原位 急性 离体 胚胎脑切片培养物中轴突生长和生长锥动力学的可视化

摘要

该协议展示了一种直接而稳健 的方法来研究原位 轴突生长和生长锥动态。它描述了如何制备 离体 生理相关的急性脑切片，并提供了用户友好的分析管道。

摘要

在神经元发育过程中，轴突在皮质环境中导航以到达其最终目的地并建立突触连接。生长锥 - 位于发育轴突远端尖端的感觉结构 - 执行此过程。研究生长锥的结构和动力学对于理解轴突发育以及与周围中枢神经系统（CNS）的相互作用至关重要，这些相互作用使其能够形成神经回路。在基础研究和临床前环境中设计将轴突重新整合到损伤后神经回路的方法时，这是必不可少的。到目前为止，对生长锥动力学的一般理解主要基于对二维（2D）培养的神经元的研究。虽然2D研究无疑是当前生长锥结构动力学和对刺激响应的知识的基础，但2D研究歪曲了完整中枢神经系统组织中神经元生长锥所遇到的生理三维（3D）环境。最近，胶原蛋白凝胶被用来克服其中一些限制，从而能够在3D中研究神经元发育。然而，合成的2D和3D环境都缺乏CNS组织内的信号线索，这些信号线索指导着发育中轴突的延伸和寻路。该协议提供了一种使用有机指型脑切片研究轴突和生长锥的方法，其中发育中的轴突遇到生理相关的物理和化学线索。通过将 子宫内 微调和 宫外 电穿孔相结合，稀疏地递送荧光报告基因以及超分辨率显微镜，该协议为轴突和生长锥动力学 的原位可视化提供了方法学管道。此外，还包括对长期和活细胞成像数据分析的详细工具包描述。

引言

神经元是高度极化的细胞，代表神经系统中的基本计算单位。它们接收和发出依赖于输入和输出站点划分的信息:树突和轴突，分别^为1。在开发过程中，轴突在导航令人难以置信的复杂环境以到达目的地时会延伸。轴突导航由生长锥引导，生长锥是位于发育轴突尖端的感觉结构。生长锥负责检测环境线索并将其转化为其细胞骨架^2，3的动态空间重组。由此产生的形态力学反应指示生长锥从触发线索延伸或缩回，从而导致特定的轴突机动。

目前对轴突延伸和生长锥动力学的理解源于评估轴突在二维（2D）底物上生长^{的研究2，4}，^5，6，7。这些开创性研究确定了生长锥和生长基质之间复杂的相互作用，并揭示了取决于基材特性（如粘附性和刚度^8，9）的显着差异。在这些见解的引导下，细胞外环境线索被假设为决定轴突生长，生长锥细胞骨架执行这种生长^{2，10，11，12}。值得注意的是，神经元可以延长非粘性基质（例如，聚赖氨酸，聚鸟氨酸）中的轴突¹³。此外，基材刚度可以独立于细胞粘合剂复合物⁸影响轴突生长速率。因此，单独研究2D基质中的生长锥动力学不能准确地模拟轴突生长锥与生理相关三维（3D）环境（例如体内发现的那些）相互作用所产生的力的平衡。

为了克服2D测定的局限性，在3D基质^8，9中研究了轴突生长和生长锥动力学。这些基质提出了更多的生理背景，但允许研究轴突生长的细胞内在机制。它能够在各种条件和药物治疗中以单细胞方式进行生长锥检查⁹。在这样的3D环境中，轴突表现出明显的细胞骨架动力学，并且比在2D培养神经元中观察到的轴突生长得更快⁹。这些优雅的研究表明，额外维度对生长锥细胞骨架的重组以及因此对其行为的影响。

尽管3D矩阵在支持天然神经元发育和轴突生长方面比2D表面具有明显的优势，但它们仍然是一个简化的合成支架，无法反映在中枢神经系统（CNS）组织中观察到的动力学的复杂性。在这里，通过宫外和子宫电穿孔递送报告质粒与脑器官切片培养和原位实时超分辨率成像相结合，以分析生理背景下的生长锥动力学。该方法允许在体验体内环境的三维性及其物理化学组成的复杂性的同时可视化发育轴突。最后，描述了使用常用许可和公开可用的软件测量轴突生长和生长锥动力学的用户友好型程序。

研究方案

动物实验必须符合相关的机构和联邦法规。胚胎第15.5天和第12.5（E15.5和E12.5）怀孕的雌性C57BL / 6JRj小鼠用于该方案。实验是根据北莱茵 - 威斯特法伦州环境局（Landesamt für Natur，Umwelt und Verbraucherschutz（LANUV））的动物福利法案进行的。

1. 注射用质粒的制备

1. 根据制造商的方案，使用不含内毒素的Maxiprep试剂盒分离DNA（见 材料表）。
2. 将选定的DNA以所需浓度（表1）和10%快速绿色溶液（参见 材料表）混合，以可视化DNA混合物向脑室的递送。
   注意:特定的质粒用于皮质神经元的稀疏标记（图1A），生长锥中的丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）结构（图1B），以及同一皮层内生长锥的双重标记（图1C）。该方案中使用的所有质粒（表1）都已沉积在Addgene中（参见 材料表）。
3. 按照以下程序使用毛细管电极拉拔器组制备玻璃毛细管:压力:500，热量:800，拉力:30，速度:40。
4. 使用微型上样器移液器吸头将15μLDNA /快速绿色混合物上样到每个玻璃毛细管中。
   注:确保不形成气泡。
5. 将DNA填充的毛细管储存在10厘米的培养皿中，并在培养皿的直径上放置一块造型粘土。毛细管可以在实验前一天在4°C下加载和储存。用柔性薄膜密封毛细管的后端，以防止干燥。

2. 溶液的制备

1. 准备补充葡萄糖（HBSS-G）的Hank缓冲盐溶液。
   1. 将20%葡萄糖储备液中的0.5%加入一瓶1x HBSS中。充分混合并在4°C下储存长达2周。对于胚胎提取，在胚胎收集前不久使用鼓泡石将HBSS-G溶液与碳原（95%O₂ 和5%CO₂）起泡。
2. 切片介质解决方案
   1. 在无菌条件下，准备含有神经基础1x，5%马血清，5%胎儿小牛血清，B27补充剂1:50，L-谷氨酰胺补充剂1:400，青霉素 - 链霉素1:200和Neuropan-2补充剂1:100（pH = 7.3）的新鲜切片培养基（见 材料表）。
   2. 准备 3 厘米的培养皿，每杯 1 mL 切片培养基。在实验前，将5%CO₂ 置于35°C的培养箱中至少1小时，以通过气体交换平衡培养基的pH值。
      注意:培养基pH平衡是由培养箱中的CO₂ 对培养基酸化引起的。切片介质可在4°C下储存长达1周。
3. 低熔点琼脂糖溶液（3%）
   1. 称取所需量的低熔点琼脂糖粉末，并在玻璃瓶中以适当体积的1x HBSS-G溶解。每个大脑需要约7 mL琼脂糖溶液。
   2. 将瓶子放在微波炉中2-3分钟，盖子松开，每10-20秒摇动一次。
   3. 一旦粉末完全溶解，将瓶子放在实验前至少1小时设置为37°C的水浴或珠浴中，以使琼脂糖冷却。
      注意:建议在15分钟内将琼脂糖加热两次，以确保琼脂糖粉末溶解。这对于琼脂糖在脑组织中的适当粘附至关重要。应使用温度计测量琼脂糖溶液的温度，同时嵌入大脑，确保其在37-40°C之间。 来自不同年龄动物的大脑具有不同的刚度。建议测试一系列琼脂糖浓度，以找到组织和琼脂糖之间的均匀性。
   4. 用0.3%曲拉通X-100（PBS-T）制备磷酸盐缓冲盐水。
   5. 用0.2%叠氮化钠（PBS-NaN₃）制备磷酸盐缓冲盐水。
      注:步骤2.4-2.5中描述的溶液用于后面的免疫组化步骤。

3. 手术台的准备

1. 用70%-96%乙醇清洁手术台，并将手术垫放在手术台表面。
2. 用70%-96%乙醇冲洗手术器械灭菌，然后在热珠灭菌器中干燥灭菌。
3. 在连接到脉冲发生器之前，用70%-96%乙醇清洁铂镊子电极（见 材料表）。
4. 将DNA/快速绿色填充玻璃毛细管插入毛细管支架中。使用前，立即使用细剪刀轻轻掰开毛细管尖端，并在装有预热盐水或水的1.5 mL微量离心管内测试溶液流。
   注: 图2A，B 显示了手术台的设置和用于 宫外 电穿孔（EUE）和 子宫 电穿孔（IUE）的工具。
5. 对于IUE，在水浴中将盐水溶液加热至37°C。

4. 胚胎提取

1. 将怀孕的小鼠置于具有5%异氟醚的麻醉诱导室中，直到小鼠被深度麻醉。通过无踏板退缩反射来确认麻醉。
2. 将小鼠转移到操作衬垫上，并通过鼻锥将异氟醚保持在1.5%-2%。
3. 将软膏涂抹在双眼，以防止角膜干燥。
4. 剃掉小鼠的腹部，然后用70%-96%乙醇浸泡的纱布去除剃掉的毛发。用倍他定清洁该区域。
5. 使用无菌小手术剪刀，沿着腹部中线做一个2厘米的皮肤切口，然后做一个1.5厘米的肌肉切口。
   注意:切口大小取决于胚胎大小。事实上，较大的胚胎将需要一个更大的切口来适应它们的提取。
6. 在纱布中间切一个足够宽的孔以适合皮肤切口（直径约2厘米），用温盐水浸泡，并将其放在腹部开口周围。
7. 使用浸泡在温盐水中的棉签或使用镊子拔出两个子宫角，小心地抓住胚胎之间的空间以将其拉出。将胚胎放在湿纱布上（图2C）。
   注意:即使对子宫角周围的血管和毛细血管造成小的损害也可能导致大量出血。因此，请始终避免直接处理这些血管形成区域。
8. 切开子宫袋并取出每个胚胎（图2D）。
9. 提取后 通过 下降的对角线切口立即对每个胚胎实施安乐死，确保完整的脊髓横断面（图2E）。
10. 将胚胎放在含有HBSS-G的10厘米培养皿中冰上。
    注意:避免将胚胎斩首，以防止DNA/Fast Green混合物从大脑中泄漏，并便于胚胎在支架中轻松定位（参见 宫外 电穿孔，步骤5）。
11. 胚胎提取后立即通过宫颈脱位处死母亲。
    注意:在这里，母亲在麻醉下被安乐死，以避免任何进一步的术后疼痛或痛苦，符合北莱茵 - 威斯特法伦州环境局（LANUV）动物福利法批准的协议。

5. 宫外 电穿孔术

1. 拿起胚胎并将其放入支架中。
   注意:连接到细胞刮刀末端的切割1 mL移液器吸头用作胚胎支架。在手术过程中，必须将胚胎的手臂保持在尖端之外，以防止它们滑入尖端（图2F-I）。移液器吸头的直径易于调节，以适应各种尺寸的胚胎。在尖端直径与胚胎大小匹配的长度上切割第二个尖端，并将其用作上述支架的适配器插入物。
2. 小心地将DNA /快速绿色填充的玻璃毛细管通过胚胎的头骨插入外心室并注射2-3μLDNA质粒混合物（图1A，B;表1）进入每个心室（图2F）。
   注意:使用兰氏和矢状缝合线作为DNA注射位置的指南。羔状和矢状缝合线是连接颅骨骨板的纤维关节。前者将顶骨与枕骨连接，后者连接两个顶骨。
3. 以适当的角度将胚胎的头部保持在铂镊子电极之间，以靶向所需的大脑区域（在这种情况下为60°角），阴极面向预期DNA转移的区域（图2G-H）。
4. 使用方波脉冲发生器在30 mV下施加5个脉冲，间隔为1 s，持续时间为50 ms。
   注意:请记住，EUE中的大脑比IUE中的大脑经历更有效的电场。因此，在给定的DNA浓度下，EUE导致比IUE更高的DNA转移效率，DNA浓度需要相应地调整。
5. 如果需要双侧电穿孔，重复步骤5.3-5.4，阴极和阳极镜像先前的位置以靶向对侧皮层。
   注意:由于两个脑室都注射了DNA，因此两个半球的皮质都是靶向的。
6. 将电穿孔胚胎放入含有冰冷HBSS-G的6厘米培养皿中。对所有所需的胚胎重复步骤5.1-5.6。

6 . 子宫内 电穿孔术 （IUE）

1. 注射怀孕的小鼠镇痛药;50μL丁丙诺啡（0.1mg / kg）皮下注射，在手术前20分钟皮下。
2. 从胚胎提取部分执行步骤4.1-4.8。
   注意:避免让胚胎不必要地暴露在外面，用浸泡在温盐水中的无菌纱布覆盖它们。
3. 使用指尖，轻轻旋转子宫内的胚胎，直到找到兰氏体和矢状缝合线（图2J）。小心地将DNA /Fast Green玻璃毛细管穿过子宫壁和胚胎的颅骨插入外侧心室，并根据需要将2-3μLDNA质粒混合物（图1A，C）注射到一个或两个心室中（图2K-L）。
   注意:手指对子宫角的过度压力可能导致羊膜袋塌陷。
4. 将胚胎的头部保持在铂镊子电极之间，以适当的角度瞄准所需的大脑区域（在这种情况下为60°角），阴极朝向DNA转移的目的区域。避免挤压子宫，因为它可能导致羊膜袋塌陷（图2M）。
5. 使用方波脉冲发生器以35 mV施加5个脉冲，间隔为600 ms，持续时间为50 ms。
6. 如果两个侧脑室都注射，重复步骤6.5-6.6，阴极和阳极镜像先前的位置以靶向对侧皮层。
7. 对所有所需的胚胎重复步骤6.3-6.6。
8. 一旦所有必需的胚胎都经过电穿孔，使用盐水浸泡的棉签将子宫角轻轻地放回腹腔内。
   注意:将盐水溶液添加到腹膜腔中将有助于子宫角滑回原位。
9. 缝合肌肉和皮肤切口使用5-0缝合材料。使用缝合夹固定伤口，并通过喷洒倍他定对缝合线伤口进行消毒（图2N-P）。
10. 皮下注射200μL5%葡萄糖。
11. 用抗生素注射小鼠;皮下注射50μL恩诺沙星（5mg / kg）（见 材料表）。
12. 将小鼠放回回收笼中，并在术后使用远红外加热灯或加热垫保持温暖至少20分钟（图2Q）。
13. 每天监测小鼠，并在手术后注射美洛昔康，以按照机构和联邦指南缓解疼痛。
14. 在步骤4之后2天（即E17.5）提取胚胎。

7. 脑提取和嵌入琼脂糖

注意:建议在解剖显微镜下执行以下步骤，以提高精度。避免对大脑的损害对于手术的成功至关重要。

1. 在解剖罩下的无菌工作空间中设置提取工具（图3A）。
2. 使用解剖剪刀将胚胎的头部与身体的其他部分分开。
3. 如图 3C所示固定头部，然后沿着中线切割，从头部底部开始朝向鼻子，去除皮肤和头骨（图3D）。
4. 横向剥离皮肤和颅骨，形成足够大的间隙（约1厘米），以便切除大脑。
5. 为了切除大脑，插入无菌解剖剪刀的闭合尖端，从嗅球下方开始向脑干移动（图3E）。
6. 切除脑干并修剪大脑周围任何松散的脑膜（图3F）。
   注意:松散的脑膜通常会导致切片在切割后仍然附着在琼脂糖块上，导致切片收集过程中组织从琼脂糖中分离出来。
7. 对所有胚胎重复步骤7.1-7.6，并将大脑保持在冰上（理想情况下不超过30分钟），直到嵌入步骤。
   注:以下步骤7.7.1-7.7.4是指E12.5大脑的脑提取。
   1. 隔离眼睛正下方的头顶，如图 3G所示。
   2. 按照 图3H所示的虚线，切开脑干顶部的皮肤和头骨，而不去除脑干。
   3. 在头部后部做一个2毫米的皮肤 - 颅骨切口，如图 3I 所示（见图纸清晰）。
      注意:这个切口提供了最初的抓握点，以剥离皮肤和头骨层。通常，它们作为一层脱落。典型的切口尺寸为2 mm，对应于所用微型弹簧剪刀的切削刃长度。
   4. 通过固定切口的一侧并小心地拉动另一侧来开始剥离皮肤 - 颅骨层。在同样的护理下，通过剥离头部底部直到释放大脑来完成（图3J）。
      注意:这必须非常小心，观察大脑没有被拉向组织层。交替的侧面以去除覆盖大脑的组织。
8. 将温热的琼脂糖（37-40°C）倒入3厘米的培养皿中。
9. 用穿孔勺子拿起大脑，通过将勺子的底部轻拍在干纸巾上来去除多余的液体。将大脑放入琼脂糖培养皿中。
   注意:必须从大脑周围去除尽可能多的液体，以使琼脂糖更好地粘附在组织中。
10. 将装有液体琼脂糖的盘子放在冰上。使用较小的勺子，将琼脂糖混合10秒，以均匀冷却。将大脑操纵到盘子的中间。将大脑水平放置在培养皿中，背侧朝上，确保从各个方向完全覆盖琼脂糖（图3K）。
    注意:一旦放入琼脂糖中，大脑通常会沉到盘子的底部;用小勺子抬起大脑，直到在大脑下方建立1-2毫米的间隙。
11. 对所有大脑重复步骤7.8-7.10。
12. 琼脂糖聚合后，在琼脂糖块顶部加入500μLHBSS-G以防止干燥。然后，用冰块盖住盘子。
    注意:在切片之前将样品放在冰上5分钟，以使脑温达到4°C。

8. 有机切片培养

注意:用70%-96%乙醇清洁振动切片机和周围表面，以避免切片污染。振动工作站的设置（见 材料表）如图 3B所示。

1. 用冷的HBSS-G填充振动缓冲液托盘，用冰填充外托盘，以在整个过程中保持HBSS-G的低温。
2. 使用鼓泡结石在缓冲液托盘中连续供应含碳原的HBSS-G。
3. 使用新鲜的刀片，在大脑周围做一个大切口（〜2 x 2厘米），并去除含有大脑的琼脂糖块，周围有足够的琼脂糖将琼脂糖修剪成一个小矩形块。
   注意:此步骤允许调整块的角度，使大脑的矢状轴垂直于振动板，并且冠状轴平行于叶片对齐。在大脑背侧留下约5毫米的琼脂糖，以便于处理切片。
4. 在试样架的中间滴一小滴快速粘合的无溶剂超级胶水，并扩散到将覆盖琼脂糖块底部的区域。
5. 轻轻拿起琼脂糖块，用薄纸擦干底部。将块放在标本架的胶合区域上，将大脑的喙侧向上。将试样架放在冰上，让胶水干燥1分钟。
6. 胶水干燥后，将试样支架放入缓冲盘中。
7. 以15°的角度切成冠状切片的大脑。
   注意:切片的厚度可能因应用而异。在这里，大脑被切成150μm的厚度。将振动切片机速度设置为1.0-1.5 mm / s，用于修剪顶部多余的琼脂糖并修剪嗅球。将切割速度降低到 0.5 mm/s，用于收集皮质切片进行分析。大多数振动切片机可以暂停以收集每个切片。如果切片质量下降或组织从琼脂糖中分离，降低切割速度或更换振动刀片可能会有所帮助。
8. 使用干净的刮刀，收集脑切片并将其放在聚四氟乙烯（PTFE）膜上，使用石蜡（最多五个脑切片/膜）固定在35毫米玻璃底培养皿中（图3L-M）。
   注意:使用蜡将PTFE膜固定在35毫米玻璃底培养皿内。这将在添加切片培养基时以及在成像过程中稳定膜。
9. 使用200μL移液器，从PTFE膜上的切片周围除去多余的HBSS-G，使切片半干燥。
10. 将500μL切片培养基（预热至35°C）直接加入PTFE膜下的空间。
    注意:添加培养基时，膜下不得形成气泡。这将使整个或部分切片没有媒体交换。在培养中或每次成像后每2天更换200μL培养基。
11. 将切片在35°C下用5%CO_2孵育。

9. 免疫组化

1. 每道菜用1毫升4%多聚甲醛（PFA）固定切片 - 补充4%蔗糖。在室温下孵育30分钟。
   注意:处理PFA时，请穿戴实验室外套和手套。在化学罩下执行固定步骤，并适当处理PFA废物。
2. 用300μL PBS洗涤切片两次5分钟。将切片转移到24孔板中。
   注意:在此阶段可以暂停实验。将PBS-NaN₃ 加入切片中并储存在4°C下。 NaN₃ 是一种有毒化合物;使用溶液处理溶液时，请穿上实验室外套和手套。步骤9.3-9.10应在轨道振荡器中进行。
3. 用300μL0.1M甘氨酸在4°C下淬灭切片过夜。
4. 用PBS在RT 3x下洗出甘氨酸10分钟。
5. 用300μLPBS-T在室温下渗透切片2小时。
6. 在室温下使用PBS-T中的10%山羊血清进行阻断2小时。
7. 加入300μL一抗（稀释度为1:200的抗维门汀抗体;见 材料表）在4°C下在PBS-T溶液中用10%山羊血清稀释过夜。
   注意:在步骤9.8-9.12中，切片受到光保护以防止荧光损失。
8. 用PBS在RT 3x下洗涤一抗20分钟。
   注意:使用PBS代替PBS-T来冲洗Triton X-100。
9. 在PBS中加入300μL二抗（Alexa Fluor 488或647，稀释度为1:400;参见 材料表）在PBS中室温2小时。
   注意:在以1:10，000的稀释度去除二抗后立即加入DAPI5分钟。
10. 用PBS在RT 3x下洗涤二抗20分钟。用蒸馏水洗涤2次1分钟。
11. 使用细刷将切片转移到载玻片中，然后在30°C下干燥20分钟。
12. 使用水性镶样介质安装切片。将载玻片保持在室温下过夜，以便对装载介质进行整理。

10. 成像采集

注意:无论DNA递送方法（IUE或EUE），切片都在同一发育年龄范围内（E17.5-E18.5）进行分析。IUE允许神经元祖细胞 在体内分裂和发育两天。另一方面，EUE允许跟踪早期发育事件。

1. 打开腔室培养箱并将其设置为35°C和5%CO₂ - 理想情况下在成像前4小时 - 以使显微镜组件在35°C下平衡。
2. 对于切片的深度成像，使用水浸物镜来减少组织和物镜之间折射率的不匹配。
   注:此处使用超分辨率成像模式。通过PTFE膜成像需要具有长工作距离（〜1 mm）的物镜。如果无法获得长工作距离物镜，则可以将切片转移到8孔玻璃底培养皿中。要转移切片，将1mL切片培养基加入膜顶部，然后使用刮刀提起切片并将其转移到含有200μL培养基的孔中。使用 1 mL 移液器吸头去除多余的培养基，使切片半干燥。
3. 对于轴突生长成像，定位皮质中细胞密度低至中等的区域。为了成像生长锥动力学，将生长锥定位在皮质的中间区域或室下区域。
4. 在图像处理软件中定义 z 轴堆栈大小（请参见 材料表）。对于大型 z 堆栈中的轴突生长，请将步长设置为 2 μm。对于较小 z 堆叠中的生长锥，将步长设置为 1 μm。
   注意:始终考虑生长锥和轴突通过 x、y 和 z 平面的潜在移动。轴突在有机细胞培养物中的生长速度远高于 体外 培养物。在这里，大约80μm的z堆栈来成像轴突生长就足够了。对于生长锥动力学，约6 μm的z-stack就足够了。
5. 对于较大区域内神经元的轴突生长成像，请定义图块扫描。
6. 使用尽可能低的激光功率，以最大限度地减少采集过程中漂白生长锥的机会。
7. 对于成像轴突生长，获取延时2小时，间隔5分钟。对于成像生长锥动力学，获取延时2-5分钟，间隔2.5-3秒。

11. 数据分析

1. 使用Kymographs测量轴突生长的速度
   1. 在斐济¹⁴ 中打开图像文件，通过 文件>打开 并选择图像。
   2. >Z 投影>最大强度投影，获得通过 图像>堆栈的延时的最大强度投影。
   3. 通过延时摄影并找到一个不断增长的轴突。
   4. 找到后，在不断增长的轴突上画一条线。从第一帧中轴突的尖端开始，并跟随轴突完成整个延时摄影。
   5. 使用插件 KymoResliceWide生成一个kymograph。
   6. 通过转到 图像>属性来设置kymograph的比例。在 "像素宽度" 中设置以 μm 为单位的距离，在" 像素高度"中以 s 或 min 为单位设置时间。
   7. 转到 分析>度量值。
      注意:将给出相对于 x 轴的角度。
   8. 通过在以下等式中替换角度来计算轴突生长的速度:电子表格中的 SIN（RADIANS（θ））/COS（RADIANS（θ））。
2. 使用图像分析软件测量生长锥的体积（参见 材料表）。
   1. 在图像分析软件中通过 "文件>打开"打开 图像文件，然后选择感兴趣的文件。
   2. 选择" 添加新曲面" 向导。
      注意:左下角将出现一个部分，其中包含手动编辑的六个步骤。
   3. 在步骤 1 中 - 在 算法设置下 - 选择 仅分割感兴趣的区域。在步骤 2 中，裁剪框架以适合所有框架中的整个生长锥。
   4. 在步骤 3 中将阈值保持为 "绝对强度 "，并确保在步骤 4 中对整个生长锥区域进行阈值。
   5. 在步骤 5 中，选择"过滤器类型"下的体素数 lmg = 1。
      注意:在最后一步中，可以创建多个测量集。在这里，只为体积创建了一个测量值。
   6. 选择" 执行 "按钮以执行所有创建步骤并终止 "添加新曲面向导"。
   7. 在向导窗口顶部的统计信息选项卡中，选择详细选项卡下的特定值和交易量。

结果

示出了用所述方法工作流程获得的代表性结果。在本演示中使用了E15.5小鼠，尽管该方案很容易适应从E11到E17晚期的几乎所有胚胎年龄。在该协议中，宫外电穿孔（EUE;图2A，2C-I）或在子宫电穿孔（IUE;图2B，C和2J-Q）用于将质粒递送到外侧脑室衬里的祖细胞神经元中。这些祖细胞是未来皮质投射神经元（CPN）^{的来源15，16}。制备质粒混合物以驱动膜靶向（Lyn）-mNeonGreen（图1A）或LifeAct增强（E）GFP（图1B）的稀疏神经元特异性表达，以分别评估生长锥中的整体行为和肌动蛋白动力学。此外，还包括旨在用turbo（t）-RFP或zoanthus sp.（Zs）绿色荧光蛋白（ZsGreen）标记单个神经元的质粒混合物（图1C）。这有助于监测来自独立相邻神经元的生长锥行为。

从电穿孔胚胎中解剖大脑是一个关键步骤，需要仔细进行以获得高质量的切片，从而保留天然的大脑结构。事先制备解剖器械和振动切片机并仔细乙醇灭菌（图3A，B）。接下来，仔细解剖电穿孔胚胎的头部并提取大脑。在这里，显示了从E15（图3C-F）和E12.5（图3G-J）处进行EUE的胚胎的代表性大脑解剖。将大脑立即包裹在琼脂糖基质中，切片，并放置在底部玻璃培养皿内的PTFE膜插入物上进行孵育（图3K-M）。

脑切片的健康状况是控制以确保可靠结果的重要点。每天对任何污染物进行目视检查。此外，一旦培养完成，脑切片被固定并进行免疫组化。在这里，4'，6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI）用于控制整体细胞组织和维门汀染色以揭示神经胶质组织;特别是径向神经胶质细胞（RG）支架。通常，从IUE或EUE衍生的成功培养的脑切片显示出DAPI和具有顶端导向pial接触过程的某种有组织的RG阵列¹⁷ 所揭示的正常细胞分布（分别为图4A，B）。偶尔，在培养的脑切片中观察到RG支架的显着紊乱，特别是在EUE电穿孔衍生的那些中（图4C）。具有极度无序RG支架的脑切片显示神经元迁移受损和轴突生长缺陷（未显示）。因此，控制RG支架是一种简单的培养后方法，可以对从可靠的脑切片获得的数据进行分类。

来自IUE或EUE的脑切片与Lyn-mNeonGreen表达质粒混合物导致类似的稀疏神经元标记。以表达Lyn-mNeonGreen及其生长锥体的动态行为为示例显示一个代表性的金字塔CPN（图5A 和 补充视频1， 左上角）。此外，使用表达肌动蛋白探针的质粒标记神经元，以 原位 分析轴突生长锥的肌动蛋白动力学（图5B 和 补充视频1， 左下角）。还使用双Cre / Dre荧光团表达质粒设计进行 原位 实验（图1C 和 补充视频1，右）。该质粒中的tRFP或ZsGreen荧光团可以分别由邻近神经元中的Dre或Cre重组酶特异性和单独激活（图5C）。该实验阵容允许并排分析来自具有相邻修饰神经元的控制神经元的生长锥（任何给定的功能损失或增益）。这规避了因使用不同切片来测试控制和实验条件而产生的可变性。

分析从记录的电影中生成的Kymographs，从中可以很容易地获得动态生长参数，例如随时间推移的突出活动和生长长度（图6A）。请注意，对延时时间分辨率进行简单调整，可以测量轴突伸长速度2小时（图6A）。此外，生长锥体积随时间的变化 - 一般生长锥动态活动的度量 - 可以很容易地获得，在这种情况下使用许可软件（图6B 和 图6E，F）。这可用于评估肌动蛋白跑步机的速度以及生长锥探索活动期间丝状体/薄片的平衡。

图1:方案中使用的质粒方案。 （A）pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen。（B） p-Tub-α-1-LifeAct-GFP.（C） pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA.有关质粒组分和荧光基团来源的相关信息可在包装盒中找到。 请点击此处查看此图的大图。

图2:E15.5小鼠的子宫 外 和 子宫 内电穿孔的工作流程。 （一）建立 宫外 电穿孔手术站。（二）建立 子宫 内电穿孔手术站。（C）子宫角拉到麻醉小鼠腹腔外。（D）从子宫袋中提取胚胎。（E） 通过 对角切口完全切除脊髓横断进行胚胎处死;请注意，避免了斩首。（F）将胚胎置于支架中，并将DNA / Fast Green混合物注射到左心室外侧室中。（G，H）将胚胎的头部置于铂镊子电极之间，阴极（红色箭头）以60°角在皮层上。（I）将胚胎的手臂（黑色箭头）放置在支架外，以防止在手术过程中胚胎滑动。（J）胚胎在子宫袋内旋转以暴露头部。（K，L）通过子宫壁将DNA /Fast Green混合物注射到胚胎的侧脑室中。（M）将胚胎的头部置于铂镊子电极之间，阴极（红色箭头）以60°角在皮质上。（N） 通过 运行锁定缝合线缝合肌肉切口。（O） 通过 中断缝合缝合的皮肤切口。（P）使用手术伤口夹固定伤口并使用betadine进行消毒。（Q）将小鼠置于具有远红外加热光的回收笼中。 请点击此处查看此图的大图。

图3:提取E15.5和E12.5脑和有机结构切片培养程序。 （A）用于大脑提取程序的工具。（二）设立有机培养站。（C-F）提取E15.5脑。（G-J）提取E12.5脑。虚线突出显示切口的位置。红色箭头指出了用镊子拉动的方向。（K）将大脑嵌入含有3%低熔度琼脂糖的3厘米培养皿中，在大脑下方留下1-2毫米琼脂糖间距间隙。（L）收集150μm的脑切片。（M）将脑切片放置在PTFE膜上，该插入物使用石蜡膜固定在35毫米培养皿中（蓝色箭头）。红星标记表示从振动切片机（L）收集的给定脑切片并将其转移到PTFE膜（M）。请点击此处查看此图的大图。

图4:健康有机钅型切片中保守的桡骨神经胶质细胞结构。 E17.5脑切片的共聚焦图像显示RG阵列（vimentin;绿色）和整体细胞组织（DAPI;洋红色），遵循IUE（A）和EUE（B，C）。请注意 RG 阵列中偶尔可能由 EUE （C） 引起的强烈干扰。放大倍率对应于主图中的红色虚线框:比例尺，10 μm 。请点击此处查看此图的放大版本。

图5:急性有机切片中生长锥动力学 的原位 可视化。 （A，B）神经元及其相应的生长锥分别用Lyn-mNeonGreen和LifeAct-GFP标记。红星标记表达林恩-mNeonGreen神经元的生长锥。蓝色星号标记生命Act-GFP表达神经元的生长锥。（C）用含有tRFP（洋红色）和ZsGreen（绿色）的双质粒系统标记的相邻神经元及其相应的生长锥。成像的生长锥（右）在捕获的帧（左）之外，在获得生长锥延时后不久获得;比例尺，5 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图6:轴突生长速度和生长锥体积的分析。（A）表达Lyn-mNeonGreen的神经元（顶部）及其相应的Kymograph（下图）上使用ImageJ生成的轴突示踪。（B）使用图像分析软件重建生长锥的z-stack视频（上图）和使用表面测量工具突出显示的相同生长锥（下图）。（C）显示几个轴突的生长速度随时间变化的图表。（D）轴突的平均生长速度在（C）中量化。（E）显示生长锥体积随时间变化的图形。（F） 生长锥的平均体积在（E）中量化;比例尺，5 μm。请点击此处查看此图的大图。

图7:锥体皮质神经元的径向迁移和神经元极化。 图示了发育中的锥体皮质神经元（粉红色）从生发室区（VZ）向软脑膜表面放射状迁移。在径向神经胶质细胞过程（灰色）的指导下，迁移的极化神经元建立了一个领先的过程，即未来的树突，以及尾随过程，即未来的轴突，该过程继续向下延伸到中间区（IZ）。红色虚线框表示对生长锥进行成像的皮质区域。特别是在IZ，室下区（SVZ）或连接轴突束（绿色）中。该插图是使用基于 Web 的工具 BioRender.com 创建的。 请点击此处查看此图的大图。

质粒	浓度（微克/微升）	预期用途
pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen	0.25	膜靶向蛋白（Lyn）的标记
+	+
p-浴缸-α-1-iCre	0.08
p-Tub-α-1-LifeAct-GFP	0.125	生长锥中的丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）标记
pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen	1	独立标记两个相邻神经元群体
+	+
p-浴缸-α-1-iCre	0.004
+	+
p-浴缸-α-1-肾	0.2

表1:议定书中使用的质粒清单。 每种利用质粒的名称、浓度和预期用途。

补充视频1:急性有机细胞切片中生长锥动力学的原位可视化。用Lyn-mNeonGreen（左上角）和LifeAct-GFP（左下角）标记的生长锥的动力学。相邻的生长锥体用含有tRFP（洋红色;右上）和ZsGreen（绿色;右下角）的双质粒系统进行差异标记。成像间隔，2.5秒。比例尺，5 μm。请点击此处下载此文件。

讨论

生长锥如何感知和响应周围环境以协调轴突同时延伸和引导仍然是一个有争议的问题^3，18。2D底物的开创性研究提供了对在轴突形成，生长和导航期间产生驱动生长锥动力学的力的基本分子机制的一瞥^{2，10，11，12，19}。最近，对3D矩阵的研究表明，第三维对生长锥的行为有多大影响，从而对轴突增长^8，9有多大影响。然而，指导 体内 生长锥动力学的复杂机制仍有待彻底研究。

来自IUE或EUE大脑的有机细胞切片培养物的制备被广泛使用并有充分的记录。它已成为一个黄金标准，使科学家能够深入了解活脑组织中神经元的发育和行为^20，21。事实上，该技术已成功与各种高分辨率成像技术结合使用，以 原位可视化特定的分子过程和形态学事件。这样的研究包括但不限于轴突形成和延伸^19，22，皮质神经元迁移^{19，22，23，24}，中心体动力学^25，26，微管动力学²⁷，以及突触前和突触后区室^{的功能动力学28，29}。

该协议解决了实验神经生物学中的空白，可视化了 原位发育皮质神经元的生长锥动力学，在 离体 急性脑切片培养物中，以及分析所获得数据的工具。

使用急性脑切片培养物来建立该方案，因为它们（1）通过一些练习，易于产生;（2）提供一个可访问的系统来研究嵌入在准完全生理环境中的生长锥，但足够透明以允许高分辨率活细胞成像;（3）可与其使用无数转基因小鼠系扩展使用;（4）与IUE或EUE结合使用，提供几乎无限的潜力，以提供分子工具，以评估在功能状态的丧失/增益下体内生长锥和轴突的性能，以及荧光报告基因和细胞骨架探针。

在EUE和IUE的背景下描述了这种方法。虽然EUE仍然是一种高度可靠的方法，但与使用IUE作为递送方法获得的脑切片相比，显示无序RG网络的发生率增加（图4C）。RG阵列中的干扰强烈影响神经元迁移和轴突伸长率^{模式30，31}。这些是关键参数，用于预测在给定时间在何处查找轴突以进行分析以及它们正在导航的环境类型。具有明显破坏RG网络的脑切片通常具有受损的皮质神经元分层。这反过来又会产生具有混沌轨迹的轴突。因此，强烈建议控制RG网络的结构完整性。有趣的是，结构完整性差与胚胎大脑年龄的增长有关。事实上，在年轻的E12.5-E13.5胚胎中通常没有观察到这种效应¹⁹。

目前的协议是彻底和直接的。然而，在一些关键步骤中，必须特别注意和注意以获得最佳结果。这些已经在方案中明确指出，包括（1）调整电穿孔中使用的DNA量以获得稀疏标记;（2）避免在拔脑过程中造成损伤;（3）在脑套管过程中控制琼脂糖的温度;（4）排除琼脂糖对特定年龄大脑的理想百分比;（5）荧光基团的选择，其经验如下。在方案优化期间，测试了活细胞 原位成像中 几种荧光基团的性能。该方案选择单体GFP变体EGFP和NeonGreen用于制备LifeAct和Lyn标记的质粒（图5A，B）。此外，RFP变体mScarlet经过测试，发现非常适合这种设置（未显示数据）。还测试了多聚体tRFP（二聚体）和ZsGreen（四聚体）（图5C 和 补充视频1， 右）。当该方法需要在DNA递送后快速生成荧光信号时，建议使用这些快速折叠的超亮荧光团。

使用切片培养物的常见做法是利用来自不同大脑的切片来测试控制和实验条件。这代表了不需要的可变性的固有来源。在这里，使用了一种表达系统，该系统可以独立修饰相邻神经元和报告基因的表达以进行识别。请注意，在该演示（图5C）中，表达任何一种荧光团的神经元之间没有差异。然而，作为一个例子，这样的质粒混合物与含有Cre敏感基因的转基因小鼠系相结合，将标记有tRFP（Dre敏感）神经元，这些神经元仍然是野生型的。相比之下，ZsGreen（也是Cre-sensitive）将标记重组神经元。因此，两种不同基因型的生长锥体，也可能是表型，可以在同一个大脑切片中同时并排研究。

用于分析的轴突和生长锥的定位是一个重要的考虑因素。皮质神经元极化，同时从心室区（VZ）向皮质板（CP）放射状迁移。在这个过程中，神经元形成一个引导过程（未来的树突）和一个尾随过程，该过程将成为轴突，最终在中间区（IZ）中加入开创性的轴突，建立轴突束³²。因此，为了捕获轴突生长锥，在IZ中的轴突纤维上进行成像，包括离开CP的轴突和已经与轴突束相关的早期生成的轴突;或者最终，在穿过IZ并延伸到其下方的光纤中（图7）。

该协议使得对组织结构切片内的神经元进行超分辨率成像成为可能。从历史上看，光散射是成像厚标本时面临的一个重大问题。在过去的二十年中，光学技术的广泛进步使厚标本的成像成为可能。在这里，使用长工作距离物镜来更好地可视化较小的结构，例如生长锥。不可避免的是，该协议不会捕获更详细的事件，例如逆行肌动蛋白流或微管动力学。长工作距离物镜需要较低的数值孔径（NA），以保留来自厚切片的信息。但是，也可以调整该协议以用于更短工作距离的目标。这需要将切片平稳地转移到玻璃底培养皿中，以保持结构完整性。然而，由于气体交换的损失，使用这种方法导致存活期缩短-〜15小时（数据未显示）。与 2D 培养物不同，3D 中的生长锥占据更大的体积，并且需要在 z 轴上进行运动伪影补偿。为了提高对详细事件进行成像的能力，必须利用现代共聚焦技术。因此，建议使用快速扫描的z轴堆叠电机，例如高灵敏度共聚焦显微镜³³上可用的z-Galvo。

值得注意的是，该协议存在三个主要限制。首先，在 体内控制任何给定质粒的表达水平/表达细胞数量通常具有挑战性。这引入了所有切片之间的可变性，即使在保持相同的质粒浓度时也是如此。因此，在所用表达载体中调节元件的选择必须谨慎地预先确定。其次，使用膜插入物对详细事件进行成像目前尚不可行。这第二个限制可以通过上一段所建议的方法更新来克服。最后，生长锥具有高度光敏性，可以迅速变成光漂白。因此，频繁成像生长锥细胞，使用激光扫描显微镜短短5分钟，通常可以使生长锥塌陷。在这点上，光片显微镜产生的装置的新进展可以适应于脑切片³⁴的长期成像。

这种类似的协议被设想为开辟新的研究途径，从而更好地了解生长锥体阅读和应对复杂的 体内 环境所需的条件，更重要的是，解开这种复杂相互作用的机制。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adson Forceps	Fine Science Tools	11006-12
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21202	Goat Anti-Mouse
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Goat Anti-Mouse
Anti-Vimentin antibody	sigma-Aldrich	V2258-.2ML	Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Betadine	B. Braun	3864154
Biozym Sieve GP Agarose	Biozyme	850080
Braunol, Sprühflasche	B. Braun	3864073
Buprenorphine (Temgesic)	GEHE Pharma	345928
DAPI	sigma-Aldrich	D9542
DMZ unevirsal electrode puller	Zeitz	NA
Electric razor	Andes	NA	ProClip UltraEdge Super 2-Speed model
Enrofloxacin (Baytril)	Bayer	3543238	2,5% (wt/vol)
Eppendorf microloader pipette tips	FischerScientific	10289651
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G	Dye content ≥ 85 %
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	10500064
Fiji 2.1.0	NIH	NA	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-09	ToughCut/Straight/9cm
FluoroDish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD5040-100
Fluoromount Aqueous Mounting Medium	sigma-Aldrich	F4680-25ML
Glucose	MedPex	3705391	5%
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
HBSS	Life Technologies	14025092	calcium, magnesium, no phenol red
Horse serum	Pan-Biotech	P30-0711
Imaris 9.7.2	Bitplane	NA	https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists
Isoflurane	Virbac	NA
Isotonic saline solution	B. Braun	8609261	0.90%
Leica VT1200 S vibratome	Leica	14048142066
LSM 880 with Airyscan	Zeiss	NA
Metacam	Venusberg Apotheke	8890217	5 mg/ml
Mice	Janvier Labs	NA	C57BL/6JRj
Micro-Adson Forceps	Fine Science Tools	11018-12
Micropipette Storage Jar	World Precision Instruments	E210	16.16.27
Microsoft Excel	Microsoft	NA	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab
Millicell Cell Culture Insert	EMD Millipore	PICM0RG50	30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm
Moria Perforated Spoons	Fine Science Tools	10370-18
Moria Spoon	Fine Science Tools	10321-08
Neurobasal Medium, minus phenol red	ThermoFisher Scientific	12348017
Neuropan-2 supplement	Pan-Biotech	P07-11010
Normal goat serum	Abcam	ab138478
Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors	Fine Science Tools	12002-12
p-Tub-alpha-1-Dre	Addgene	133925
p-Tub-alpha-1-iCre	Addgene	133924
p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP	Addgene	175437
Parafilm	VWR	52858-000
Paraformaldehyde	sigma-Aldrich	P6148
PBS	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK
pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen	Addgene	175438
pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen	Addgene	175257
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
PicoNozzle Kit v2	World Precision Instruments	5430-ALL
Platinum Tweezertrodes	Harvard Apparatus	45-0487	1 mm / 3 mm
QIAGEN Maxi kit	QIAGEN	12162
Reflex wound closure Clip	World Precision Instruments	500344-10	7 mm
Sekundenkleber Pattex Mini Trio	Lyreco	4722659
Square wave electroporation system ECM830	Harvard Apparatus	W3 45-0052
Sterile gauze	Braun Askina	9031216
Sterile lubricant eye ointment	Bayer Vital	PZN1578675
Sterile surgical gloves	Sempermed	14C0451
Sucrose	Roth	4621.2
Supramid 5-0 surgical silk sutures	B. Braun	NA
Thin-wall glass capillaries	World Precision Instruments	TW100-4
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
µ-Slide 8 Well Glass Bottom	Ibidi	80827