在几种肾脏疾病小鼠模型中使用聚乙烯亚胺纳米颗粒将外源人工合成的miRNA模拟物递送到肾脏

摘要

在这里，我们通过在几种肾脏疾病小鼠模型中通过尾静脉注射非病毒载体和聚乙烯亚胺纳米颗粒 将 外源人工合成的miRNA模拟物输送到肾脏。这导致靶miRNA在肾脏中的显着过表达，导致几种小鼠模型中肾脏疾病的进展受到抑制。

摘要

microRNA（miRNA）是未翻译成蛋白质的小非编码RNA（21-25个碱基），通过破坏和抑制它们在各种肾脏疾病中的翻译来抑制大量靶信使RNA（mRNA）。因此，通过外源人工合成的miRNA模拟物交替表达miRNA是抑制许多肾脏疾病发展的潜在有用治疗选择。然而，由于血清RNA酶会立即降解体内系统施用的外源性miRNA模拟 物，因此将miRNA递送到肾脏仍然是一个挑战。因此，能够保护外源性miRNA模拟物免受RNA酶降解并显着将其递送到肾脏的载体是必要的。许多研究使用病毒载体将外源性miRNA模拟物或抑制剂递送到肾脏。然而，病毒载体可能导致干扰素反应和/或遗传不稳定。因此，病毒载体的开发也是临床使用外源性miRNA模拟物或抑制剂的障碍。为了克服这些关于病毒载体的担忧，我们开发了一种非病毒载体方法，使用尾静脉注射聚乙烯亚胺纳米颗粒（PEI-NPs）将miRNA模拟物递送到肾脏，这导致靶miRNA在几种肾脏疾病小鼠模型中显着过表达。

引言

miRNA，即未翻译成蛋白质的小非编码RNA（21-25个碱基），通过破坏它们在各种^{肾脏疾病中的}翻译来抑制大量靶信使RNA（mRNA）1^，2。因此，采用外源性人工合成的miRNA模拟物或抑制剂的基因治疗是抑制许多肾脏疾病发展的潜在新选择³，^4，5。

尽管miRNA模拟物或抑制剂有望用于基因治疗，但递送到靶器官仍然是体内实验开发其临床潜力的一大障碍。由于人工合成的miRNA模拟物或抑制剂会立即被血清RNA酶降解，因此在体内全身施用时，它们的半衰期缩短6。此外，如果没有合适的载体，miRNA模拟物或抑制剂穿过质膜和转染细胞质的效率通常要低得多7^，8。这些证据表明，需要开发miRNA模拟物或肾脏抑制剂递送系统，使其能够在临床环境中使用，并使其成为各种肾脏疾病患者的新治疗选择。

病毒载体已被用作载体，将外源性mi....

研究方案

所有动物实验方案均经吉智医科大学动物伦理委员会批准，并按照《吉智医科大学实验动物指南》中的实验动物使用和护理指南进行。在这里，我们证明了miRNA模拟递送到肾脏，导致其使用UUO小鼠过表达。本研究已获得吉智医科大学伦理委员会批准[肾纤维化批准号19-12，急性肾脏感染（AKI）批准17-024，糖尿病肾病批准19-11]。

1. PEI-NPs-miRNA模拟复合物的制备

注意：这里描述了一只小鼠的PEI-NPs-miRNA-模拟物¹³，^14，15和PEI-NPs-对照-miRNA（作为阴性对照）的制备。

1. 准备以下物品：
   1. 制备 10 μL 线性 PEI-NP。
   2. 制备 50 μL 人工合成的 miRNA 溶解在无核酸酶水中，浓度为 100 μM（5 nmol miRNA 溶解在 50 μL 无核酸酶水中）。
   3. 制备 50 μL 人工合成的对照（非靶标）miRNA 溶解在无核酸酶水中，浓度为 100 μM（5 nmol miRNA 溶解在 50 μL 无核酸酶水中）。
   4. 准备5%和10%的葡萄糖溶液。确保 1.5....

结果

根据微阵列、qRT-PCR 和/或基因治疗应用的数据库研究，选择了下面描述的用于肾纤维化、糖尿病肾病和 AKI 的靶 miRNA。有关更多详细信息，请参阅以前的出版物¹³，^14，15。

使用PEI-NPs的miRNA-146a-5p模拟物在肾纤维化小鼠中的递送和作用¹³
荧光显微镜分析表明，尾?.......

讨论

使用本手稿中提出的方案，PEI-NPs可以将miRNA模拟物递送到肾脏以诱导靶miRNA的过表达，从而在几种肾脏疾病的 体内小鼠模型中 产生治疗效果，包括肾纤维化，糖尿病肾病和AKI。

制备PEI-NPs和miRNA模拟物复合物的方法非常简单。PEI-NPs的带正电荷的表面在刚刚混合^13，14，¹⁵，^16，

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus	Thermo Fisher Scientific	D-1306
Buffer RPE	Qiagen	79216	Wash buffer 2
Buffer RWT	Qiagen	1067933	Wash buffer 1
Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA)	Thermo Fisher Scientific	Not assigned	5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense)
Cy3-labeled double-strand oligonucleotides	Takara Bio Inc.	MIR7900
Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin	Vector Laboratories Inc	FL-1321
In vivo-jetPEI	Polyplus	101000021
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	Adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA)	Thermo Fisher Scientific	Not assigned	5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense)
miRNA-146a-5p primer	Qiagen	MS00001638	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA)	Gene design	Not assigned	5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’
miRNA-181b-5p primer	Qiagen	MS00006083	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA)	Gene design	Not assigned	5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′
miRNA-5100-primer	Qiagen	MS00042952	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube
miScript II RT kit	Qiagen	218161	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
QIA shredder	Qiagen	79654	Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	Phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	Real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	Real-time PCR instrument software
RNase-free water	Qiagen	129112
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)	Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.	Not assigned