一种新生儿BALB/c坏死性小肠结肠炎小鼠模型

摘要

坏死性小肠结肠炎 （NEC） 是最严重的胃肠道 （GI） 疾病，常发生于早产儿，尤其是出生体重极低的婴儿，死亡率高且发病机制不明。NEC的病因可能与炎症性免疫调节系统异常有关。NEC动物模型是NEC疾病免疫研究不可或缺的工具。NEC动物模型通常使用C57BL / 6J新生小鼠;BALB / c新生小鼠很少使用。相关研究表明，当小鼠被感染时，与C57BL / 6J小鼠相比，BalB / c小鼠的Th2细胞分化占主导地位。研究表明，NEC的发生和发展与T辅助2型（Th2）细胞的增加有关，并且通常伴有感染。因此，本研究使用新生BALB / c小鼠诱导NEC模型，其临床特征和肠道病理变化与NEC患儿相似的NEC模型。需要进一步的研究来确定该动物模型是否可用于研究NEC中的Th2细胞反应。

摘要

坏死性小肠结肠炎 （NEC） 是最严重的胃肠道 （GI） 疾病，常发生于早产儿，尤其是出生体重极低的婴儿，死亡率高且发病机制不明。NEC的病因可能与炎症性免疫调节系统异常有关。NEC动物模型是NEC疾病免疫研究不可或缺的工具。NEC动物模型通常使用C57BL / 6J新生小鼠;BALB / c新生小鼠很少使用。相关研究表明，当小鼠被感染时，与C57BL / 6J小鼠相比，BalB / c小鼠的Th2细胞分化占主导地位。研究表明，NEC的发生和发展与T辅助2型（Th2）细胞的增加有关，并且通常伴有感染。因此，本研究使用新生BALB / c小鼠诱导NEC模型，其临床特征和肠道病理变化与NEC患儿相似的NEC模型。需要进一步的研究来确定该动物模型是否可用于研究NEC中的Th2细胞反应。

引言

坏死性小肠结肠炎 （NEC） 是最严重的胃肠道 （GI） 疾病，见于大多数早产儿 （>90%），尤其是出生体重极低 （VLBW） 的早产儿 ¹。在VLBW婴儿中，该疾病的发病率范围为10%至12%，被诊断患有NEC的儿童的死亡率在20%至30%之间^2，3。NEC的病因可能与黏膜损伤、致病菌侵袭和肠道进食有关，可导致易感宿主出现炎症反应和肠道损伤诱导³。NEC的发病机制尚不清楚。相关研究表明，患儿的免疫反应异常，遗传易感性、微血管张力、肠道细菌变化可能在疾病中发挥重要作用³。

NEC动物模型是NEC发病机制研究不可或缺的工具。用于NEC模型的动物种类是猪，大鼠和小鼠。然而，由于妊娠期长、生长周期长、成本高，近年来，猪一直不是NEC模型的首选，已被大鼠或小鼠取代⁴。由于不同小鼠品系的免疫背景存在差异⁵，不同的研究需要使用不同的小鼠品系来建立NEC动物模型。BALB / C小鼠具有重要特征;当它们被感染或应对外部损伤时，小鼠感染期间TH2细胞的极化明显强于其他小鼠品系^6，7，8。T辅助细胞在NEC的发生和进展中起着至关重要的作用，特别是TH2细胞的发育^{3，9，10，11}。因此，本研究使用BALB/ c小鼠建立了NEC模型，这可能对T细胞的NEC疾病研究有所帮助。

研究方案

本研究获得广州市妇女儿童医学中心医学伦理委员会（编号:174A01）和广州恒源生物科学实验动物中心动物伦理委员会（IACUC-G160100）的批准。所有动物都在同一房间内在特定的无病原体（SPF）环境中繁殖，并在常规环境中进行实验。用于繁殖的小鼠年龄为7-8周龄;第4天将诱导NEC（n = 72）的小鼠与大坝分离，将大坝（n = 14）保存在原始笼中并护理对照（Cont.）组小鼠（n = 24）。

1. 试剂和设备的制备

1. 以相应的比例制备BALB / c小鼠的牛奶替代品（早产儿奶粉:山羊奶粉= 2:1）。
   注:配方奶的最终营养成分¹² 如 表1所示。
2. LPS溶液（2.5毫克/毫升）
   1. 将总共10mgLPS粉末溶解在4mL无菌双蒸馏水中，充分混合，并在等分后储存在-20°C的冰箱中。
      注意:LPS溶液在2-8°C的黑暗中储存以立即使用，或在-20°C下长期储存。

2.诱导新生儿BALB / c小鼠坏死性小肠结肠炎

1. 喂养新生小鼠。
   1. 将新生小鼠与大坝放在同一个笼子里，在第0-4天由大坝喂养。
   2. 在第4天的晚上（当新生小鼠称重2.5-3g时），将NEC组中的新生小鼠从大坝中分离出来诱导NEC，将它们保存在动物培养箱中，并用配方奶粉喂养它们。但是，Cont.组被允许留在大坝上并由大坝喂养。
      注意:与大坝分离的新生小鼠必须在培养箱中饲养，因为它们的体温调节较弱。
2. 将强饲管浸泡在75%酒精容器中1-2分钟，然后在干净的双蒸馏水中洗涤两次，以准备强饲管。
   注意:为了避免小鼠之间的交叉污染，必须在喂食每只小鼠后进行上述过程。
3. 诱导 NEC 模型。
   1. 第4天将新生小鼠从大坝中取出，禁食一晚。
   2. 用LPS（一次20-30μL）饲化小鼠，并在第5天用配方奶粉喂养它们（一次40-50μL）。
   3. 从第5天开始，将小鼠置于缺氧 - 再氧 - 冷 - 休克循环中，每天两次，持续5天。将小鼠置于5%_O2 的缺氧装置中90秒，然后重新氧合3分钟;重复此过程五次。接下来，将小鼠置于4°C环境中15分钟，然后将其转移到培养箱中。感应过程见 图1A、B 。
      注意:缺氧 - 再氧合 - 冷刺激的循环在早上进行一次，下午进行一次。在容器中制备5%_O2 和95%_N2 的混合物，并用氧检测器测量浓度。
4. 密切观察所有小鼠，每天称量，记录诱导期间小鼠的存活情况，并记录粪便特征（有或没有粘性粪便/血便）。
   注:已建立的 NEC 型号持续 5 天。
5. 在第10天或更早的时候，当小鼠表现出NEC症状（肠梗阻，便血，腹泻）¹³时，通过用异氟醚吸入麻醉对小鼠实施安乐死，然后立即收集肠道组织。不要从自发死亡的小鼠身上收集组织。
   注意:在这项研究中，当小鼠显示全身的便血和发绀时，小鼠安乐死的终点是合适的。

3. 加瓦老鼠

1. 固定鼠标头，右手握住胃管。从小鼠嘴的左角插入胃管。
   注意:将头部用食指固定在鼠标头上，并轻轻地向后和向下按压，以防止鼠标在操作过程中向前弯曲并影响胃管的插入。
2. 慢慢地将管子移动到嘴的中心。将试管插入约2-3厘米后，将40-50μL配方奶粉或20-30μLLPS推入消化道。有关强饲，请参见 图2A，B 。
   注意:一般情况下，胃管顺利插入消化道。如果小鼠具有很强的呕吐反射，则胃管被错误地插入气管。必须轻轻地将胃管拔出，让鼠标休息一段时间，然后再尝试强饲。此外，强饲程序用于在小鼠安乐死之前诱导NEC模型。

4. 收集新鲜肠道组织标本进行苏木精和曙红（H&E）染色

1. 将来自小鼠的新鲜回肠组织浸入10%福尔马林中24小时。
2. 将组织嵌入石蜡中，并将其切成4μm切片。
3. 在二甲苯中解蜡化切片，然后依次在无水乙醇，95%乙醇，80%乙醇，70%乙醇和蒸馏水中再水化，每步浸泡5分钟。用苏木精溶液染色切片5分钟，并在75%酒精中的1%盐酸中区分它们5秒。最后，用曙红溶液染色1分钟。
   注意:用苏木精溶液染色后，必须用乙醇中的1%盐酸分化，以除去过度结合的苏木素溶液和细胞质苏木素染料。1%盐酸的浓度适用于肠道组织。
4. 以40倍放大镜检查肠道组织的组织病理学。

结果

BALB/c小鼠NEC模型由配方奶粉喂养、LPS喂养、缺氧和冷刺激诱导。在诱导期间，观察小鼠的肠道病理学，粪便特征，体重变化和每日生存率。NEC诱导期间小肠的代表性图像;图片中的数字表示肠道病理学评分从0（正常上皮）到4（最严重）（图3A）。NEC组的肠道病理学评分显著高于Cont.组（图3B）。图片中的数字表示从0（形成良好的颗粒）到3（液体粪便）?...

讨论

NEC是新生儿最常见的胃肠道系统急症，发病率和死亡率高，尤其是早产儿^1，2，3。然而，其发病机制尚不清楚。目前认为，黏膜损伤、病原体侵袭和肠内喂养是 ^NEC3 的高危因素。迄今为止，用于NEC模型的动物主要是猪，大鼠和小鼠。大多数研究使用新生儿C57BL / 6小鼠诱导^NEC13，

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	100092683
Goat Milk powder	Petag	71795558417
HE dye solution	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	G1003
Isoflurane	RWD, Shenzhen Reward Life Technology Co., LTD.	R510
LPS	Sigma-Adrich	L2880
Medical oxygen	various	various
Microscope	NIKON	NIKON imaging system (DS-Ri2)
Neutral resin	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	10004160
Paraffin	various	various
Premature baby milk powder	Abbott	57430
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	10023418
1% Hydrochloric acid	various	various
10% Formalin	LEAGENE	DF0110