Um modelo de rato BALB/c neonatal de Enterocolite Necrotizante

Resumo

A enterocolite necrosante (NEC) é a doença gastrointestinal (GI) mais grave que ocorre frequentemente em bebês prematuros, especialmente bebês com baixo peso ao nascer, com alta mortalidade e patogênese pouco clara. A causa da NEC pode estar relacionada a anormalidades inflamatórias do sistema de regulação imunológica. Um modelo animal NEC é uma ferramenta indispensável para a pesquisa imunológica da doença NEC. Modelos animais NEC geralmente usam camundongos neonatais C57BL/6J; Os camundongos neonatais BALB/c raramente são usados. Estudos relacionados mostraram que quando os camundongos são infectados, a diferenciação celular Th2 é predominante em camundongos BALB/c em comparação com camundongos C57BL/6J. Estudos sugerem que a ocorrência e o desenvolvimento da NEC estão associados a um aumento nas células auxiliares T tipo 2 (Th2) e são geralmente acompanhados de infecção. Portanto, este estudo utilizou camundongos BALB/c neonatais para induzir um modelo NEC com características clínicas semelhantes e alterações patológicas intestinais observadas em crianças com NEC. Um estudo mais aprofundado é necessário para determinar se esse modelo animal poderia ser usado para estudar respostas de células Th2 na NEC.

Resumo

A enterocolite necrosante (NEC) é a doença gastrointestinal (GI) mais grave que ocorre frequentemente em bebês prematuros, especialmente bebês com baixo peso ao nascer, com alta mortalidade e patogênese pouco clara. A causa da NEC pode estar relacionada a anormalidades inflamatórias do sistema de regulação imunológica. Um modelo animal NEC é uma ferramenta indispensável para a pesquisa imunológica da doença NEC. Modelos animais NEC geralmente usam camundongos neonatais C57BL/6J; Os camundongos neonatais BALB/c raramente são usados. Estudos relacionados mostraram que quando os camundongos são infectados, a diferenciação celular Th2 é predominante em camundongos BALB/c em comparação com camundongos C57BL/6J. Estudos sugerem que a ocorrência e o desenvolvimento da NEC estão associados a um aumento nas células auxiliares T tipo 2 (Th2) e são geralmente acompanhados de infecção. Portanto, este estudo utilizou camundongos BALB/c neonatais para induzir um modelo NEC com características clínicas semelhantes e alterações patológicas intestinais observadas em crianças com NEC. Um estudo mais aprofundado é necessário para determinar se esse modelo animal poderia ser usado para estudar respostas de células Th2 na NEC.

Introdução

A enterocolite necrosante (NEC), a doença gastrointestinal mais grave (GI), ocorre na maioria dos bebês prematuros (>90%), especialmente aqueles com baixo peso ao nascer (VLBW)¹. Em bebês VLBW, a incidência da doença varia de 10% a 12%, e a mortalidade de crianças diagnosticadas com NEC é entre 20% e 30%^2,3. A causa da NEC pode estar relacionada a lesões mucosas, invasão por bactérias patogênicas e alimentação intestinal, o que pode levar a respostas inflamatórias e à indução de lesões intestinais em hospedeiros ^{suscetíveis3}. A patogênese da NEC não está clara. Pesquisas relevantes mostram que a resposta imune do bebê afetado é anormal, e a suscetibilidade genética, tensão microvascular e alterações bacterianas intestinais podem desempenhar papéis importantes na ^doença3.

O modelo animal nec é uma ferramenta indispensável para a pesquisa sobre a patogênese da NEC. As espécies animais utilizadas para modelos NEC são porcos, ratos e camundongos. No entanto, devido ao longo período de gestação, ciclos de crescimento e altos custos, nos últimos anos, os suínos não têm sido a primeira escolha para os modelos nec e foram substituídos por ratos ou ^ratos4. Como há diferenças no fundo imunológico de diferentes cepas de ^camundongos5, diferentes estudos precisam usar diferentes cepas de camundongos para estabelecer modelos animais NEC. Os ratos BALB/c têm uma característica importante; quando estão infectados ou lidam com danos externos, a polarização das células TH2 durante a infecção em camundongos é significativamente mais forte do que em outras cepas de camundongos6,7,8. As células auxiliares T desempenham um papel crucial na ocorrência e progressão da NEC, especialmente no desenvolvimento de células TH23,9,10,11. Portanto, este estudo utilizou camundongos BALB/c para estabelecer o modelo NEC, o que pode ser útil para a pesquisa da doença nec em células T.

Protocolo

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética Médica do Centro Médico da Mulher e da Criança de Guangzhou (Nº 174A01) e pelo Comitê de Ética Animal do Centro animal do Laboratório de Biociências de Guangzhou Forevergen (IACUC-G160100). Todos os animais foram criados na mesma sala em um ambiente específico livre de patógenos (SPF), e experimentos foram realizados em ambiente convencional. Os camundongos utilizados para reprodução tinham de 7 a 8 semanas; os camundongos para induzir NEC (n = 72) foram separados da barragem no dia 4, e as barragens(n=14) foram mantidas na gaiola original e amamentaram os ratos do grupo controle (Cont.) (n=24).

1. Preparação de reagentes e dispositivos

1. Prepare o substituto do leite para os camundongos BALB/c na proporção correspondente (leite em pó prematuro: leite em pó de cabra = 2:1).
   NOTA: As composições nutricionais finais do leite de ^fórmula12 são mostradas na Tabela 1.
2. Solução LPS (2,5 mg/mL)
   1. Dissolva um total de 10 mg de pó LPS em 4 mL de água esterilizada dupla destilada, misture bem e armazene em uma geladeira a -20 °C após a aliquotação.
      NOTA: A solução LPS é armazenada no escuro a 2-8 °C para uso imediato ou a -20 °C para armazenamento a longo prazo.

2. Induzir enterocolite necrosante em camundongos BALB/c neonatais

1. Alimente os ratos neonatais.
   1. Mantenha os camundongos neonatais na mesma gaiola com a represa, amamentados pela represa nos dias 0-4.
   2. Na noite do dia 4 (quando os camundongos neonatais pesam 2,5-3 g), separe os camundongos neonatais do grupo NEC da barragem para induzir nec, mantê-los em uma incubadora animal e alimentá-los com fórmula. No entanto, o grupo Cont. está autorizado a ficar e ser alimentado pela represa.
      NOTA: Os camundongos neonatais separados da barragem devem ser criados em uma incubadora devido à sua fraca regulação da temperatura corporal.
2. Prepare o tubo de gavage, encharcando-o em recipientes de álcool de 75% por 1-2 min e lave-os duas vezes em água limpa e dupla destilada.
   NOTA: Para evitar a contaminação cruzada entre os camundongos, o processo acima deve ser realizado após a alimentação de cada rato.
3. Induzir o modelo NEC.
   1. Pegue os ratos neonatais da represa no dia 4 e acelere-os por uma noite.
   2. Gavage os ratos com LPS (20-30 μL de cada vez) e alimente-os com fórmula no dia 5 (40-50 μL de cada vez).
   3. A partir do dia 5, submia os camundongos a um ciclo de choque frio-de hipoxia-reoxigenação duas vezes por dia durante 5 dias. Coloque os camundongos em um dispositivo de hipóxia a 5% de _O2 para 90 s e reoxigená-los por 3 min; repetir este processo cinco vezes. Em seguida, coloque os ratos em um ambiente de 4 °C por 15 minutos e depois transfira-os para uma incubadora. Consulte a Figura 1A,B para o processo de indução.
      NOTA: Um ciclo de estimulação hipóxia-reoxigenação-fria foi realizado uma vez pela manhã e uma vez à tarde. Uma mistura de 5% de _O2 com 95% _N2 foi preparada no recipiente, e a concentração foi medida com detector de oxigênio.
4. Observe minuciosamente todos os camundongos, pese-os todos os dias, registe os camundongos durante o período de indução e registe as características das fezes (com ou sem fezes pegajosas/fezes ensanguentadas).
   NOTA: O modelo NEC estabelecido dura 5 dias.
5. No dia 10 ou mais cedo, quando os camundongos apresentam sintomas nec (íleo, hematochezia, diarreia)¹³, eutanize os camundongos por anestesia de inalação com isoflurano, depois colete imediatamente o tecido intestinal. Não recolha tecidos dos camundongos que morreram espontaneamente.
   NOTA: Neste estudo, o ponto final da euenasia do rato foi adaptado quando o mouse exibiu hematochezia e cianose de todo o corpo.

3. Gavage o mouse

1. Conserte a cabeça do rato, segurando a sonda gástrica na mão direita. Insira a sonda gástrica do canto esquerdo da boca do mouse.
   NOTA: A cabeça foi fixada com o dedo indicador na cabeça do mouse e gentilmente pressionada para trás e para baixo para evitar que o rato se dobrasse para frente durante a operação e afetasse a inserção da sonda gástrica.
2. Mova lentamente o tubo para o centro da boca. Depois de inserir o tubo aproximadamente 2-3 cm, empurre 40-50 μL de fórmula ou 20-30 μL de LPS no trato digestivo. Veja a Figura 2A,B para o gavage.
   NOTA: Em circunstâncias normais, a sonda gástrica é inserida suavemente no trato digestivo. Se o camundongo tem um forte reflexo de vômito, a sonda gástrica foi inserida na traqueia por engano. A sonda gástrica deve ser retirada suavemente e o rato pode descansar por um tempo antes de tentar gavage novamente. Além disso, o procedimento de gavage é usado para induzir o modelo de NEC antes da eutanásia de camundongos.

4. Coletar amostras de tecido intestinal fresco para coloração de hematoxilina e eosina (H&E)

1. Mergulhe o tecido íleo fresco do mouse em 10% de formalina por 24 h.
2. Incorpore os tecidos em parafina e corte-os em seções de 4 μm.
3. Desparafinar as seções em xileno e reidratá-las sucessivamente em etanol absoluto, 95% etanol, 80% etanol, 70% etanol e água destilada, de molho por 5 minutos em cada etapa. Manche as seções com solução de hematoxilina por 5 min e diferencie-as em 1% de ácido clorídrico em 75% de álcool para 5 s. Finalmente, manche-os com solução de eosina por 1 min.
   NOTA: Após a coloração com solução de hematoxilina, deve ser diferenciado com ácido clorídrico de 1% no etanol para remover solução de hematoxilina excessivamente ligada e corante de hematoxíquia citoplasmica. A concentração de 1% de ácido clorídrico é adequada para tecido intestinal.
4. Examine a histopatologia do tecido intestinal a 40x de ampliação.

Resultados

O modelo NEC do rato BALB/c foi induzido pela alimentação de fórmulas, alimentação de LPS, hipóxia e estimulação fria. Durante o período de indução, os camundongos foram observados para patologia intestinal, características das fezes, alterações de peso corporal e sobrevida diária. Imagens representativas do intestino delgado durante a indução da NEC; os números no quadro representam o escore da patologia intestinal de 0 (epitélio normal) a 4 (o mais grave) (Figura 3A). O ...

Discussão

A NEC é a emergência do sistema gastrointestinal mais comum para recém-nascidos, com alta incidência e mortalidade, especialmente em bebês prematuros1,2,3. No entanto, sua patogênese ainda não está clara. Acredita-se atualmente que danos mucosos, invasão de patógenos e alimentação enteral são fatores de alto risco para o ^NEC3. Até o momento, os animais utilizados para o modelo NEC são princ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	100092683
Goat Milk powder	Petag	71795558417
HE dye solution	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	G1003
Isoflurane	RWD, Shenzhen Reward Life Technology Co., LTD.	R510
LPS	Sigma-Adrich	L2880
Medical oxygen	various	various
Microscope	NIKON	NIKON imaging system (DS-Ri2)
Neutral resin	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	10004160
Paraffin	various	various
Premature baby milk powder	Abbott	57430
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	10023418
1% Hydrochloric acid	various	various
10% Formalin	LEAGENE	DF0110