在几种肾脏疾病小鼠模型中使用聚乙烯亚胺纳米颗粒将外源人工合成的miRNA模拟物递送到肾脏

摘要

在这里，我们通过在几种肾脏疾病小鼠模型中通过尾静脉注射非病毒载体和聚乙烯亚胺纳米颗粒 将 外源人工合成的miRNA模拟物输送到肾脏。这导致靶miRNA在肾脏中的显着过表达，导致几种小鼠模型中肾脏疾病的进展受到抑制。

摘要

microRNA（miRNA）是未翻译成蛋白质的小非编码RNA（21-25个碱基），通过破坏和抑制它们在各种肾脏疾病中的翻译来抑制大量靶信使RNA（mRNA）。因此，通过外源人工合成的miRNA模拟物交替表达miRNA是抑制许多肾脏疾病发展的潜在有用治疗选择。然而，由于血清RNA酶会立即降解体内系统施用的外源性miRNA模拟 物，因此将miRNA递送到肾脏仍然是一个挑战。因此，能够保护外源性miRNA模拟物免受RNA酶降解并显着将其递送到肾脏的载体是必要的。许多研究使用病毒载体将外源性miRNA模拟物或抑制剂递送到肾脏。然而，病毒载体可能导致干扰素反应和/或遗传不稳定。因此，病毒载体的开发也是临床使用外源性miRNA模拟物或抑制剂的障碍。为了克服这些关于病毒载体的担忧，我们开发了一种非病毒载体方法，使用尾静脉注射聚乙烯亚胺纳米颗粒（PEI-NPs）将miRNA模拟物递送到肾脏，这导致靶miRNA在几种肾脏疾病小鼠模型中显着过表达。

引言

miRNA，即未翻译成蛋白质的小非编码RNA（21-25个碱基），通过破坏它们在各种^{肾脏疾病中的}翻译来抑制大量靶信使RNA（mRNA）1^，2。因此，采用外源性人工合成的miRNA模拟物或抑制剂的基因治疗是抑制许多肾脏疾病发展的潜在新选择³，^4，5。

尽管miRNA模拟物或抑制剂有望用于基因治疗，但递送到靶器官仍然是体内实验开发其临床潜力的一大障碍。由于人工合成的miRNA模拟物或抑制剂会立即被血清RNA酶降解，因此在体内全身施用时，它们的半衰期缩短6。此外，如果没有合适的载体，miRNA模拟物或抑制剂穿过质膜和转染细胞质的效率通常要低得多7^，8。这些证据表明，需要开发miRNA模拟物或肾脏抑制剂递送系统，使其能够在临床环境中使用，并使其成为各种肾脏疾病患者的新治疗选择。

病毒载体已被用作载体，将外源性miRNA模拟物或抑制剂递送到肾脏^9，10。尽管病毒载体是为生物安全性和转染功效而开发的，但仍可能导致干扰素反应和/或遗传不稳定^11，12。为了克服这些问题，我们在几种肾脏疾病小鼠模型中使用聚乙烯亚胺纳米颗粒（PEI-NPs）开发了miRNA模拟肾脏递送系统¹³，^14，15。

PEI-NPs是基于线性聚合物的NPs，可以有效地将寡核苷酸（包括miRNA模拟物）递送到肾脏，并且由于其长期安全性和生物相容性，被认为是制备非病毒载体的首选¹³，^16，17。

本研究证明了系统外源miRNA通过尾静脉注射模拟PEI-NPs递送对单侧输尿管梗阻（UUO）产生的肾纤维化模型小鼠的影响。此外，我们证明了系统外源miRNA模拟物通过尾静脉注射与PEI-NPs递送在糖尿病肾病模型小鼠（db / db小鼠:C57BLKS / J Iar -+Lepr db / + Lepr^db）和由肾缺血再灌注损伤（IRI）产生的急性肾损伤模型小鼠中的影响。

研究方案

所有动物实验方案均经吉智医科大学动物伦理委员会批准，并按照《吉智医科大学实验动物指南》中的实验动物使用和护理指南进行。在这里，我们证明了miRNA模拟递送到肾脏，导致其使用UUO小鼠过表达。本研究已获得吉智医科大学伦理委员会批准[肾纤维化批准号19-12，急性肾脏感染（AKI）批准17-024，糖尿病肾病批准19-11]。

1. PEI-NPs-miRNA模拟复合物的制备

注意:这里描述了一只小鼠的PEI-NPs-miRNA-模拟物¹³，^14，15和PEI-NPs-对照-miRNA（作为阴性对照）的制备。

1. 准备以下物品:
   1. 制备 10 μL 线性 PEI-NP。
   2. 制备 50 μL 人工合成的 miRNA 溶解在无核酸酶水中，浓度为 100 μM（5 nmol miRNA 溶解在 50 μL 无核酸酶水中）。
   3. 制备 50 μL 人工合成的对照（非靶标）miRNA 溶解在无核酸酶水中，浓度为 100 μM（5 nmol miRNA 溶解在 50 μL 无核酸酶水中）。
   4. 准备5%和10%的葡萄糖溶液。确保 1.5 mL 微量离心管和涡旋混合器的可用性。
2. 将 10 μL PEI-NPs 溶解在 1.5 mL 微量离心管中的 90 μL 5% 葡萄糖溶液中。然后，轻轻涡旋管并向下旋转。
3. 将溶解在无核酸酶水（100 μM 浓度）中的 50 μL 人工合成的 miRNA （5 nmol） 与 50 μM 10% 葡萄糖溶液在 1.5 mL 微量离心管中混合。然后，轻轻涡旋管并向下旋转。该过程产生溶解在5%葡萄糖溶液中的miRNA。
4. 将 100 μL PEI-NPs 与 5% 葡萄糖溶液和 100 μL miRNA 模拟物 （5 nmol） 与 5% 葡萄糖溶液混合。然后，轻轻涡旋管并向下旋转。
5. 将混合物在室温（RT）下孵育15分钟，以制备稳定的PEI-NPs-miRNA模拟物复合物。该溶液含有PEI-NPs和miRNA模拟物（5 nmol），聚合物中的氮（N）与核酸中的磷酸盐（P）的比例（N / P比率）= 6（图1）。
   注意:PEI-NPs-control-miRNA复合物可以使用步骤1.1-1.5中描述的相同方法制备本手稿中描述的所有肾病小鼠模型（UUO，糖尿病肾病和AKI）。PEI-NP-miRNA 模拟物的一次进样体积与 5 nmol的 miRNA 模拟物与 PEI-NPs 偶联的 n/P 比率 = 6 相同。每种PEI-NP-miRNAs模拟物的注射持续时间和频率取决于应用它的疾病模型。

2.使用荧光显微镜通过尾静脉注射 通过 PEI-NP确认UUO小鼠miRNA模拟物显着递送到肾脏

注意:本文阐述了人工纯化的miRNA模拟物向肾脏的递送方法，表明建立了针对各种肾脏疾病的治疗方法。简而言之，UUO小鼠通过尾静脉施用花青3羧酸（Cy3）标记的miRNA模拟物添加到100μLPEI-NPs中。通过荧光显微镜检查确认向肾脏的输送。描述了PEI-NPs-花青3羧酸（Cy3）标记的miRNA模拟物（寡核苷酸）用于一只小鼠。该方法可以在几种小鼠模型中显着地将miRNA模拟物递送到肾脏，例如UUO小鼠，糖尿病肾病小鼠和IRI产生的AKI小鼠。在这里，我们使用UUO鼠标模型进行视频演示。UUO的诱导方法在前面的其他地方有描述¹³。在UUO手术后六天内遵循这些协议。

1. 准备以下物品:
   1. 制备 2 μL PEI-NPs 和 100 μL Cy3 标记的双链寡核苷酸 [Cy3 标记的 miRNA 模拟物 （1 nmol; 10 μM）]。
   2. 准备5%和10%的葡萄糖溶液。确保 1.5 mL 微量离心管和涡旋混合器的可用性。
   3. 使用盖子上有小孔的 50 mL 塑料离心管分离 UUO 小鼠的尾静脉。
   4. 对于荧光显微镜，制备最佳切割温度 （OCT） 化合物、低温恒温器、液氮、磷酸盐缓冲盐水 （PBS）、带 27 G 针头的 1.0 mL 注射器和硅烷涂层玻璃。
      注意:可以制备荧光素标记的 莲花四角 藻凝集素（近端小管标志物）和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）用于近端小管和细胞核的可选染色。
2. 将 2 μL PEI-NPs 溶解在 1.5 mL 微量离心管中的 98 μL 10% 葡萄糖溶液中。然后，轻轻涡旋管并向下旋转。
3. 在 10% 葡萄糖溶液中将 100 μL Cy3 标记的 miRNA 模拟物加入 100 μL PEI-NPs 中（在步骤 2.2 中制备）。然后，轻轻涡旋管并向下旋转。
4. 将混合物在室温下孵育15分钟，以制备稳定的PEI-NPs-Cy3标记-miRNA-模拟物复合物。
5. 将UUO小鼠头朝下放入没有麻醉的50 mL离心管中，然后将尾巴穿过盖子上准备好的孔。
6. 用 27 G 针头填充 1.0 mL 注射器，其中含有 200 μL PEI-NPs-Cy3-miRNA 模拟复合物。
7. 使用带有27 G针头的1.0 mL注射器通过小鼠尾静脉 注射 PEI-NPs-Cy3-miRNA模拟物（200μL）。
   注意:用浸有乙醇（70%-80%）的棉绒擦拭尾静脉以扩张尾静脉并对注射区域进行消毒。
8. 200μLPEI-NPs-Cy3-miRNA模拟复合物注射一小时后，使用适当的小动物麻醉装置用异氟醚（4%-5%）麻醉小鼠。确认麻醉深度，无脚趾夹伤反射。在整个手术过程中用异氟醚（3%）维持麻醉。
9. 接下来，用手术剪刀和镊子切开皮肤、肌肉和肋骨，露出心脏。在右心房切开后，将PBS注射到左心室中，以抽出全身血液，直到肾脏颜色变为淡黄色（表明整个小鼠身体都注入了PBS）。
   注意:进行心脏灌注以有效地去除全身血液。
10. 停止异氟醚并从小鼠身上取出肾脏并用PBS清洗它们。之后，从肾脏中取出肾囊，并用PBS清洗肾脏两次。
11. 将肾组织样品嵌入OCT化合物中并在液氮中冷冻。
12. 使用低温恒温器制备切片（5μm厚）。将这些切片安装到硅烷涂层载玻片上，并用4%多聚甲醛固定。
    注意:肾组织可以选择在室温下用荧光素标记的 莲花四角藻 凝集素（2mg / mL）染色2小时用于近端小管，然后在室温下对DAPI（PBS中的30nM）染色15分钟用于细胞核。
13. 用PBS轻轻清洗载玻片两次。
14. 通过 100 倍和 400 倍放大倍率的荧光显微镜和适当的成像软件可视化荧光染色。

3. 确认通过尾静脉注射 将 miRNA模拟物递送到肾脏后靶miRNA改变

1. 执行定量实时聚合酶链反应 （qRT-PCR） 以确认目标 miRNA 交替。
   注意:有关 qRT-PCR^18、19、20 的详细信息，请参阅之前发表的文章。制造商更改了用于生成下面提供的代表性结果的qRT-PCR系统。qRT-PCR 应按照最新的制造商协议进行。

结果

根据微阵列、qRT-PCR 和/或基因治疗应用的数据库研究，选择了下面描述的用于肾纤维化、糖尿病肾病和 AKI 的靶 miRNA。有关更多详细信息，请参阅以前的出版物¹³，^14，15。

使用PEI-NPs的miRNA-146a-5p模拟物在肾纤维化小鼠中的递送和作用¹³
荧光显微镜分析表明，尾?...

讨论

使用本手稿中提出的方案，PEI-NPs可以将miRNA模拟物递送到肾脏以诱导靶miRNA的过表达，从而在几种肾脏疾病的 体内小鼠模型中 产生治疗效果，包括肾纤维化，糖尿病肾病和AKI。

制备PEI-NPs和miRNA模拟物复合物的方法非常简单。PEI-NPs的带正电荷的表面在刚刚混合^13，14，¹⁵，^16，

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus	Thermo Fisher Scientific	D-1306
Buffer RPE	Qiagen	79216	Wash buffer 2
Buffer RWT	Qiagen	1067933	Wash buffer 1
Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA)	Thermo Fisher Scientific	Not assigned	5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense)
Cy3-labeled double-strand oligonucleotides	Takara Bio Inc.	MIR7900
Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin	Vector Laboratories Inc	FL-1321
In vivo-jetPEI	Polyplus	101000021
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	Adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA)	Thermo Fisher Scientific	Not assigned	5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense)
miRNA-146a-5p primer	Qiagen	MS00001638	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA)	Gene design	Not assigned	5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’
miRNA-181b-5p primer	Qiagen	MS00006083	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA)	Gene design	Not assigned	5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′
miRNA-5100-primer	Qiagen	MS00042952	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube
miScript II RT kit	Qiagen	218161	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
QIA shredder	Qiagen	79654	Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	Phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	Real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	Real-time PCR instrument software
RNase-free water	Qiagen	129112
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)	Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.	Not assigned