Biyolüminesans Kullanarak Farelerde Meme Kanseri Büyümesi ve Metastatik Koloni Oluşumunun İzlenmesi

Özet

Burada, çeşitli meme kanseri hücre hatlarında lusiferaz ve yeşil floresan protein ekspresyonunu içeren noninvaziv bir izleme yöntemini tanımladık. Bu protokol, farelerde tümör oluşumunu ve metastatik kolonizasyonu gerçek zamanlı olarak izlemek için bir teknik sağlar.

Özet

Meme kanseri sık görülen heterojen bir malignitedir ve kadınlarda özellikle uzak organ metastazı nedeniyle mortalitenin ikinci önde gelen nedenidir. Kanser hücrelerinin meme yağ yastığına enjekte edildiği yaygın olarak kullanılan ortopik fare modelleri de dahil olmak üzere çeşitli hayvan modelleri oluşturulmuştur. Bununla birlikte, bu modeller tümör büyüme kinetiğini ve metastatik kolonizasyonu izlemeye yardımcı olamaz. Farelerde kanser hücrelerini gerçek zamanlı olarak izlemek için en yeni araçlar, tümör biyolojisinin anlaşılmasını önemli ölçüde ilerletecektir.

Burada, lusiferaz ve yeşil floresan proteini (GFP) kararlı bir şekilde eksprese eden meme kanseri hücre hatları oluşturulmuştur. Spesifik olarak, bu teknik, in vitro lusiferaz aktivitesinin ölçülmesiyle başlatılan ve ardından kanser hücrelerinin obez olmayan diyabetik-şiddetli kombine immün yetmezlik (NOD-SCID) farelerinin meme yağ pedlerine implantasyonu ile başlatılan iki ardışık adım içerir. Enjeksiyondan sonra, hem tümör büyümesi hem de metastatik kolonizasyon, noninvaziv biyolüminesans görüntüleme sistemi tarafından gerçek zamanlı olarak izlenir. Daha sonra, akciğerlerdeki GFP eksprese eden metastazların miktarı, gözlemlenen biyolüminesans sonuçlarını doğrulamak için floresan mikroskobu ile incelenecektir. Lusiferaz ve floresan bazlı tespit araçlarını birleştiren bu sofistike sistem, meme kanseri terapötiklerinde ve hastalık yönetiminde kullanım için büyük potansiyele sahip olan kanser metastazını in vivo olarak değerlendirir.

Giriş

Meme kanserleri dünya çapında sık görülen kanser türleridir ve Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl yaklaşık 250.000 yeni vaka teşhis edilmektedir¹. Yüksek insidansına rağmen, yeni bir antikanser ilaç seti meme kanseri hasta sonuçlarını önemli ölçüde iyileştirmiştir². Bununla birlikte, birçok hasta hastalık nüksetmesi ve hasta morbidite ve mortalitesinin birincil nedeni olan hayati organlara metastatik yayılım² yaşadığından bu tedaviler hala yetersizdir. Bu nedenle, meme kanseri araştırmalarındaki temel zorluklardan biri, gelişimlerini engellemek için yeni araçlar geliştirmek üzere distal metastazların oluşumunu düzenleyen moleküler mekanizmaları tanımlamaktır.

Kanser metastazı, hücrelerin birincil tümörden ayrıldığı ve kan dolaşımı yoluyla komşu dokuları istila ettiği dinamik bir süreçtir. Böylece, hücrelerin benzer bir metastatik kaskaddan geçtiği hayvan modelleri, bu süreci yöneten mekanizmaların tanımlanmasını kolaylaştırabilir ^3,4. Ek olarak, bu in vivo modeller meme kanseri terapötik ajanlarının geliştirilmesi için gereklidir ^5,6. Bununla birlikte, bu ortotopik modeller gerçek tümör büyüme kinetiğini gösteremez, çünkü etki sadece sonlandırma üzerine belirlenir. Bu nedenle, tümör gelişimini ve metastatik kolonizasyonu gerçek zamanlı olarak tespit etmek için lusiferaz bazlı bir araç kurduk. Ek olarak, bu hücreler metastatik kolonileri tespit etmek için GFP'yi eksprese eder. Bu yaklaşım nispeten basittir ve herhangi bir invaziv prosedür içermez³. Bu nedenle, lusiferaz ve floresan tespitini birleştirmek, meme kanseri terapötikleri ve hastalık yönetimi ile ilgili klinik öncesi çalışmaları ilerletmek için yararlı bir stratejidir.

Protokol

Tüm fare deneyleri, İbrani Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi onaylı protokol MD-21-16429-5 kapsamında gerçekleştirildi. Buna ek olarak, İbrani Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından onaylanmıştır.

1. Hücre hattı bakımı

NOT: Bu protokolde insan meme kanseri hücre hatları (MCF-7, MDA-MB-468 ve MDA-MB-231) kullanılmıştır.

1. Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium'undaki (DMEM) tüm meme kanseri hücre hatlarını, nemlendirilmiş bir karbondioksit (% 5 CO₂) inkübatöründe 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiştir.
   NOT: Hücre yoğunluğunu düzenli olarak kontrol edin; %70 akıcılığa ulaştıklarında gelecekteki kullanımlar için bölün ve genişletin.

2. Virüs hazırlığı

1. HEK293T hücrelerine ayrılana kadar 1 mL tripsin ile muamele edin.
2. Tripsin aktivitesini nötralize etmek için 10 mL DMEM (% 10 FBS) ekleyin ve hücre süspansiyonunu yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
3. Hücreleri çökeltmek için 5 dakika boyunca 150 × g'da santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra süpernatantı atın ve 1 mL taze DMEM ortamı ekleyin.
4. Hücre konsantrasyonunu ve tohum 1.2 × 10⁶ hücre/kuyuyu altı delikli bir plakada belirleyin.
5. Ertesi gün, transfeksiyon reaktifi, serumsuz DMEM, zarf plazmidi (VSV-G), lentivirüs ambalaj plazmidi (ΔVPR) ve pLX304 Luciferase-V5 blast plazmidi veya FUW GFP plazmidi dahil olmak üzere gerekli tüm reaktifleri önceden ısıtın.
6. 1,5 mL'lik otoklavlanmış bir santrifüj tüpünde, 50 μL serumsuz DMEM'i 0,3 μg VSV-G plazmid, 1 μg ΔVPR ve 1,2 μg pLX304 Luciferaz-V5 blast plazmid veya FUW GFP plazmidi ile karıştırın.
7. Bu plazmidleri ortamla iyice karıştırdıktan sonra, transfeksiyon reaktifinden 5 μL ekleyin, yavaşça karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
8. Kuluçkayı takiben, karışımı HEK293T hücrelerine damla damla ekleyin.
9. 24 saat sonra, büyüme ortamını 2 mL (% 30 FBS) DMEM ile değiştirin. Ertesi gün (transfeksiyon sonrası 48 saat), virüsleri içeren ortamı ("pLX304 Luciferase-V5 veya FUW GFP virüsleri") toplayın.
   NOT: %30 FBS kullanımı virüs üretim verimliliğini artırır.
10. HEK293T hücre kalıntılarını önlemek için, virüs içeren ortamı 0,45 μm'lik bir şırınga filtresinden veya 5 dakika boyunca 150 × g'lık santrifüjden geçirin ve süpernatanı toplayın.
    NOT: Uzun süreli depolama için, virüsün çalışan alikotlarını -80 ° C'de tutun.

3. GFP ve lusiferazı kararlı bir şekilde eksprese eden hücrelerin oluşturulması ("GFP + Luc ⁺ hücreleri")

1. Hücreleri enfekte etmeden bir gün önce, tohum 8 × altı kuyucuklu bir plakada kuyu başına 10⁵ hücre.
2. Gece boyunca inkübasyondan sonra, büyüme ortamını 8 μg / mL polibren içeren taze ortamla değiştirin. Hücrelere damla damla 200 μL FUW GFP virüsü ekleyin.
3. İsteğe bağlı: Virüs verimliliğini artırmak için, plakayı 30 dakika (37 °C ) boyunca 560 × g'de santrifüj edin (spin enfeksiyonu).
4. Hücreleri 48 saat boyunca inkübe edin ve GFP ekspresyonunu floresan mikroskopi ile doğrulayın.
5. GFP eksprese eden hücreleri, floresan ile aktive olmuş hücre sıralama (FACS) (GFP ⁺) ile sıralayın (Şekil 1A).
6. GFP ile sıralanmış hücrelere, adım 3.2'de açıklandığı gibi pLX304 Luciferase-V5 blast virüsleri bulaştırın.
7. pLX304 Luciferaz-V5 patlama eksprese eden hücreleri (GFP ⁺, Luc ⁺ hücreleri) zenginleştirmek için hücreleri enfeksiyon sonrası 30 saat blastisidin (10 μg / mL) ile tedavi edin. Daha sonra, her iki günde bir, blastisidin içeren taze bir ortamla değiştirin. Ek olarak, bir kontrol olarak, naif hücreleri aynı blastisidin içeren ortamla tedavi edin.
   NOT: Enfekte ve kontrol hücreleri arasındaki açık bir fark, birkaç günlük blasticidin tedavisinden sonra gözlenmelidir. Bu etki hücre hattına bağımlıdır ve genellikle ~ 8-10 gün sürer. Kötü bir hayatta kalma oranı, düşük bir viral üretim verimini gösterecektir. Eğer öyleyse, düşük verimlilik gelecekteki deneyleri etkileyebileceğinden yeni bir virüs grubu üretin.

4. İn vitro lusiferaz aktivitesinin doğrulanması

1. MCF-7, MDA-MB-468 ve MDA-MB-231 GFP⁺ Luc⁺ hücrelerini 15 cm'lik bir plakada %80 akıcılığa kadar büyütün. Hücreleri adım 2.1-2.2'de açıklandığı gibi tripsinizasyon ile toplayın.
2. Her bir kuyucukta artan sayıda hücreyi (0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 × 10⁴) siyah bir 96 kuyucuklu plakaya tohumlayın.
   NOT: Siyah 96 delikli plakalar, beyaz veya şeffaf plakalar otolüminesans sinyalleri üreteceğinden, lusiferaz seviyelerini ölçmek için daha uygundur. Bir kontrol olarak, PBS'den otolüminesans olmadığından emin olmak için tek başına bir kuyucukta fosfat tamponlu salin (PBS) kullanın.
3. Tüm kuyucukları 100 μL DMEM ile doldurun ve 16-24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
4. PBS'de lusiferin çözeltisini 30 mg / mL'lik stoktan 1.5 mg / mL konsantrasyonda hazırlayın. Lusiferin çözeltisinin stoğunu alıkoyun ve -20 ° C'de saklayın.
5. Hücreleri PBS ile bir kez nazikçe yıkayın, her bir oyuğa 100 μL lusiferin çözeltisi ekleyin ve 2 dakika bekleyin. Son olarak, biyolüminesans kullanarak tüm meme kanseri hücrelerindeki lusiferaz aktivitesini ölçün.
   NOT: Hayvan deneylerinden önce in vitro GFP ve lusiferaz ekspresyonunun incelenmesi çok önemlidir. Ek olarak, arka planı çıkarmak için boş kuyucuklar kullanılır.

5. GFP ⁺ Luc ⁺ hücreleri ile farelerin enjekte edilmesi

1. 5 × 10⁶ (MCF-7 ve MDA-MB-468) veya 2 × 10⁶ (MDA-MB-231) GFP+ Luc⁺ hücrelerini sırasıyla 200 μL veya 100 μL PBS'ye aktarın.
2. Enjeksiyondan önce, steril biyolojik davlumbazı% 5 dezenfektan çözeltisi ile temizleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Daha sonra, fareleri, 2-3 dakika boyunca 1 L / dak'lık bir hava akış hızında% 4 izofluran içeren filtrelenmiş (0.2 μm) hava ile uyuşturun.
   NOT: Uygun anestezinin onaylanması esastır; farenin ayak parmağını sıkıştırın ve herhangi bir yanıt arayın.
3. Anestezi uygulanan fare kafasının üzerine sırtüstü pozisyonda bir koni yerleştirin. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlerine veteriner merhem uygulayın.
4. Farenin karın bölgesini, meme bezinin üstünde, pamuklu çubukla etanol ile silin ve 4^. meme bezini forseps ile kaldırın.
5. İğneyi yağ yastığının altına 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) yerleştirin ve hücre süspansiyonunun 100 μL'sini yavaşça enjekte edin.
   NOT: Cildin altında yuvarlak bir çıkıntı görünecektir. Ek olarak, yanlış bir enjeksiyon, tümör büyüme hızında sapmaya veya aynı deney grubunda tümörün yokluğuna neden olabilir.
6. Enjeksiyon işleminden sonra, fareleri davlumbazdan çıkarın ve yeni bir kafese aktarın. Bilince dönene kadar fareleri izleyin.
   NOT: Kullanılan tüm iğnelerin ve şırıngaların keskinlik kutusuna atıldığından emin olun.

6. GFP ⁺ Luc ⁺ farelerde lusiferaz seviyelerinin ölçülmesi

1. Biyolüminesans tespitinden önce, boynunu sol eliyle tutarak bilinçli fareyi kısıtlayın. Ardından, elinizi sola doğru eğin, farenin yukarı bakması ve alt gövdenin sırtüstü pozisyonda olmasını sağlayın.
2. İğne boyutu 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) olan 1,0 mL'lik bir şırınga kullanarak farenin sol alt karın kadranındaki farenin karın yüzeyine intraperitoneal olarak (yani 100 mg/mL) 100 μL lusiferin (30 mg/mL) enjekte edin.
   NOT: İğnenin ucu, viseral organlara nüfuz edebileceğinden, karın duvarından 3-5 mm'den daha fazla yerleştirilmemelidir. Ek olarak, anestezi uygulanan farelerin vücudundaki lusiferin dağılımı bilinçli farelerden daha yavaş olduğu için anestezi olmadan i.p. enjeksiyonu yapılması önerilir. Bu nedenle, bilinçli farelerde lusiferaz seviyelerinin izlenmesi daha hızlı bir prosedürdür.
3. Tümör kinetiğini ölçmeden önce fareyi anestezi olmadan 7 dakika ve ardından anestezi odasında 3 dakika tutun.
   NOT: Kuluçka süresi, farklı deneyler, hücre hatları ve türler arasında türlere göre değişir. Bu nedenle, deneylere başlamadan önce kuluçka süresinin kalibre edilmesi önerilir.
4. Fareleri 5.2-5.3 adımlarında açıklandığı gibi anestezi altına alın.
5. Kuluçka sırasında yazılımı (Malzeme Tablosu) açın, görüntüleme sistemini başlatın ve Başlat düğmesine tıklayın.
   NOT: Fotoğraf makinesinin soğumasının ~10 dakika süreceğini ve -90 °C'ye ulaşacağını unutmayın. Ek olarak, arka plan kontrolü olarak, naif farelerde (yani, lusiferaz genini ifade etmeyen hücrelerle enjekte edilen GFP ⁺ fareler) lusiferaz seviyelerini ölçün.
6. Aşağıdaki ayarları kullanarak kurulumu otomatik pozlamada tutun: otomatik pozlama süresi, 60 sn; Bağlama Ortamı, F/Stop 1; Uyarma filtresi engellenmiş; Emisyon filtresi açık. Başlatma sona erdiğinde, Görüntüleme Sihirbazı'nı seçin | Biyolüminesans ve ardından İleri |'i tıklatın Filtre |'ni açın görüntü konusunda Fare'yi seçin.
7. Saha Görünümü'nde, C (10 cm) aşamasını ve Konu Yüksekliği: 1,50 cm'yi seçin.
8. Image Setup Stage to C (Görüntü Kurulumu) to C ( Image Setup Stage to C) seçeneğini tıklatın ve Acquire (Elde Et ) düğmesini tıklatmadan önce, farenin sahne alanına doğru sırtüstü konumda yerleştirildiğinden emin olun.
9. Kapıyı kapatın, Al düğmesine tıklayın ve ekranda bir görüntünün görünmesini bekleyin.
   NOT: Otomatik Pozlama seçeneğiyle, güçlü bir sinyal sinyale bağlı olarak 5-20 s sürer; zayıf bir sinyal yaklaşık 60 s alacaktır.
10. Diğer fareler için bu adımı tekrarlayın.
11. Akciğer metastazını tespit etmek için, kalın siyah karton kağıt kullanarak primer tümörün güçlü sinyalini örtün ve akciğerlerin sadece ventral tarafını kameraya doğru maruz bırakın. Yukarıda açıklanan parametreleri kullanarak görüntüyü yakalayın.

7. Biyolüminesans ve floresan kullanarak ex vivo görüntü elde etme

1. Kurutucuda karbondioksit (CO₂) inhalasyonu kullanarak fareleri ötenazi yapın ve otoklavlanmış makas ve forseps kullanarak fareleri diseke edin.
2. % 0.9 salin kullanarak fareleri perfüze edin, organları toplayın ve organdaki kan lekelerini gidermek için 1x PBS ile durulayın.
3. Durulanmış organı bir Petri kabına aktarın ve biyolüminesans makinesinin aşamasına yerleştirin. Adım 6.2-6.6'da açıklandığı gibi aynı biyolüminesans ayarını uygulayın.
   NOT: Lusiferaz sinyalindeki azalma nedeniyle, bu adım zaman sınırlayıcıdır. Böylece, fareleri ötenazi yaptıktan sonra, organı hemen biyolüminesans ile görselleştirin.
4. GFP görüntüleri için, Biyolüminesans yerine Floresan GFP filtresini kullanarak adım 6.3'te açıklanan ayarın aynısını uygulayın.
5. GFP ⁺ kolonilerinin varlığını incelemek için stereo mikroskop kullanarak akciğer görüntüleri alın.

8. Biyolüminesans veri analizi

1. Yazılımı çift tıklatın ve Dosya menüsünden Aç'ı seçin.
2. Tüm dosyaları açın ve simge durumuna küçültün. Tüm birimlerin Işıltı (Fotonlar) olduğundan emin olun. Ayrıca, tüm görüntüler için aynı parametreleri korumak üzere Tümüne Uygula'yı tıklatın.
3. Görünüm menüsünden, yeni bir pencere açacak olan Araç Paleti'ni seçin.
4. Araç Paleti penceresinden YG Araçları sekmesini seçin ve Tür'de Ortalama Bkg YG'yi seçin.
5. Yatırım getirisi araçlarından Daire'yi seçin ve farenin torasik alanına küçük bir daire çizin.
6. Daireye çift tıklayın, Arka Plan YG sekmesinden Gelecekteki YG'ler için BKG olarak kullan seçeneğini belirleyin ve Bitti'ye tıklayın.

9. Toplam akının ölçülmesi

1. Araç Paleti penceresinden YG Araçları sekmesini seçin ve Tür'de YG Ölçümü'nü seçin.
2. Yatırım getirisi araçlarından Daire'yi seçin ve farenin birincil tümörüne büyük bir daire çizin.
3. YG'yi kopyala'yı sağ tıklatın ve YG'yi her farenin her bir dosyasına yapıştır'ı sağ tıklatın.
4. YG Ölçümleri adlı yeni bir pencere açacak olan YG Araçları sekmesinden YG'leri Ölç'ü tıklayın. Bu sekmeden, Ölçüm Türlerini Parlaklık (Fotonlar) ve Görüntü Özniteliklerini Tüm Doldurulmuş Değerler olarak tutun.
5. Dosyayı Ölçüm Dosyası (*.txt) veya CSV (*.csv) biçiminde dışa aktarın.
6. Dışa aktarılan verileri bir elektronik tabloda açın ve Toplam Akı (p / s) ve haftaların değerlerini alın.
   NOT: Bu adım, farklı grupları ölçmek için kullanılabilir. Örneğin, bir araçla tedavi edilen farelere karşı bir ilaçla tedavi edilenler.
7. Zamanın X ekseni boyunca ve Toplam Akının (p/s) Y ekseni boyunca sunulduğu bir XY grafiği oluşturun. Her hafta için, her örnek grup için Toplam Akı (p / s) parametresini alın ve parametrik olmayan Öğrencinin t-testini kullanarak önemli farklılıkları belirleyin.

Sonuçlar

GFP ve lusiferaz vektörlerini eksprese eden meme kanseri hücre hatları (MDA-MB-231, MCF-7 ve MDA-MB-468) ürettik. Spesifik olarak, bu sıralı bir enfeksiyon ile elde edildi. İlk olarak, meme kanseri hücre hatları, floresan GFP'yi eksprese eden bir lentivirüs vektörü ile enfekte edildi. GFP-pozitif hücreler (GFP ⁺) enfeksiyondan 2 gün sonra sıralandı (Şekil 1A, B) ve pLX304 Luciferase-V5 vektörü ile enfekte edildi. Daha sonra, belirtilen (GFP

Tartışmalar

Hayvan temelli deneyler kanser araştırmaları için zorunludur ^7,8,9 ve gerçekten de birçok protokol ^{geliştirilmiştir} 3,6,10,11,12,13,14. Bununla birlikte, bu çalışmaların çoğu biyolojik...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL eppendorf tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 µL tips	Lifegene	LRT10
1000 µL tips	Lifegene	LRT1000
15 mL tubes	Lifegene	LTB15-500
200 µL tips	Lifegene	LRT200
6 well cell culture plate	COSTAR	3516
96 well Plates BLACK flat bottom	Bar Naor	BN30496
Automated Cell Counters	Thermofisher	A50298
BD FACSAria III sorter	BD
BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'')	BD	302200
BD Plastipak Syringes 1 mL x 120	BD	303172
Corning 100 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430167
Corning 150 mm x 20 mm Style Dish	CORNING	430599
Countess cell counting chamber slides	Thermofisher	C10228
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine	Biological Industries	01-055-1A
Eclipse 80i microscope	Nikon
eppendorf Centrifuge 5810 R	Sigma Aldrich	EP5820740000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	04-127-1A
FUW GFP			Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
HEK293T			Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
Isoflurane, USP Terrell	Piramal	NDC 66794-01-25
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
L-Glutamine Solution	Biological industries	03-020-1A
Living Image Software	PerkinElmer		bioluminescence measurement
MCF-7	ATCC	ATCC HTB-22
MDA-MB-231	ATCC	ATCC HTB-26
MDA-MB-468	ATCC	ATCC HTB-132
Pasteur pipettes	NORMAX	2430-475
PBS	Hylabs	BP655/500D
pCMV-dR8.2-dvpr	Addgene	#8455	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
pCMV-VSV-G	Addgene	#8454	Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
Petri dish 90 mm (90x15)	MINI PLAST	820-090-01-017
Pipettes 10ml	Lifegene	LG-GSP010010S
Pipettes 25ml	Lifegene	LG-GSP010050S
Pipettes 5ml	Lifegene	LG-GSP010005S
pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid	Addgene	#98580
Polybrene	Sigma Aldrich	#107689
Prism 9	GraphPad
Reagent Reservoirs	Bar Naor	BN20621STR200TC
SMZ18 Stereo microscopes	Nikon
Sodium Chloride	Bio-Lab	190359400
Syringe filters	Lifegene	LG-FPV403030S
Trypan Blue 0.5% solution	Biological industries	03-102-1B
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries	03-052-1a
Vacuum driven Filters	SOFRA LIFE SCIENCE	SPE-22-500
Virusolve		disinfectant
VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade	Promega	P1043
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent	Sigma Aldrich	#6366236001