Un modello murino BALB/c neonatale di enterocolite necrotizzante

Riepilogo

L'enterocolite necrotizzante (NEC) è la malattia gastrointestinale (GI) più grave che si verifica spesso nei neonati prematuri, in particolare nei neonati con peso alla nascita molto basso, con alta mortalità e patogenesi poco chiara. La causa del NEC può essere correlata ad anomalie del sistema immunitario infiammatorio. Un modello animale NEC è uno strumento indispensabile per la ricerca immunitaria sulla malattia NEC. I modelli animali NEC di solito usano topi neonatali C57BL / 6J; I topi neonatali BALB/c sono usati raramente. Studi correlati hanno dimostrato che quando i topi sono infetti, la differenziazione delle cellule Th2 è predominante nei topi BALB / c rispetto ai topi C57BL / 6J. Gli studi hanno suggerito che la presenza e lo sviluppo di NEC sono associati ad un aumento delle cellule T helper di tipo 2 (Th2) e sono generalmente accompagnati da infezione. Pertanto, questo studio ha utilizzato topi BALB/c neonatali per indurre un modello NEC con caratteristiche cliniche e cambiamenti patologici intestinali simili a quelli osservati nei bambini con NEC. Ulteriori studi sono necessari per determinare se questo modello animale potrebbe essere utilizzato per studiare le risposte delle cellule Th2 in NEC.

Abstract

L'enterocolite necrotizzante (NEC) è la malattia gastrointestinale (GI) più grave che si verifica spesso nei neonati prematuri, in particolare nei neonati con peso alla nascita molto basso, con alta mortalità e patogenesi poco chiara. La causa del NEC può essere correlata ad anomalie del sistema immunitario infiammatorio. Un modello animale NEC è uno strumento indispensabile per la ricerca immunitaria sulla malattia NEC. I modelli animali NEC di solito usano topi neonatali C57BL / 6J; I topi neonatali BALB/c sono usati raramente. Studi correlati hanno dimostrato che quando i topi sono infetti, la differenziazione delle cellule Th2 è predominante nei topi BALB / c rispetto ai topi C57BL / 6J. Gli studi hanno suggerito che la presenza e lo sviluppo di NEC sono associati ad un aumento delle cellule T helper di tipo 2 (Th2) e sono generalmente accompagnati da infezione. Pertanto, questo studio ha utilizzato topi BALB/c neonatali per indurre un modello NEC con caratteristiche cliniche e cambiamenti patologici intestinali simili a quelli osservati nei bambini con NEC. Ulteriori studi sono necessari per determinare se questo modello animale potrebbe essere utilizzato per studiare le risposte delle cellule Th2 in NEC.

Introduzione

L'enterocolite necrotizzante (NEC), la più grave malattia gastrointestinale (GI), si verifica nella maggior parte dei neonati prematuri (>90%), in particolare quelli con peso alla nascita molto basso (VLBW)¹. Nei neonati VLBW, l'incidenza della malattia varia dal 10% al 12% e la mortalità dei bambini con diagnosi di NEC è compresa tra il 20% e il 30%^2,3. La causa del NEC può essere correlata a lesioni della mucosa, invasione da parte di batteri patogeni e alimentazione intestinale, che può portare a risposte infiammatorie e all'induzione di lesioni intestinali in ospiti ^sensibili3. La patogenesi del NEC non è chiara. Ricerche pertinenti mostrano che la risposta immunitaria del bambino affetto è anormale e la suscettibilità genetica, la tensione microvascolare e i cambiamenti batterici intestinali possono svolgere un ruolo importante nella ^malattia3.

Il modello animale NEC è uno strumento indispensabile per la ricerca sulla patogenesi del NEC. Le specie animali utilizzate per i modelli NEC sono maiali, ratti e topi. Tuttavia, a causa del lungo periodo di gestazione, dei cicli di crescita e dei costi elevati, negli ultimi anni i suini non sono stati la prima scelta per i modelli NEC e sono stati sostituiti con ratti o ^topi4. Poiché ci sono differenze nel background immunitario di diversi ceppi di ^topo5, diversi studi devono utilizzare diversi ceppi di topi per stabilire modelli animali NEC. I topi BALB/c hanno una caratteristica importante; quando sono infettati o affrontano danni esterni, la polarizzazione delle cellule TH2 durante l'infezione nei topi è significativamente più forte di quella in altri ceppi di topi6,7,8. Le cellule T helper svolgono un ruolo cruciale nella comparsa e nella progressione di NEC, in particolare lo sviluppo di cellule TH23,9,10,11. Pertanto, questo studio ha utilizzato topi BALB / c per stabilire il modello NEC, che potrebbe essere utile per la ricerca sulla malattia NEC sulle cellule T.

Protocollo

Questa ricerca è stata approvata dal Comitato etico medico del Guangzhou Women and Children's Medical Center (n. 174A01) e dal Comitato etico animale del Guangzhou Forevergen Biosciences Laboratory Animal Center (IACUC-G160100). Tutti gli animali sono stati allevati nella stessa stanza in un ambiente specifico privo di agenti patogeni (SPF) e gli esperimenti sono stati condotti in un ambiente convenzionale. I topi utilizzati per l'allevamento avevano 7-8 settimane; i topi per indurre NEC (n = 72) sono stati separati dalla diga il giorno 4, e le dighe (n = 14) sono state tenute nella gabbia originale e allattate i topi del gruppo di controllo (Cont.) (n = 24).

1. Preparazione di reagenti e dispositivi

1. Preparare il sostituto del latte per i topi BALB/c nel rapporto corrispondente (latte prematuro in polvere per bambini: latte di capra in polvere = 2:1).
   NOTA: Le composizioni nutrizionali finali del latte ^{artificiale12} sono riportate nella Tabella 1.
2. Soluzione di LPS (2,5 mg/mL)
   1. Sciogliere un totale di 10 mg di polvere di LPS in 4 ml di acqua distillata sterilizzata, mescolare bene e conservare in frigorifero a -20 °C dopo l'aliquotazione.
      NOTA: la soluzione LPS viene conservata al buio a 2-8 °C per l'uso immediato o a -20 °C per la conservazione a lungo termine.

2. Indurre enterocolite necrotizzante nei topi neonatali BALB/c

1. Dai da mangiare ai topi neonatali.
   1. Tenere i topi neonatali nella stessa gabbia con la diga, allattata dalla diga nei giorni 0-4.
   2. La notte del giorno 4 (quando i topi neonatali pesano 2,5-3 g), separare i topi neonatali nel gruppo NEC dalla diga per indurre NEC, tenerli in un'incubatrice per animali e nutrirli con la formula. Tuttavia, il gruppo Cont. è autorizzato a rimanere e ad essere alimentato dalla diga.
      NOTA: I topi neonatali che sono separati dalla diga devono essere allevati in un'incubatrice a causa della loro debole regolazione della temperatura corporea.
2. Preparare il tubo di gavage immergendolo in contenitori di alcol al 75% per 1-2 minuti e lavarli due volte in acqua pulita e a doppia distillazione.
   NOTA: Per evitare la contaminazione incrociata tra i topi, il processo di cui sopra deve essere eseguito dopo aver alimentato ciascun topo.
3. Indurre il modello NEC.
   1. Prendi i topi neonatali dalla diga il giorno 4 e digiunali per una notte.
   2. Gavage i topi con LPS (20-30 μL alla volta) e nutrirli con la formula il giorno 5 (40-50 μL alla volta).
   3. Dal giorno 5 in poi, sottoporre i topi a un ciclo ipossia-reossigenazione-freddo-shock due volte al giorno per 5 giorni. Posizionare i topi in un dispositivo di ipossia al 5% di _O2 per 90 s e riossigenarli per 3 minuti; ripetere questo processo cinque volte. Quindi, posizionare i topi in un ambiente a 4 ° C per 15 minuti e quindi trasferirli in un'incubatrice. Vedere la Figura 1A,B per il processo di induzione.
      NOTA: Un ciclo di ipossia-reossigenazione-stimolazione del freddo è stato eseguito una volta al mattino e una volta nel pomeriggio. Una miscela di 5% _O2 con 95% _N2 è stata preparata nel contenitore e la concentrazione è stata misurata con un rilevatore di ossigeno.
4. Osservare da vicino tutti i topi, pesarli ogni giorno, registrare la sopravvivenza dei topi durante il periodo di induzione e registrare le caratteristiche delle feci (con o senza feci appiccicose / feci sanguinolente).
   NOTA: il modello NEC stabilito dura 5 giorni.
5. Il giorno 10 o prima, quando i topi mostrano sintomi NEC (ileo, ematochezia, diarrea)¹³, eutanasizzare i topi mediante anestesia per inalazione con isoflurano, quindi raccogliere immediatamente il tessuto intestinale. Non raccogliere tessuti dai topi che sono morti spontaneamente.
   NOTA: In questo studio, il punto finale dell'eutenasia del topo è stato adattato quando il topo ha mostrato ematochezia e cianosi di tutto il corpo.

3. Gavage il mouse

1. Fissare la testa del topo, tenendo il tubo gastrico nella mano destra. Inserire il tubo gastrico dall'angolo sinistro della bocca del mouse.
   NOTA: La testa è stata fissata con l'indice sulla testa del mouse e premuta delicatamente all'indietro e verso il basso per evitare che il mouse si pieghi in avanti durante l'operazione e influenzi l'inserimento del tubo gastrico.
2. Spostare lentamente il tubo al centro della bocca. Dopo aver inserito il tubo di circa 2-3 cm, spingere 40-50 μL di formula o 20-30 μL di LPS nel tratto digestivo. Vedere la Figura 2A,B per il gavage.
   NOTA: In circostanze normali, il tubo gastrico viene inserito nel tratto digestivo senza intoppi. Se il topo ha un forte riflesso di vomito, il tubo gastrico è stato inserito nella trachea per errore. Il tubo gastrico deve essere estratto delicatamente e il topo deve essere lasciato riposare per un po 'prima di tentare di nuovo il gavage. Inoltre, la procedura gavage viene utilizzata per indurre il modello di NEC prima dell'eutanasia dei topi.

4. Raccogliere campioni di tessuto intestinale fresco per la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E)

1. Immergere il tessuto ileo fresco del topo in formalina al 10% per 24 ore.
2. Incorporare i tessuti nella paraffina e tagliarli in sezioni da 4 μm.
3. Deparaffinizzare le sezioni in xilene e reidratarle successivamente in etanolo assoluto, etanolo al 95%, etanolo all'80%, etanolo al 70% e acqua distillata, immergendole per 5 minuti in ogni passaggio. Colorare le sezioni con soluzione di ematossilina per 5 minuti e differenziarle in acido cloridrico all'1% in alcool al 75% per 5 s. Infine, macchiarli con una soluzione di eosina per 1 minuto.
   NOTA: Dopo la colorazione con soluzione di ematossilina, deve essere differenziato con acido cloridrico all'1% in etanolo per rimuovere la soluzione di ematossilina eccessivamente legata e il colorante citoplasmatico di ematossilina. La concentrazione dell'1% di acido cloridrico è adatta per il tessuto intestinale.
4. Esaminare l'istopatologia del tessuto intestinale con ingrandimento 40x.

Risultati

Il modello NEC murino BALB/c è stato indotto dall'alimentazione con formula, dall'alimentazione con LPS, dall'ipossia e dalla stimolazione a freddo. Durante il periodo di induzione, i topi sono stati osservati per patologia intestinale, caratteristiche delle feci, cambiamenti di peso corporeo e sopravvivenza giornaliera. Immagini rappresentative dell'intestino tenue durante l'induzione del NEC; i numeri nella foto rappresentano il punteggio di patologia intestinale da 0 (epitelio normale) a 4 (il più grave) (

Discussione

Il NEC è l'emergenza del sistema gastrointestinale più comune per i neonati, con un'alta incidenza e mortalità, specialmente nei neonati prematuri1,2,3. Tuttavia, la sua patogenesi non è ancora chiara. Attualmente si ritiene che il danno alla mucosa, l'invasione di agenti patogeni e l'alimentazione enterale siano fattori ad alto rischio per ^NEC3. Ad oggi, gli animali utilizzati per il modello NEC sono...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	100092683
Goat Milk powder	Petag	71795558417
HE dye solution	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	G1003
Isoflurane	RWD, Shenzhen Reward Life Technology Co., LTD.	R510
LPS	Sigma-Adrich	L2880
Medical oxygen	various	various
Microscope	NIKON	NIKON imaging system (DS-Ri2)
Neutral resin	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	10004160
Paraffin	various	various
Premature baby milk powder	Abbott	57430
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	10023418
1% Hydrochloric acid	various	various
10% Formalin	LEAGENE	DF0110