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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous livrons des imitations exogènes de miARN synthétisées artificiellement au rein via l’injection veineuse d’un vecteur non viral et de nanoparticules de polyéthylènemine dans plusieurs modèles murins de maladie rénale. Cela a conduit à une surexpression significative de miARN cible dans le rein, entraînant une progression inhibée de la maladie rénale dans plusieurs modèles murins.

Résumé

Les microARN (miARN), petits ARN non codants (21-25 bases) qui ne sont pas traduits en protéines, inhibent beaucoup d’ARN messagers cibles (ARNm) en déstabilisant et en inhibant leur traduction dans diverses maladies rénales. Par conséquent, l’alternance de l’expression des miARN par des imitations exogènes de miARN synthétisées artificiellement est une option de traitement potentiellement utile pour inhiber le développement de nombreuses maladies rénales. Cependant, étant donné que l’ARNase sérique dégrade immédiatement les imitations de miARN exogènes systématiquement administrées in vivo, l’administration de miARN au rein reste un défi. Par conséquent, des vecteurs capables de protéger les imitations exogènes des miARN de la dégradation par l’ARNase et de les délivrer de manière significative au rein sont nécessaires. De nombreuses études ont utilisé des vecteurs viraux pour délivrer des imitations ou des inhibiteurs exogènes de miARN au rein. Cependant, les vecteurs viraux peuvent provoquer une réponse à l’interféron et/ou une instabilité génétique. Par conséquent, le développement de vecteurs viraux est également un obstacle à l’utilisation clinique d’imitations ou d’inhibiteurs exogènes des miARN. Pour surmonter ces préoccupations concernant les vecteurs viraux, nous avons développé une méthode de vecteur non viral pour délivrer des imitations de miARN au rein en utilisant l’injection veineuse de la queue de nanoparticules de polyéthylène (PEI-NP), ce qui a conduit à une surexpression significative des miARN cibles dans plusieurs modèles murins de maladie rénale.

Introduction

Les miARN, petits ARN non codants (21-25 bases) qui ne sont pas traduits en protéines, inhibent beaucoup d’ARN messagers cibles (ARNm) en les déstabilisant et en inhibant leur traduction dans diverses maladies rénales 1,2. Par conséquent, la thérapie génique utilisant des imitations ou des inhibiteurs exogènes de miARN synthétisés artificiellement est une nouvelle option potentielle pour inhiber le développement de nombreuses maladies rénales 3,4,5.

Malgré la promesse de mi-ARN imitateurs ou inhibiteurs pour la thérapie génique, l’administration aux organes cibles reste un obstacle majeur pour les expériences in vivo afin de développer leur potentiel clinique. Étant donné que les mi-ARN synthétisés artificiellement ou les inhibiteurs sont soumis à une dégradation immédiate par la RNase sérique, leur demi-vie est raccourcie lors de l’administration systémique in vivo6. De plus, l’efficacité des imitations ou inhibiteurs des miARN pour traverser la membrane plasmique et transfecter le cytoplasme est généralement beaucoup plus faible sans vecteurs appropriés 7,8. Ces sources de données suggèrent que le développement du système d’administration de miARN imite ou inhibiteur pour le rein est nécessaire, afin de permettre leur utilisation en milieu clinique et d’en faire une nouvelle option de traitement pour les patients atteints de diverses maladies rénales.

Des vecteurs viraux ont été utilisés comme vecteurs pour délivrer des imitations ou des inhibiteurs exogènes des miARN au rein 9,10. Bien qu’ils aient été développés pour la biosécurité et l’efficacité de la transfection, les vecteurs viraux peuvent encore provoquer une réponse à l’interféron et/ou une instabilité génétique11,12. Pour surmonter ces préoccupations, nous avons développé un système d’administration miARN imitant le rein en utilisant des nanoparticules de polyéthylènemine (PEI-NPs), un vecteur non viral, dans plusieurs modèles murins de maladie rénale13,14,15.

Les PEI-NP sont des NP linéaires à base de polymères qui peuvent délivrer efficacement des oligonucléotides, y compris des imitateurs de miARN, dans les reins, et sont considérés comme préférables pour la préparation de vecteurs non viraux en raison de leur innocuité et de leur biocompatibilité à long terme13,16,17.

Cette étude démontre les effets de l’administration systématique de miARN exogène imitant l’administration avec les IPE-NP par injection veineuse de la queue chez des souris modèles de fibrose rénale produites par obstruction unilatérale de l’uretère (UUO). De plus, nous démontrons les effets de l’administration systématique de miARN exogènes avec les IPE-NP par injection veineuse de la queue chez des souris modèles d’insuffisance rénale diabétique (souris db / db: C57BLKS / J Iar -+ Lepr db / + Leprdb) et des souris modèles de lésions rénales aiguës produites par une lésion d’ischémie-reperfusion rénale (IRI).

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Protocole

Tous les protocoles d’expérimentation animale ont été approuvés par le comité d’éthique animale de l’Université médicale de Jichi et effectués conformément aux directives sur l’utilisation et le soin des animaux d’expérimentation du Guide des animaux de laboratoire de l’Université médicale de Jichi. Ici, nous avons démontré la livraison mimétique du miARN au rein, ce qui a entraîné sa surexpression à l’aide de souris UUO. Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Université médicale de Jichi [Approbation n ° 19-12 pour la fibrose rénale, 17-024 pour l’infection rénale aiguë (IRA) et 19-11 pour la néphropathie diabétique].

1. Préparation du complexe mimique PEI-NPs-miARN

REMARQUE: Ici, la préparation de PEI-NPs-miRNA-mimic13,14,15 et PEI-NPs-control-miRNA (en tant que témoin négatif) est décrite pour une souris.

  1. Préparez les éléments suivants :
    1. Préparer 10 μL de PEI-NP linéaires.
    2. Préparer 50 μL de miARN synthétisés artificiellement dissous dans de l’eau exempte de nucléases à une concentration de 100 μM (5 nmol miARN dissous dans 50 μL d’eau sans nucléase).
    3. Préparer 50 μL de miARN témoins synthétisés artificiellement (non cibles) dissous dans de l’eau exempte de nucléases à une concentration de 100 μM (5 nmol miARN dissous dans 50 μL d’eau sans nucléase).
    4. Préparer des solutions de glucose à 5% et 10%. Assurer la disponibilité de tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL et d’un mélangeur vortex.
  2. Dissoudre 10 μL de PEI-NPs dans 90 μL de solution de glucose à 5 % dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Ensuite, faites tourbillonner doucement le tube et tournez vers le bas.
  3. Mélanger 50 μL de miARN synthétisés artificiellement (5 nmol) dissous dans de l’eau exempte de nucléases (concentration de 100 μM) avec 50 μM de solution de glucose à 10 % dans des tubes microcentrifuges de 1,5 mL. Ensuite, faites tourbillonner doucement le tube et tournez vers le bas. Ce processus donne des miARN dissous dans une solution de glucose à 5%.
  4. Mélanger 100 μL de PEI-NPs dans une solution de glucose à 5 % et 100 μL de miARN mimic (5 nmol) dans une solution de glucose à 5 %. Ensuite, faites tourbillonner doucement le tube et tournez vers le bas.
  5. Incuber le mélange pendant 15 minutes à température ambiante (RT) pour préparer un complexe stable de mimime PEI-NPs-miRNA. Cette solution contient des PEI-NPs et des miARN mimic (5 nmol) à un rapport azotes (N) dans le polymère au phosphate (P) dans les acides nucléiques (rapport N/P) = 6 (Figure 1).
    REMARQUE : Le complexe PEI-NPs-control-miRNA peut être préparé en utilisant le même processus décrit aux étapes 1.1-1.5 pour tous les modèles de souris atteintes de maladie rénale décrits dans ce manuscrit (UUO, néphropathie diabétique et IRA). Un volume d’injection d’imitation PEI-NP-miARN est le même que 5 nmol de miARN-miARN conjugués avec des PEI-NPs à un rapport N/P = 6. La durée et la fréquence d’injection de chaque mimimi-PEI-NP-miARN dépendent du modèle de maladie dans lequel il est appliqué.

2. Confirmation de l’administration significative d’un miARN mimimétique au rein chez des souris UUO par PEI-NP par injection de veines de queue par microscopie fluorescente

REMARQUE: Ici, la méthode d’administration du miARN purifié artificiellement imitant le rein est élaborée, indiquant l’établissement de méthodes thérapeutiques pour diverses maladies rénales. En bref, des souris UUO ont reçu un miARN marqué à l’acide carboxylique cyanine3 (Cy3) ajouté à 100 μL de PEI-NP via la veine de la queue. L’administration dans les reins a été confirmée par microscopie à fluorescence. L’imitateur miARN marqué à l’acide carboxylique (Cy3) PEI-NPs-cyanine3 (oligonucléotides) pour une souris est décrit. Cette méthode peut délivrer de manière significative un miARN mimique au rein dans plusieurs modèles murins, tels que les souris UUO, les souris atteintes de maladie rénale diabétique et les souris AKI produites par IRI. Ici, nous avons utilisé un modèle de souris UUO pour la démonstration vidéo. La méthode d’induction de l’UUO a été décrite précédemment ailleurs13. Suivez ces protocoles dans les six jours suivant la chirurgie UUO.

  1. Préparez les éléments suivants :
    1. Préparer 2 μL de PEI-NPs et 100 μL d’oligonucléotides double brin marqués Cy3 [mimiM miARN marqué Cy3 (1 nmol; 10 μM)].
    2. Préparer des solutions de glucose à 5% et 10%. Assurer la disponibilité de tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL et d’un mélangeur vortex.
    3. Utilisez un tube centrifuge en plastique de 50 ml muni d’un petit trou dans le bouchon pour isoler les nervures de la queue des souris UUO.
    4. Pour la microscopie à fluorescence, préparez un composé à température de coupe optimale (TCO), un cryostat, de l’azote liquide, une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), des seringues de 1,0 mL avec une aiguille de 27 G et du verre recouvert de silane.
      REMARQUE : La lectine Lotus tétragonolobus marquée à la fluorescéine (un marqueur tubulaire proximal) et le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) peuvent être préparés pour la coloration facultative des tubules proximaux et des noyaux cellulaires.
  2. Dissoudre 2 μL de PEI-NPs dans 98 μL de solution de glucose à 10 % dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Ensuite, faites tourbillonner doucement le tube et tournez vers le bas.
  3. Ajouter 100 μL de miARN marqués Cy3 mimic à 100 μL de PEI-NPs dans une solution de glucose à 10% (préparée à l’étape 2.2). Ensuite, faites tourbillonner doucement le tube et tournez vers le bas.
  4. Incuber le mélange pendant 15 minutes à TA pour préparer un complexe stable de miARN marqué PEI-NPs-Cy3.
  5. Placez la souris UUO tête la première dans un tube centrifuge de 50 ml sans anesthésie, puis placez la queue à travers le trou préparé dans le bouchon.
  6. Remplissez une seringue de 1,0 mL avec une aiguille de 27 G avec 200 μL de complexe mimique PEI-NPs-Cy3-miRNA.
  7. Injecter PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 μL) par la veine de la queue de la souris à l’aide de la seringue de 1,0 mL avec une aiguille de 27 G.
    REMARQUE: Essuyez la veine de la queue avec du coton saturé d’éthanol (70%-80%) pour dilater la veine de la queue et désinfecter la zone d’injection.
  8. Une heure après l’injection de 200 μL du complexe mi-miARN PEI-NPs-Cy3-miRNA, anesthésier la souris avec de l’isoflurane (4 % à 5 %) à l’aide d’un anesthésique approprié pour les petits animaux. Confirmez la profondeur de l’anesthésie avec une absence de réflexe de pincement des orteils. Maintenir l’anesthésie avec de l’isoflurane (3%) tout au long de la chirurgie.
  9. Ensuite, faites une incision dans la peau, les muscles et les côtes avec des ciseaux chirurgicaux et des forceps pour exposer le cœur. Après avoir pratiqué une incision dans l’oreillette droite, injectez du PBS dans le ventricule gauche pour aspirer le sang dans tout le corps jusqu’à ce que la couleur des reins passe au jaune pâle (indiquant que tout le corps de la souris est perfusé avec du PBS).
    REMARQUE: La perfusion cardiaque est effectuée pour éliminer efficacement le sang dans tout le corps.
  10. Arrêtez l’isoflurane et retirez les reins des souris et lavez-les avec du PBS. Après cela, retirez les capsules rénales des reins et lavez les reins deux fois avec du PBS.
  11. Incorporer les échantillons de tissus rénaux dans un composé OCT et les congeler dans de l’azote liquide.
  12. Utiliser un cryostat pour préparer les sections (5 μm d’épaisseur). Montez les sections sur des lames de verre recouvertes de silane et fixez-les avec 4% de paraformaldéhyde.
    REMARQUE: Les tissus rénaux peuvent éventuellement être colorés avec de la lectine Lotus tetragonolobus marquée à la fluorescéine (2 mg / mL) à TA pendant 2 heures pour les tubules proximaux, suivie de DAPI (30 nM dans PBS) à TA pendant 15 minutes pour les noyaux cellulaires.
  13. Lavez doucement les lames deux fois avec du PBS.
  14. Visualisez la coloration par fluorescence par microscopie à fluorescence à un grossissement de 100x et 400x et un logiciel d’imagerie approprié.

3. Confirmation des altérations des miARN cibles après l’administration du miARN mimimic au rein par PEI-NP par injection de la veine de la queue

  1. Effectuer une réaction en chaîne de polymérase quantitative en temps réel (qRT-PCR) pour confirmer les alternances miARN cibles.
    REMARQUE: Reportez-vous à l’article publié précédemment pour les détails de qRT-PCR18,19,20. Le système qRT-PCR utilisé pour générer les résultats représentatifs fournis ci-dessous a été modifié par le fabricant. La qRT-PCR doit être effectuée conformément au dernier protocole du fabricant.

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Résultats

Les miARN cibles pour la fibrose rénale, la néphropathie diabétique et l’IRA décrits ci-dessous ont été sélectionnés en fonction de la recherche sur la microréseau, la qRT-PCR et / ou la base de données pour les applications de thérapie génique. Pour plus de détails, se référer aux publications précédentes13,14,15.

Livraison et effets de miARN-146a-5p-mimic utilisant des PEI...

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Discussion

En utilisant le protocole présenté dans ce manuscrit, les IPE-IP peuvent délivrer des imitations de miARN au rein pour induire une surexpression des miARN cibles, ce qui entraîne des effets de traitement dans des modèles murins in vivo de plusieurs maladies rénales, y compris la fibrose rénale, l’insuffisance rénale diabétique et l’IRA.

La méthode de préparation du complexe de PEI-NPs et miARN mimic est très simple. La surface chargée positivement des PEI-NPs piège l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été partiellement soutenu par JSPS KAKENHI (subvention n° 21K08233). Nous remercions Edanz (https://jp.edanz.com/ac) d’avoir édité les brouillons de ce manuscrit.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleusThermo Fisher ScientificD-1306
Buffer RPEQiagen79216Wash buffer 2
Buffer RWTQiagen1067933Wash buffer 1
Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA)Thermo Fisher ScientificNot assigned5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense)
5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense)
Cy3-labeled double-strand oligonucleotidesTakara Bio Inc.MIR7900
Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectinVector Laboratories IncFL-1321
In vivo-jetPEIPolyplus101000021
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCRThermo Fisher Scientific431681396-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific4311971Adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA)Thermo Fisher ScientificNot assigned5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU
UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense)
miRNA-146a-5p primerQiagenMS00001638Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA)Gene designNot assigned5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG
GUU-3’
miRNA-181b-5p primerQiagenMS00006083Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA)Gene designNot assigned5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′
miRNA-5100-primerQiagenMS00042952Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNeasy Mini kitQiagen217004Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube
miScript II RT kitQiagen218161Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miScript SYBR Green PCR kitQiagen218073Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
QIA shredderQiagen79654Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube
QIAzol Lysis ReagentQiagen79306Phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR systemThermo Fisher Scientific4472380Real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380Real-time PCR instrument software
RNase-free waterQiagen129112
RNU6-2 primerQiagenMS00033740Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.Not assigned

Références

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