여러 신장 질환 마우스 모델에서 폴리에틸레니민 나노입자를 사용하여 신장에 외인성 인공 합성 miRNA 모방체의 전달

요약

여기에서 우리는 여러 신장 질환 마우스 모델에서 비바이러스 벡터 및 폴리에틸렌이민 나노입자의 꼬리 정맥 주입을 통해 외인성 인공 합성 miRNA 모방체를 신장에 전달합니다. 이로 인해 신장에서 표적 miRNA가 크게 과발현되어 여러 마우스 모델에서 신장 질환의 진행이 억제되었습니다.

초록

단백질로 번역되지 않는 작은 비암호화 RNA(21-25 염기)인 microRNA(miRNA)는 다양한 신장 질환에서 번역을 불안정하게 만들고 억제함으로써 많은 표적 메신저 RNA(mRNA)를 억제합니다. 따라서, 외인성 인공적으로 합성된 miRNA 모조물에 의한 miRNA 발현의 교대는 많은 신장 질환의 발병을 억제하기 위한 잠재적으로 유용한 치료 옵션이다. 그러나, 혈청 RNAase는 생체 내에서 체계적으로 투여된 외인성 miRNA 모방체를 즉시 분해하기 때문에, 신장으로의 miRNA의 전달은 여전히 도전 과제로 남아 있다. 따라서, 외인성 miRNA 모조물을 RNAase에 의한 분해로부터 보호하고, 이를 신장에 현저하게 전달할 수 있는 벡터가 필요하다. 많은 연구에서 바이러스 벡터를 사용하여 외인성 miRNA 모방체 또는 억제제를 신장에 전달했습니다. 그러나 바이러스 벡터는 인터페론 반응 및/또는 유전적 불안정성을 유발할 수 있습니다. 따라서, 바이러스 벡터의 개발은 또한 외인성 miRNA 모방체 또는 억제제의 임상적 사용을 위한 장애물이다. 바이러스 벡터에 대한 이러한 우려를 극복하기 위해 우리는 폴리에틸이민 나노입자(PEI-NP)의 꼬리 정맥 주입을 사용하여 miRNA 모방체를 신장에 전달하는 비바이러스 벡터 방법을 개발했으며, 이는 신장 질환의 여러 마우스 모델에서 표적 miRNA의 상당한 과발현을 유도했습니다.

서문

단백질로 번역되지 않는 작은 비암호화 RNA(21-25 염기)인 miRNA는 다양한 신장 질환에서 표적 메신저 RNA(mRNA)를 불안정하게 만들고 번역을 억제함으로써 많은 표적 메신저 RNA(mRNA)를 억제합니다 ^1,2. 그러므로, 외인성 인위적으로 합성된 miRNA 모방체 또는 억제제를 사용하는 유전자 요법은 많은 신장 질환의 발병을 억제하기 위한 잠재적인 새로운 옵션이다 ^3,4,5.

유전자 치료를 위한 miRNA 모방체 또는 억제제의 약속에도 불구하고, 표적 장기로의 전달은 임상 잠재력을 개발하기 위한 생체 내 실험에 여전히 큰 장애물로 남아 있습니다. 인위적으로 합성된 miRNA 모방체 또는 억제제는 혈청 RNase에 의해 즉시 분해되기 때문에, 이들의 반감기는 생체 내 전신 투여시 단축된다 6. 추가로, 원형질막을 가로질러 세포질을 형질감염시키는 miRNA 모방체 또는 억제제의 효율은 일반적으로 적절한 벡터 없이 훨씬 더 낮다^[7,8]. 이러한 일련의 증거는 신장에 대한 miRNA 모방체 또는 억제제 전달 시스템의 개발이 임상 환경에서 사용을 가능하게 하고 다양한 신장 질환을 가진 환자를 위한 새로운 치료 옵션으로 만들기 위해 필요함을 시사합니다.

바이러스 벡터는 외인성 miRNA 모조물 또는 억제제를 신장에 전달하기 위한 운반체로서 사용되어 왔다 ^9,10. 바이러스 벡터는 생물안전성 및 형질감염 효능을 위해 개발되었지만, 여전히 인터페론 반응 및/또는 유전적 불안정성을 유발할 수 있다^11,12. 이러한 우려를 극복하기 위해, 우리는 신장 질환의 여러 마우스 모델에서 비바이러스 벡터인 폴리에틸이민 나노입자(PEI-NP)를 사용하여 신장에 대한 miRNA 모방 전달 시스템을 개발했습니다^13,14,15.

PEI-NP는 miRNA 모방체를 포함한 올리고뉴클레오티드를 신장에 효과적으로 전달할 수 있는 선형 폴리머 기반 NP이며, 이들의 장기 안전성 및 생체적합성 13,16,17로 인해 비바이러스 벡터를 제조하는 데 바람직한 것으로 간주됩니다.

이 연구는 편측 요관 폐쇄(UUO)에 의해 생성된 신장 섬유증 모델 마우스에서 꼬리 정맥 주사를 통한 체계적인 외인성 miRNA 모방 전달의 효과를 보여줍니다. 또한, 우리는 당뇨병성 신장 질환 모델 마우스(db/db 마우스: C57BLKS/J Iar -+Lepr db/+Lepr^db) 및 신장 허혈-재관류 손상(IRI)에 의해 생성된 급성 신장 손상 모델 마우스에서 꼬리 정맥 주사를 통해 PEI-NP를 사용한 체계적인 외인성 miRNA 모방 전달의 효과를 입증합니다.

프로토콜

모든 동물 실험 프로토콜은 Jichi Medical University의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았으며 Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals의 실험 동물 사용 및 관리 지침에 따라 수행되었습니다. 여기에서 우리는 UUO 마우스를 사용하여 과발현을 초래하는 신장으로의 miRNA 모방 전달을 입증했습니다. 본 연구는 Jichi 의과대학 윤리위원회의 승인을 받았다[신장섬유증 19-12호, 급성신장감염(AKI) 17-024호, 당당뇨병성 신증19-11호].

1. PEI-NPs-miRNA-mimic 복합체의 제조

참고: 여기서, PEI-NPs-miRNA-mimic^13,14,15 및 PEI-NPs-control-miRNA(음성 대조군으로서)의 제조가 한 마우스에 대해 설명된다.

1. 다음 항목을 준비하십시오.
   1. 10 μL의 선형 PEI-NP를 준비합니다.
   2. 100μM 농도의 뉴클레아제가 없는 물에 용해된 인공적으로 합성된 miRNA 50μL(뉴클레아제가 없는 물 50μL에 용해된 5nmol miRNA)를 준비합니다.
   3. 100μM의 농도로 뉴클레아제가 없는 물에 용해된 인공적으로 합성된 대조군(비표적) miRNA 50μL(뉴클레아제가 없는 물 50μL에 용해된 5nmol miRNA)를 준비합니다.
   4. 5 % 및 10 % 포도당 용액을 준비하십시오. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브와 보텍스 믹서의 가용성을 보장합니다.
2. 1.5 mL 미세 원심분리기 튜브에 있는 90 μL의 5% 포도당 용액에 10 μL의 PEI-NPs를 녹입니다. 그런 다음 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 아래로 돌립니다.
3. 뉴클레아제가 없는 물(100μM 농도)에 용해된 인공적으로 합성된 miRNA(50μL)를 1.5mL 미세원심분리기 튜브에서 50μM의 10% 포도당 용액과 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 아래로 돌립니다. 이 과정은 5% 포도당 용액에 용해된 miRNA를 생성합니다.
4. 5% 포도당 용액에 100μL의 PEI-NP를 혼합하고 5% 포도당 용액에 100μL의 miRNA 모방체(5nmol)를 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 아래로 돌립니다.
5. 혼합물을 실온 (RT)에서 15분 동안 인큐베이션하여 PEI-NPs-miRNA-모방체의 안정한 복합체를 제조하였다. 이 용액에는 PEI-NPs 및 miRNA 모방체(5nmol)가 포함되어 있으며, 핵산의 인산염(P)에 대한 폴리머의 질소(N) 비율(N/P 비율) = 6입니다(그림 1).
   참고: PEI-NPs-control-miRNA 복합체는 이 원고에 설명된 모든 신장 질환 마우스 모델(UUO, 당뇨병성 신병증 및 AKI)에 대해 1.1-1.5단계에 설명된 것과 동일한 프로세스를 사용하여 제조할 수 있습니다. PEI-NP-miRNAs-mimic의 1회 주입 부피는 N/P 비율 = 6에서 PEI-NP와 접합된 miRNA-mimic의 5 nmol과 동일하다. 각 PEI-NP-miRNAs-모방체의 주입 기간 및 빈도는 그것이 적용되는 질병 모델에 따라 달라진다.

2. 형광 현미경을 이용한 꼬리 정맥 주입을 통한 PEI-NP에 의한 UUO 마우스의 신장으로의 miRNA 모방체의 유의한 전달 확인

참고: 여기에서 인위적으로 정제된 miRNA 모방체의 신장에 전달하는 방법이 정교화되어 다양한 신장 질환에 대한 치료 방법의 확립을 나타냅니다. 간단히 말해서, UUO 마우스는 꼬리 정맥을 통해 100 μL의 PEI-NPs에 첨가된 시아닌3 카르복실산(Cy3)-표지된 miRNA 모방체를 투여받았다. 신장으로의 전달은 형광 현미경으로 확인되었습니다. 한 마우스에 대한 PEI-NPs-cyanine3 카르복실산(Cy3)-표지된 miRNA 모방체(올리고뉴클레오티드)가 기재되어 있다. 이 방법은 IRI에 의해 생산된 UUO 마우스, 당뇨병성 신장 질환 마우스 및 AKI 마우스와 같은 몇몇 마우스 모델에서 신장에 miRNA 모조물을 유의하게 전달할 수 있다. 여기서는 비디오 데모를 위해 UUO 마우스 모델을 사용했습니다. UUO의 유도 방법은 앞서 다른^{곳에서도 13}에 기술되었다. UUO 수술 후 6일 이내에 이 프로토콜을 따르십시오.

1. 다음 항목을 준비하십시오.
   1. 2 μL의 PEI-NPs 및 100 μL의 Cy3-표지된 이중-가닥 올리고뉴클레오티드[Cy3-labeled miRNA mimic (1 nmol; 10 μM)]를 준비한다.
   2. 5 % 및 10 % 포도당 용액을 준비하십시오. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브와 보텍스 믹서의 가용성을 보장합니다.
   3. 캡에 작은 구멍이 있는 50mL 플라스틱 원심분리기 튜브를 사용하여 UUO 마우스의 꼬리 정맥을 분리합니다.
   4. 형광 현미경 검사의 경우 최적 절단 온도(OCT) 화합물, 저온 유지 장치, 액체 질소, 인산염 완충 식염수(PBS), 27G 바늘이 있는 1.0mL 주사기 및 실란 코팅 유리를 준비합니다.
      참고: 플루오레세인 표지 된 Lotus tetragonolobus lectin(근위 세뇨관 마커) 및 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)은 근위 세뇨관 및 세포핵의 선택적 염색을 위해 준비될 수 있습니다.
2. 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 있는 10% 포도당 용액 98μL에 PEI-NP 2μL를 녹입니다. 그런 다음 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 아래로 돌립니다.
3. 10% 포도당 용액(단계 2.2에서 제조됨)에서 100μL의 PEI-NPs에 100μL의 Cy3-표지된 miRNA 모방체를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 아래로 돌립니다.
4. 혼합물을 RT에서 15분 동안 인큐베이션하여 PEI-NPs-Cy3-표지된-miRNA-모방체의 안정한 복합체를 제조하였다.
5. UUO 마우스를 마취없이 50mL 원심 분리기 튜브에 먼저 넣은 다음 캡의 준비된 구멍을 통해 꼬리를 놓습니다.
6. 1.0mL 주사기에 200μL의 PEI-NPs-Cy3-miRNA-모방 복합체가 포함된 27G 바늘을 채웁니다.
7. 27G 바늘이 있는 1.0mL 주사기를 사용하여 마우스의 꼬리 정맥을 통해 PEI-NPs-Cy3-miRNA-모방체(200μL)를 주입합니다.
   알림: 에탄올(70%-80%)에 적신 면봉으로 꼬리 정맥을 닦아 꼬리 정맥을 확장하고 주사 부위를 소독합니다.
8. 200μL의 PEI-NPs-Cy3-miRNA-miRNA 모방 복합체 주사 1시간 후, 작은 동물에 적합한 마취 장치를 사용하여 이소플루란(4%-5%)으로 마우스를 마취합니다. 발가락 핀치 반사가없는 상태에서 마취의 깊이를 확인하십시오. 수술 내내 이소플루란(3%)으로 마취를 유지하십시오.
9. 다음으로 수술용 가위와 집게로 피부, 근육, 갈비뼈를 절개하여 심장을 노출시킵니다. 우심방을 절개한 후 PBS를 좌심실에 주입하여 신장색이 옅은 노란색으로 바뀔 때까지 몸 전체의 혈액을 빼냅니다(마우스 몸 전체에 PBS가 관류됨을 나타냄).
   알림: 심장 관류는 몸 전체의 혈액을 효율적으로 제거하기 위해 수행됩니다.
10. 이소플루란을 멈추고 생쥐에서 신장을 제거하고 PBS로 씻습니다. 그런 다음 신장에서 신장 캡슐을 제거하고 PBS로 신장을 두 번 씻으십시오.
11. 신장 조직 샘플을 OCT 화합물에 삽입하고 액체 질소에서 동결합니다.
12. 저온 유지 장치를 사용하여 절편(두께 5μm)을 준비합니다. 섹션을 실란 코팅 유리 슬라이드에 장착하고 4% 파라포름알데히드로 고정합니다.
    참고: 신장 조직은 근위 세뇨관의 경우 RT에서 2시간 동안 플루오레세인 표지 Lotus tetragonolobus lectin(2mg/mL)으로 선택적으로 염색한 다음 세포핵의 경우 RT에서 15분 동안 DAPI(PBS의 30nM)로 염색할 수 있습니다.
13. PBS로 슬라이드를 부드럽게 두 번 씻습니다.
14. 형광 현미경을 통해 100x 및 400x 배율과 적절한 이미징 소프트웨어로 형광 염색을 시각화합니다.

3. 꼬리 정맥 주사를 통해 PEI-NP에 의한 miRNA 모방체의 신장 전달 후 표적 miRNA 변경 확인

1. 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 수행하여 표적 miRNA 교대를 확인합니다.
   참고: qRT-PCR^18,19,20에 대한 자세한 내용은 이전에 게시된 문서를 참조하십시오. 아래에 제공된 대표적인 결과를 생성하기 위해 사용된 qRT-PCR 시스템은 제조업체에 의해 변경되었습니다. qRT-PCR은 최신 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되어야 합니다.

결과

신장 섬유증, 당뇨병성 신병증 및 AKI에 대한 표적 miRNA는 유전자 치료 응용 분야를 위한 마이크로어레이, qRT-PCR 및/또는 데이터베이스 연구를 기반으로 선택되었습니다. 보다 상세한 내용은 이전 간행물^13,14,15를 참조한다.

신장 섬유증 마우스에서 PEI-NP를 사용한 miRNA-146a-5p-모방체의 전달 및 효과

토론

이 원고에 제시된 프로토콜을 사용하여 PEI-NP는 miRNA 모방체를 신장에 전달하여 표적 miRNA의 과발현을 유도하여 신장 섬유증, 당뇨병성 신장 질환 및 AKI를 포함한 여러 신장 질환의 생체 내 마우스 모델에서 치료 효과를 얻을 수 있습니다.

PEI-NPs 및 miRNA 모방체의 복합체를 제조하는 방법은 매우 간단하다. PEI-NP의 양전하를 띤 표면은 13,14,15,16,17

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus	Thermo Fisher Scientific	D-1306
Buffer RPE	Qiagen	79216	Wash buffer 2
Buffer RWT	Qiagen	1067933	Wash buffer 1
Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA)	Thermo Fisher Scientific	Not assigned	5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense)
Cy3-labeled double-strand oligonucleotides	Takara Bio Inc.	MIR7900
Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin	Vector Laboratories Inc	FL-1321
In vivo-jetPEI	Polyplus	101000021
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	Adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA)	Thermo Fisher Scientific	Not assigned	5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense)
miRNA-146a-5p primer	Qiagen	MS00001638	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA)	Gene design	Not assigned	5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’
miRNA-181b-5p primer	Qiagen	MS00006083	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA)	Gene design	Not assigned	5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′
miRNA-5100-primer	Qiagen	MS00042952	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube
miScript II RT kit	Qiagen	218161	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
QIA shredder	Qiagen	79654	Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	Phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	Real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	Real-time PCR instrument software
RNase-free water	Qiagen	129112
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)	Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.	Not assigned