi, ogni due giorni, sostituire con mezzo fresco contenente blasticidina. Inoltre, come controllo, trattare le cellule naïve con lo stesso mezzo contenente blasticidina.
   NOTA: Una chiara differenza tra le cellule infette e quelle di controllo deve essere osservata dopo alcuni giorni di trattamento con blasticidina. Questo effetto è dipendente dalla linea cellulare e di solito richiede ~ 8-10 giorni. Uno scarso tasso di sopravvivenza indicherà una bassa resa di produzione virale. In tal caso, produrre un nuovo lotto di virus in quanto la bassa efficienza potrebbe influire sugli esperimenti futuri.

4. Convalida dell'attività della luciferasi in vitro

1. Coltiva le celle MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231 GFP⁺ Luc⁺ in una piastra da 15 cm con una confluenza dell'80%. Raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione, come descritto nei passaggi 2.1-2.2.
2. Seminare un numero crescente di cellule in ogni pozzetto (0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 × 10⁴) in una piastra nera a 96 pozzetti.
   NOTA: le piastre nere a 96 pozzetti sono più adatte per misurare i livelli di luciferasi poiché le piastre bianche o trasparenti produrranno segnali di autoluminescenza. Come controllo, utilizzare la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) da sola in un unico pozzetto per garantire che non vi sia autoluminescenza da PBS.
3. Riempire tutti i pozzetti con 100 μL di DMEM e incubare per 16-24 ore.
4. Preparare la soluzione di luciferina in PBS ad una concentrazione di 1,5 mg/mL dallo stock di 30 mg/mL. Aliquotare lo stock di soluzione di luciferina e conservare a -20 °C.
5. Lavare delicatamente le cellule con PBS, aggiungere 100 μL di soluzione di luciferina in ciascun pozzetto e attendere 2 minuti. Infine, misurare l'attività della luciferasi in tutte le cellule del cancro al seno utilizzando la bioluminescenza.
   NOTA: L'esame in vitro dell'espressione di GFP e luciferasi prima degli esperimenti sugli animali è cruciale. Inoltre, i pozzetti vuoti vengono utilizzati per sottrarre lo sfondo.

5. Iniezione di topi con cellule GFP ⁺ Luc ⁺

1. Trasferire 5 × 10⁶ (MCF-7 e MDA-MB-468) o 2 × 10⁶ (MDA-MB-231) GFP⁺ Luc⁺ celle in 200 μL o 100 μL PBS, rispettivamente.
2. Prima dell'iniezione, pulire il cappuccio biologico sterile con una soluzione disinfettante al 5% (vedere la tabella dei materiali). Quindi, anestetizzare i topi con aria filtrata (0,2 μm) contenente il 4% di isoflurano ad una portata d'aria di 1 L / min per 2-3 min.
   NOTA: È essenziale confermare una corretta anestesia; pizzica la punta del mouse e cerca qualsiasi risposta.
3. Posizionare un cono sopra la testa del mouse anestetizzata in posizione supina. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
4. Pulire l'area addominale del topo, sopra la ghiandola mammaria, con etanolo usando un batuffolo di cotone e sollevare^{la 4a} ghiandola mammaria con una pinza.
5. Inserire l'ago 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) sotto il cuscinetto di grasso e iniettare lentamente 100 μL della sospensione cellulare.
   NOTA: un rigonfiamento rotondo apparirà sotto la pelle. Inoltre, un'iniezione impropria può portare a deviazione nel tasso di crescita del tumore o assenza di tumore nello stesso gruppo sperimentale.
6. Dopo la procedura di iniezione, estrarre i topi dal cappuccio e trasferirli in una nuova gabbia. Monitorare i topi fino a quando non ritornano alla coscienza.
   NOTA: Assicurarsi che tutti gli aghi e le siringhe utilizzati siano scartati nella scatola dei taglienti.

6. Misurazione dei livelli di luciferasi nei topi GFP⁺ Luc⁺

1. Prima del rilevamento della bioluminescenza, trattenere il topo cosciente tenendo il collo con la mano sinistra. Quindi, inclinare la mano a sinistra, con conseguente puntamento del mouse verso l'alto con la parte inferiore del corpo in posizione supina.
2. Iniettare 100 μL di luciferina (30 mg/mL) per via intraperitoneale (p.i.) nella superficie addominale del topo nel quadrante addominale inferiore sinistro utilizzando una siringa da 1,0 mL con ago di dimensioni 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm).
   NOTA: La punta dell'ago non deve essere inserita a più di 3-5 mm dalla parete addominale, in quanto potrebbe penetrare negli organi viscerali. Inoltre, si raccomanda di eseguire l'iniezione di i.p. senza anestesia poiché la distribuzione della luciferina nel corpo dei topi anestetizzati è più lenta rispetto ai topi coscienti. Pertanto, il monitoraggio dei livelli di luciferasi nei topi coscienti è una procedura più veloce.
3. Tenere il mouse per 7 minuti senza anestesia seguita da 3 minuti all'interno della camera di anestesia prima di misurare la cinetica del tumore.
   NOTA: Il tempo di incubazione varia tra i diversi esperimenti, le linee cellulari e da specie a specie. Pertanto, si consiglia di calibrare il tempo di incubazione prima di iniziare gli esperimenti.
4. Anestetizzare i topi come descritto nei passaggi 5.2-5.3.
5. Aprire il software (Table of Materials) durante l'incubazione, inizializzare il sistema di imaging e fare clic sul pulsante Inizializza .
   NOTA: tenere presente che la fotocamera impiegherà ~ 10 minuti per raffreddarsi e raggiungere -90 ° C. Inoltre, come controllo di fondo, misurare i livelli di luciferasi in topi naïve (cioè topi GFP ⁺ iniettati con cellule che non esprimono il gene luciferasi).
6. Mantenere la configurazione in esposizione automatica utilizzando le seguenti impostazioni: tempo di esposizione automatica, 60 s; Binning Medium, F/Stop 1; Filtro di eccitazione bloccato; Filtro di emissione aperto. Al termine dell'inizializzazione , selezionare Creazione guidata immagini | Bioluminescenza e quindi fare clic su Avanti | Apri filtro | selezionare Mouse nel soggetto dell'immagine.
7. In Field View, selezionare lo stage C (10 cm) e l'altezza del soggetto: 1,50 cm.
8. Fare clic su Impostazione immagine fase su C e, prima di fare clic sul pulsante Acquisisci, assicurarsi che il mouse sia posizionato sullo stage nella posizione supina corretta.
9. Chiudi la porta, fai clic sul pulsante Acquisisci e attendi che sullo schermo venga visualizzata un'immagine.
   NOTA: con l'opzione Auto-Exposure , un segnale forte richiede 5-20 s a seconda del segnale; un segnale debole impiegherà circa 60 s.
10. Ripeti questo passaggio per gli altri mouse.
11. Per rilevare le metastasi polmonari, coprire il segnale forte del tumore primario utilizzando carta di cartone nero spessa ed esporre solo il lato ventrale dei polmoni verso la fotocamera. Cattura l'immagine utilizzando gli stessi parametri descritti sopra.

7. Acquisizione di immagini ex vivo mediante bioluminescenza e fluorescenza

1. Eutanasizzare i topi usando l'inalazione di anidride carbonica (CO₂) nell'essiccatore e sezionare i topi usando forbici e pinze autoclavate.
2. Perfondere i topi usando soluzione salina allo 0,9%, prelevare gli organi e risciacquare con 1x PBS per eliminare le macchie di sangue dall'organo.
3. Trasferire l'organo risciacquato in una capsula di Petri e posizionarlo nello stadio della macchina a bioluminescenza. Applicare la stessa impostazione di bioluminescenza descritta nei passaggi 6.2-6.6.
   NOTA: A causa della diminuzione del segnale luciferasi, questo passaggio è limitante nel tempo. Quindi, dopo l'eutanasia dei topi, visualizzare immediatamente l'organo per bioluminescenza.
4. Per le immagini GFP, applicare la stessa impostazione descritta nel passaggio 6.3, utilizzando il filtro GFP a fluorescenza anziché la bioluminescenza.
5. Scatta immagini polmonari usando uno stereomicroscopio per esaminare la presenza di colonie GFP ⁺ .

8. Analisi dei dati di bioluminescenza

1. Fare doppio clic sul software e selezionare Apri dal menu File .
2. Apri tutti i file e riduci a icona. Assicurarsi che tutte le unità siano Radiance (Fotoni). Inoltre, fare clic su Applica a tutti per mantenere gli stessi parametri per tutte le immagini.
3. Dal menu Visualizza , selezionare la tavolozza degli strumenti, che aprirà una nuova finestra.
4. Dalla finestra Tavolozza degli strumenti , seleziona la scheda Strumenti ROI e in Tipo scegli il ROI medio di Bkg.
5. Dagli strumenti ROI, selezionare Cerchio e disegnare un piccolo cerchio sull'area toracica del mouse.
6. Fare doppio clic sul cerchio, selezionare l'opzione Usa come BKG per i ROI futuri dalla scheda ROI in background e fare clic su Fine.

9. Misurazione del flusso totale

1. Dalla finestra Tavolozza degli strumenti , selezionare la scheda Strumenti ROI e in Tipo scegliere Misurazione del ROI.
2. Dagli strumenti ROI, selezionare Cerchio e disegnare un grande cerchio sul tumore primario del mouse.
3. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Copia ROI e fare clic con il pulsante destro del mouse su Incolla ROI in ogni singolo file di ciascun mouse.
4. Fai clic su Misura ROI nella scheda Strumenti ROI , che aprirà una nuova finestra denominata Misurazioni ROI. Da questa scheda, mantenere i tipi di misurazioni come Radianza (fotoni) e Attributi immagine come tutti i valori popolati.
5. Esportare il file in formato File di misurazione (*.txt) o Csv (*.csv).
6. Apri i dati esportati in un foglio di calcolo e prendi il flusso totale (p / s) e i valori per le settimane.
   NOTA: questo passaggio può essere utilizzato per misurare diversi gruppi. Ad esempio, i topi trattati con un veicolo rispetto a quelli trattati con un farmaco.
7. Generate un grafico XY, in cui il tempo viene presentato lungo l'asse X e il flusso totale (p/s) lungo l'asse Y. Per ogni settimana, prendi il parametro Total Flux (p / s) per ciascun gruppo di campioni e determina eventuali differenze significative utilizzando il t-test dello studente non parametrico.

Risultati

Abbiamo generato linee cellulari di cancro al seno (MDA-MB-231, MCF-7 e MDA-MB-468) che esprimono vettori GFP e luciferasi. In particolare, questo è stato ottenuto da un'infezione sequenziale. In primo luogo, le linee cellulari del cancro al seno sono state infettate da un vettore di lentivirus che esprime GFP fluorescente. Le cellule GFP-positive (GFP⁺) sono state selezionate 2 giorni dopo l'infezione (Figura 1A,B) e infettate dal vettore pLX304 Luciferasi-V5. Q...

Discussione

Gli esperimenti su animali sono obbligatori per la ricerca sul cancro ^7,8,9, e in effetti molti protocolli sono stati sviluppati ^{3,6,10,11,12,13,14}. Tuttavia, la maggior parte di questi studi ha det...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL eppendorf tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 µL tips	Lifegene	LRT10
1000 µL tips	Lifegene	LRT1000
15 mL tubes	Lifegene	LTB15-500
200 µL tips	Lifegene	LRT200
6 well cell culture plate	COSTAR	3516
96 well Plates BLACK flat bottom	Bar Naor	BN30496
Automated Cell Counters	Thermofisher	A50298
BD FACSAria III sorter	BD
BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'')	BD	302200
BD Plastipak Syringes 1 mL x 120	BD	303172
Corning 100 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430167
Corning 150 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430599
Countess cell counting chamber slides	Thermofisher	C10228
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine	Biological Industries	01-055-1A
Eclipse 80i microscope	Nikon
eppendorf Centrifuge 5810 R	Sigma Aldrich	EP5820740000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	04-127-1A
FUW GFP			Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
HEK293T			Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
Isoflurane, USP Terrell	Piramal	NDC 66794-01-25
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
L-Glutamine Solution	Biological industries	03-020-1A
Living Image Software	PerkinElmer		bioluminescence measurement
MCF-7	ATCC	ATCC HTB-22
MDA-MB-231	ATCC	ATCC HTB-26
MDA-MB-468	ATCC	ATCC HTB-132
Pasteur pipettes	NORMAX	2430-475
PBS	Hylabs	BP655/500D
pCMV-dR8.2-dvpr	Addgene	#8455	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
pCMV-VSV-G	Addgene	#8454	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
Petri dish 90 mm (90x15)	MINI PLAST	820-090-01-017
Pipettes 10ml	Lifegene	LG-GSP010010S
Pipettes 25ml	Lifegene	LG-GSP010050S
Pipettes 5ml	Lifegene	LG-GSP010005S
pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid	Addgene	#98580
Polybrene	Sigma Aldrich	#107689
Prism 9	GraphPad
Reagent Reservoirs	Bar Naor	BN20621STR200TC
SMZ18 Stereo microscopes	Nikon
Sodium Chloride	Bio-Lab	190359400
Syringe filters	Lifegene	LG-FPV403030S
Trypan Blue 0.5% solution	Biological industries	03-102-1B
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries	03-052-1a
Vacuum driven Filters	SOFRA LIFE SCIENCE	SPE-22-500
Virusolve		disinfectant
VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade	Promega	P1043
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent	Sigma Aldrich	#6366236001