괴사 장염의 신생아 BALB/c 마우스 모델

요약

괴사 장염 (NEC)은 미숙아, 특히 매우 낮은 출생 체중 유아에서 자주 발생하는 가장 심각한 위장 (GI) 질병이며 사망률이 높고 불분명한 병인. NEC의 원인은 염증성 면역 규제 시스템 이상과 관련이 있을 수 있습니다. NEC 동물 모델은 NEC 질병 면역 연구를 위한 필수 도구입니다. NEC 동물 모델은 일반적으로 C57BL/6J 신생아 마우스를 사용; BALB/c 신생아 마우스는 거의 사용되지 않습니다. 관련 연구는 마우스가 감염될 때, Th2 세포 분화는 C57BL/6J 마우스에 비해 BALB/c 마우스에서 우세하다는 것을 보여주었습니다. 연구 결과는 NEC의 발생 그리고 발달이 T 도우미 타입 2 (Th2) 세포의 증가와 연관되고 일반적으로 감염을 동반한다는 것을 건의했습니다. 따라서, 본 연구는 신생아 BALB/c 마우스를 사용하여 NEC를 가진 아이들에서 관찰된 것과 유사한 임상 적 특성 및 장 병병리학적 변화를 가진 NEC 모델을 유도하였다. 추가 연구는 이 동물 모형이 NEC에 있는 Th2 세포 반응을 공부하기 위하여 이용될 수 있었다는 것을 결정하기 위하여 보증됩니다.

초록

괴사 장염 (NEC)은 미숙아, 특히 매우 낮은 출생 체중 유아에서 자주 발생하는 가장 심각한 위장 (GI) 질병이며 사망률이 높고 불분명한 병인. NEC의 원인은 염증성 면역 규제 시스템 이상과 관련이 있을 수 있습니다. NEC 동물 모델은 NEC 질병 면역 연구를 위한 필수 도구입니다. NEC 동물 모델은 일반적으로 C57BL/6J 신생아 마우스를 사용; BALB/c 신생아 마우스는 거의 사용되지 않습니다. 관련 연구는 마우스가 감염될 때, Th2 세포 분화는 C57BL/6J 마우스에 비해 BALB/c 마우스에서 우세하다는 것을 보여주었습니다. 연구 결과는 NEC의 발생 그리고 발달이 T 도우미 타입 2 (Th2) 세포의 증가와 연관되고 일반적으로 감염을 동반한다는 것을 건의했습니다. 따라서, 본 연구는 신생아 BALB/c 마우스를 사용하여 NEC를 가진 아이들에서 관찰된 것과 유사한 임상 적 특성 및 장 병병리학적 변화를 가진 NEC 모델을 유도하였다. 추가 연구는 이 동물 모형이 NEC에 있는 Th2 세포 반응을 공부하기 위하여 이용될 수 있었다는 것을 결정하기 위하여 보증됩니다.

서문

가장 심한 위장(GI) 질환인 괴사 장염(NEC)은 대부분의 미숙아(>90%)에서 발생하며, 특히 출생체중(VLBW)¹이 매우 낮은 것으로 발생합니다. VLBW 유아에서는 질병의 부각이 10%에서 12%까지 다양하며 NEC로 진단된 어린이의 사망률은 20%에서 30%^2,3사이입니다. NEC의 원인은 점막 손상, 병원성 박테리아에 의한 침입 및 장 수유와 관련이 있을 수 있으며, 이는 염증 반응및 민감성 호스트에서 장 손상의 유도로 이어질 수 있습니다³. 선관위의 병기는 불분명하다. 관련 연구는 영향을받는 유아의 면역 반응이 비정상이며 유전 적 감수성, 미세 혈관 긴장 및 장 세균 변화가 질병에 중요한 역할을 할 수 있음을 보여줍니다³.

NEC 동물 모델은 NEC의 발병기에 대한 연구를 위한 필수 도구입니다. NEC 모델에 사용되는 동물 종은 돼지, 쥐 및 마우스입니다. 그러나, 긴 임신 기간, 성장 주기 및 높은 비용으로 인해, 최근 몇 년 동안, 돼지는 NEC 모델에 대한 첫 번째 선택이 되지 않았으며 쥐 또는 마우스⁴로 대체되었습니다. 다른 마우스 균주의 면역 배경에 차이가 있기 때문에⁵, 다른 연구는 NEC 동물 모델을 확립하기 위해 마우스의 다른 긴장을 사용할 필요가있다. BALB/c 마우스는 중요한 특징을 가지고 있습니다. 그(것)들이 감염되거나 외부 손상에 대처할 때, 마우스에 있는 감염 도중 TH2 세포의 편광은 마우스의 그밖 긴장에서 보다는 현저하게 더 강하다^6,7,8. T 도우미 세포는 NEC의 발생 및 진행, 특히 TH2 세포의 발달에 중요한 역할을 ^한다3,9,10,11. 따라서, 이 연구는 BALB/c 마우스를 사용하여 NEC 모델을 확립했으며, 이는 T 세포에 대한 NEC 질병 연구에 도움이 될 수 있습니다.

프로토콜

이 연구는 광저우 여성 및 아동 의료 센터의 의료 윤리위원회 (NO. 174A01)와 광저우 포에버겐 생명 과학 실험실 동물 센터 (IACUC-G160100)의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 동물은 특정 병원체없는 (SPF) 환경에서 같은 방에서 사육되었고, 실험은 기존의 환경에서 수행되었다. 사육에 사용되는 마우스는 7-8 주 오래되었습니다. NEC(n=72)를 유도하기 위한 마우스는 4일째 댐에서 분리되었고, 댐(n=14)은 원래 케이지에 보관되어 대조군(Cont.) 그룹 마우스(n=24)를 간호하였다.

1. 시약 및 장치 준비

1. 해당 비율로 BALB/c 마우스용 우유 대용품을 준비합니다(미숙아 분유: 염소 분유 = 2:1).
   참고: 분유¹² 의 최종 영양 조성물은 표 1에 표시됩니다.
2. LPS 용액 (2.5 mg/mL)
   1. 총 10 mg의 LPS 분말을 멸균 된 이중 증류수 4mL에 녹이고 잘 섞고 알리 쿼팅 후 -20 °C의 냉장고에 보관하십시오.
      참고: LPS 용액은 2-8°C의 어둠 속에서 즉시 사용하거나 장기 저장을 위해 -20°C에 저장됩니다.

2. 신생아 BALB/c 마우스에서 괴사성 장염 유도

1. 신생아 쥐에게 먹이를 주면 됩니다.
   1. 신생아 쥐를 댐과 같은 케이지에 보관하고, 0-4일에 댐에서 간호한다.
   2. 4일 밤(신생아마우스의 무게2.5-3g) 황선군에서 신생아마우스를 댐에서 분리하여 NEC를 유도하고, 동물 인큐베이터에 보관하고, 수식으로 공급한다. 그러나 Cont. 그룹은 댐에 머물면서 먹이를 받을 수 있습니다.
      참고: 댐에서 분리된 신생아 마우스는 체온 조절이 약하기 때문에 인큐베이터에서 기르는 것으로 나타났습니다.
2. 75% 알코올 용기에 1-2분 간 담그고 두 번 씻어 내고, 깨끗한 이중 증류수로 두 번 씻습니다.
   참고: 마우스 간의 교차 오염을 피하려면 각 마우스를 공급한 후 위의 과정을 수행해야 합니다.
3. NEC 모델을 유도합니다.
   1. 4일째에 댐에서 신생아 쥐를 데리고 하룻밤을 보내십시오.
   2. LPS(한 번에 20-30 μL)를 가진 마우스를 가리게 하고 5일째(한 번에 40-50 μL)에 수식으로 먹이를 주도록 한다.
   3. 5일째부터 마우스를 저산소증-산소-감기 충격 주기로 5일 동안 하루에 두 번 받습니다. 90 s에 대 한 5% _O2 에 저산소증 장치에 마우스를 배치 하 고 3 분 동안 그들을 재산소; 이 프로세스를 다섯 번 반복합니다. 다음으로, 마우스를 4°C 환경에 15분 동안 배치한 다음 인큐베이터로 옮기습니다. 유도 프로세스의 경우 그림 1A, B 를 참조하십시오.
      참고: 저산소환-재산소-감기 자극의 주기는 아침에 한 번, 오후에 한 번 수행되었다. 5% _O2 의 혼합물과 95% _N2 를 용기에 제조하였고, 농도는 산소 검출기로 측정하였다.
4. 밀접하게 모든 마우스를 관찰, 매일 그들을 무게, 유도 기간 동안 마우스의 생존을 기록하고, 대변 특성을 기록 (또는 끈적 끈적한 발판 / 피 묻은 발판없이).
   참고: 기존 NEC 모델은 5일간 지속됩니다.
5. 10일 또는 그 이전에, 마우스가 NEC 증상(ileus, hematochezia, 설사)¹³을 보일 때, 이소플루란으로 흡입 마취에 의해 마우스를 안락사시키고 즉시 장 조직을 수집한다. 자발적으로 죽은 쥐에서 조직을 수집하지 마십시오.
   참고 : 이 연구에서, 마우스가 전신의 혈토체치아와 치아노증을 표시 할 때 마우스 우테나아의 끝점이 적응되었다.

3. 마우스를 가바게

1. 마우스 머리를 고정하고 위관을 오른손에 고정합니다. 마우스 입의 왼쪽 모서리에서 위관을 삽입합니다.
   참고: 머리는 마우스의 머리에 검지 손가락으로 고정하고 부드럽게 수술 중에 마우스가 앞으로 구부러지고 위관의 삽입에 영향을 미치지 않도록 앞뒤로 그리고 아래쪽으로 눌렀다.
2. 천천히 입의 중심으로 튜브를 이동합니다. 튜브를 약 2-3cm 삽입한 후 40-50 μL의 포뮬러 또는 LPS20-30 μL을 소화관에 밀어 넣습니다. 그림 2A, B 를 참조하십시오.
   참고: 정상적인 상황에서 는 위관이 소화관에 부드럽게 삽입됩니다. 마우스에 강한 구토 반사가있는 경우, 위관은 실수로 기관체에 삽입되었습니다. 위관은 부드럽게 꺼내야 하며 마우스는 다시 gavage를 시도하기 전에 잠시 동안 휴식을 취할 수 있습니다. 또한, 개간 절차는 마우스의 안락사 이전에 NEC의 모델을 유도하는 데 사용된다.

4. 헤마톡시린과 에신(H&E) 염색을 위한 신선한 장 조직 표본 수집

1. 마우스에서 신선한 일루 조직을 10% 포르말린으로 24시간 동안 담가 두는 다.
2. 파라핀에 조직을 삽입하고 4 μm 섹션으로 슬라이스.
3. 절렌의 섹션을 분리하고 절대 에탄올 95%, 에탄올 80%, 에탄올 70%, 증류수로 연속적으로 수분을 공급하여 각 단계에서 5분 동안 담가 둡니다. 혈소클린 용액으로 5분 동안 단면을 염색하고 5초 동안 75%의 알코올로 1% 염산으로 분화합니다. 마지막으로, 1 분 동안 eosin 용액으로 얼룩.
   참고: 헤마톡슬린 용액으로 염색한 후, 지나치게 바운드된 헤마톡시린 용액과 세포질 헤마톡시린 염료를 제거하기 위해 에탄올의 1% 염산으로 분화해야 합니다. 1% 염산의 농도는 장 조직에 적합합니다.
4. 40배율에서 장 조직의 조직 병리학을 검사합니다.

결과

BALB/c 마우스 NEC 모델은 수식 공급, LPS 공급, 저산소증 및 감기 자극에 의해 유도되었다. 유도 기간 동안, 마우스는 장 병리학, 대변 특성, 체중 변화 및 일일 생존을 위해 관찰되었다. NEC 유도 중 소장의 대표적인 이미지; 그림의 숫자는 0(정상 상피)에서 4(가장 심한) 장 병리 점수를 나타낸다(그림 3A). 장 병리학 점수는 CONt. 그룹(그림 3B)보다 NEC 그룹에서 ...

토론

NEC는 신생아를 위한 일반적인 위장 시스템 비상사태입니다, 높은 부각및 사망, 특히 미숙아^1,2,3에서. 그러나, 그것의 병인은 아직도 불분명합니다. 현재 점막 손상, 병원균 침범 및 장내 수유가 ^NEC3의 고위험 요인이라고 여겨지고 있습니다. 현재까지 NEC 모델에 사용되는 동물은 주로 돼지, 쥐 및 마우스입니다....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	100092683
Goat Milk powder	Petag	71795558417
HE dye solution	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	G1003
Isoflurane	RWD, Shenzhen Reward Life Technology Co., LTD.	R510
LPS	Sigma-Adrich	L2880
Medical oxygen	various	various
Microscope	NIKON	NIKON imaging system (DS-Ri2)
Neutral resin	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	10004160
Paraffin	various	various
Premature baby milk powder	Abbott	57430
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	10023418
1% Hydrochloric acid	various	various
10% Formalin	LEAGENE	DF0110