Entrega de miRNA exógeno sintetizado artificialmente ao rim usando nanopartículas de polietilenimina em vários modelos de doença renal em camundongos

Resumo

Aqui, entregamos miRNA exógeno sintetizado artificialmente ao rim via injeção na veia caudal de um vetor não viral e nanopartículas de polietilenimina em vários modelos de camundongos com doença renal. Isso levou a uma superexpressão significativa de miRNA-alvo no rim, resultando em progressão inibida da doença renal em vários modelos de camundongos.

Resumo

microRNAs (miRNAs), pequenos RNAs não codificantes (21-25 bases) que não são traduzidos em proteínas, inibem lotes de RNAs mensageiros alvo (mRNAs), desestabilizando e inibindo sua tradução em várias doenças renais. Portanto, a alternância da expressão de miRNA por miRNAs exógenos sintetizados artificialmente é uma opção de tratamento potencialmente útil para inibir o desenvolvimento de muitas doenças renais. No entanto, como a RNAase sérica degrada imediatamente os miRNAs exógenos administrados sistematicamente in vivo, a entrega de miRNA ao rim permanece um desafio. Portanto, vetores que possam proteger miRNA exógeno imita da degradação por RNAase e entregá-los significativamente ao rim são necessários. Muitos estudos têm usado vetores virais para entregar miRNA exógeno imita ou inibidores para o rim. No entanto, vetores virais podem causar uma resposta de interferon e/ou instabilidade genética. Portanto, o desenvolvimento de vetores virais também é um obstáculo para o uso clínico de miRNAs exógenos ou inibidores. Para superar essas preocupações em relação aos vetores virais, desenvolvemos um método de vetor não viral para entregar miRNA miméticos ao rim usando injeção na veia caudal de nanopartículas de polietilenimina (PEI-NPs), o que levou à superexpressão significativa de miRNAs alvo em vários modelos de doença renal em camundongos.

Introdução

Os miRNAs, pequenos RNAs não codificantes (21-25 bases) que não são traduzidos em proteínas, inibem muitos RNAs mensageiros alvo (mRNAs), desestabilizando-os e inibindo sua tradução em várias doenças renais ^1,2. Portanto, a terapia gênica empregando miRNAs exógenos sintetizados artificialmente ou inibidores é uma nova opção potencial para inibir o desenvolvimento de muitas doenças renais ^3,4,5.

Apesar da promessa de miRNA imita ou inibidores para terapia gênica, a entrega a órgãos-alvo continua sendo um grande obstáculo para experimentos in vivo desenvolverem seu potencial clínico. Como os miRNAs sintetizados artificialmente imitam ou inibem a degradação imediata pela RNase sérica, sua meia-vida é encurtada após administração sistêmica in vivo⁶. Além disso, a eficiência dos miRNAs miméticos ou inibidores para atravessar a membrana plasmática e o citoplasma transfecto é geralmente muito menor sem vetores apropriados ^7,8. Essas linhas de evidência sugerem que o desenvolvimento do sistema de liberação de miRNA imita ou inibidores para o rim é necessário, para permitir seu uso em ambientes clínicos e torná-los uma nova opção de tratamento para pacientes com várias doenças renais.

Vetores virais têm sido utilizados como carreadores para liberar miRNAs exógenos miméticos ou inibidores para o rim ^9,10. Embora tenham sido desenvolvidos para biossegurança e eficácia transfectiva, vetores virais ainda podem causar resposta ao interferon e/ou instabilidade genética^11,12. Para superar essas preocupações, desenvolvemos um sistema de liberação de miRNA miRNA para o rim usando nanopartículas de polietilenimina (PEI-NPs), um vetor não viral, em vários modelos de doença renal em camundongos^13,14,15.

As NP-PEIs são NPs lineares baseadas em polímeros que podem efetivamente entregar oligonucleotídeos, incluindo miRNA miméticos, ao rim, e são consideradas preferíveis para a preparação de vetores não virais devido à sua segurança e biocompatibilidade a longo prazo^13,16,17.

Este estudo demonstra os efeitos do miRNA exógeno sistemático mimetizando a liberação com PEI-NPs via injeção na veia caudal em camundongos modelo de fibrose renal produzidos por obstrução unilateral do ureter (UUO). Adicionalmente, demonstramos os efeitos da entrega sistemática de miRNA exógeno mimetizada com PEI-NPs via injeção na veia caudal em camundongos modelo de doença renal diabética (camundongos db/db: C57BLKS/J Iar -+Lepr db/+Lepr^db) e camundongos modelo de lesão renal aguda produzidos por lesão de isquemia-reperfusão renal (IRI).

Protocolo

Todos os protocolos experimentais em animais foram aprovados pelo comitê de ética animal da Jichi Medical University e realizados de acordo com as diretrizes de Uso e Cuidado de Animais Experimentais do Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals. Aqui, demonstramos a entrega de miRNA mimetiza o rim, resultando em sua superexpressão usando camundongos UUO. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Jichi Medical University [Aprovação nºs 19-12 para fibrose renal, 17-024 para infecção renal aguda (IRA) e 19-11 para nefropatia diabética].

1. Preparação do complexo PEI-NPs-miRNA-mimic

NOTA: Aqui, a preparação de PEI-NPs-miRNA-mimic^13,14,15 e PEI-NPs-control-miRNA (como um controle negativo) são descritas para um camundongo.

1. Prepare os seguintes itens:
   1. Preparar 10 μL de PEI-NPs lineares.
   2. Preparar 50 μL de miRNAs sintetizados artificialmente dissolvidos em água livre de nucleases a uma concentração de 100 μM (5 nmol de miRNA dissolvidos em 50 μL de água livre de nucleases).
   3. Preparar 50 μL de miRNAs de controle (não-alvo) sintetizados artificialmente dissolvidos em água livre de nucleases a uma concentração de 100 μM (5 nmol miRNA dissolvidos em 50 μL de água livre de nucleases).
   4. Preparar soluções de glicose a 5% e 10%. Garanta a disponibilidade de tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e um misturador de vórtices.
2. Dissolver 10 μL de PEI-NPs em 90 μL de solução glicosada a 5% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Em seguida, vórtice o tubo suavemente e gire para baixo.
3. Misturar 50 μL de miRNAs sintetizados artificialmente (5 nmol) dissolvidos em água livre de nucleases (concentração de 100 μM) com 50 μM de solução de glicose a 10% em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Em seguida, vórtice o tubo suavemente e gire para baixo. Este processo produz miRNA dissolvido em solução de glicose a 5%.
4. Misturar 100 μL de PEI-NPs em solução glicosada a 5% e 100 μL de miRNA mimic (5 nmol) em solução glicosada a 5%. Em seguida, vórtice o tubo suavemente e gire para baixo.
5. Incubar a mistura por 15 min à temperatura ambiente (TR) para preparar um complexo estável de PEI-NPs-miRNA-mimic. Esta solução contém PEI-NPs e miRNA mimic (5 nmol) na proporção de nitrogênios (N) no polímero para fosfato (P) em ácidos nucléicos (relação N/P) = 6 (Figura 1).
   NOTA: O complexo PEI-NPs-controle-miRNA pode ser preparado usando o mesmo processo descrito nas etapas 1.1-1.5 para todos os modelos de camundongos com doença renal descritos neste manuscrito (UUO, nefropatia diabética e IRA). Um volume de injeção de PEI-NP-miRNAs-mimic é o mesmo que 5 nmol de miRNAs-mimic conjugados com PEI-NPs na relação N/P = 6. A duração e a frequência de cada mimetismo de PEI-NP-miRNAs dependem do modelo de doença em que é aplicado.

2. Confirmação da entrega significativa de miRNA mimic ao rim em camundongos UUO por PEI-NP via injeção na veia caudal usando microscopia fluorescente

NOTA: Aqui, o método de entrega de miRNA purificado artificialmente mimetizar para o rim é elaborado, indicando o estabelecimento de métodos terapêuticos para várias doenças renais. Em resumo, camundongos UUO receberam miRNA marcado com ácido carboxílico cianine3 (Cy3) adicionado a 100 μL de PEI-NPs através da veia caudal. O parto nos rins foi confirmado com microscopia de fluorescência. É descrito o mimico de miRNA marcado com ácido carboxílico (Cy3) (Cy3) de PEI-NPs-cianina 3 para um camundongo. Este método pode entregar significativamente miRNA mimic para o rim em vários modelos de camundongo, tais como camundongos UUO, camundongos diabéticos com doença renal, e camundongos AKI produzidos por IRI. Aqui, usamos um modelo de mouse UUO para a demonstração em vídeo. O método de indução da UUO foi descrito anteriormente em outro artigo¹³. Siga estes protocolos dentro de seis dias após a cirurgia UUO.

1. Prepare os seguintes itens:
   1. Preparar 2 μL de PEI-NPs e 100 μL de oligonucleotídeos de fita dupla marcados com Cy3 [Cy3-labeled miRNA mimic (1 nmol; 10 μM)].
   2. Preparar soluções de glicose a 5% e 10%. Garanta a disponibilidade de tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e um misturador de vórtices.
   3. Use um tubo de centrífuga de plástico de 50 mL com um pequeno orifício na tampa para isolar as veias da cauda de camundongos UUO.
   4. Para microscopia de fluorescência, prepare um composto de temperatura de corte ideal (OCT), um criostato, nitrogênio líquido, solução salina tamponada com fosfato (PBS), seringas de 1,0 mL com uma agulha de 27 G e vidro revestido com silano.
      NOTA: A lectina tetragonolobus Lotus marcada com fluoresceína (um marcador tubular proximal) e o 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) podem ser preparados para coloração opcional de túbulos proximais e núcleos celulares.
2. Dissolver 2 μL de PEI-NPs em 98 μL de solução glicosada a 10% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Em seguida, vórtice o tubo suavemente e gire para baixo.
3. Adicionar 100 μL de miRNA marcado com Cy3 mimic a 100 μL de PEI-NPs em solução de glicose a 10% (preparada na etapa 2.2). Em seguida, vórtice o tubo suavemente e gire para baixo.
4. Incubar a mistura por 15 min em RT para preparar um complexo estável de PEI-NPs-Cy3-labeled-miRNA-mimic.
5. Coloque o rato UUO de cabeça num tubo de centrífuga de 50 ml sem anestesia e, em seguida, coloque a cauda através do orifício preparado na tampa.
6. Encher uma seringa de 1,0 mL com uma agulha de 27 G com 200 μL do complexo PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimimic.
7. Injetar PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 μL) através da veia caudal do rato, utilizando a seringa de 1,0 ml com agulha 27 G.
   NOTA: Limpe a veia da cauda com algodão saturado em etanol (70%-80%) para dilatar a veia da cauda e desinfetar a área de injeção.
8. Uma hora após 200 μL da injeção do complexo PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimetiza o camundongo, anestesiar o camundongo com isoflurano (4%-5%) usando um dispositivo anestésico apropriado para pequenos animais. Confirme a profundidade da anestesia com a ausência do reflexo de pinça dos dedos. Manter a anestesia com isoflurano (3%) durante toda a cirurgia.
9. Em seguida, faça uma incisão na pele, músculos e costelas com tesoura cirúrgica e pinça para expor o coração. Depois de fazer uma incisão no átrio direito, injete PBS no ventrículo esquerdo para extrair sangue por todo o corpo até que a cor do rim mude para amarelo pálido (indicando que todo o corpo do rato é perfundido com PBS).
   NOTA: A perfusão cardíaca é realizada para remover eficientemente o sangue por todo o corpo.
10. Pare o isoflurano e remova os rins dos ratos e lave-os com PBS. Depois disso, remova as cápsulas renais dos rins e lave os rins duas vezes com PBS.
11. Incorporar as amostras de tecido renal em composto OCT e congelar em nitrogênio líquido.
12. Use um criostato para preparar seções (5 μm de espessura). Monte as seções em lâminas de vidro revestidas de silano e fixe-as com paraformaldeído a 4%.
    NOTA: Os tecidos renais podem opcionalmente ser corados com lectina tetragonolobus Lotus marcada com fluoresceína (2 mg/mL) na RT por 2 h para os túbulos proximais, seguida por DAPI (30 nM em PBS) na RT por 15 min para os núcleos celulares.
13. Lave suavemente as lâminas duas vezes com PBS.
14. Visualize a coloração de fluorescência por microscopia de fluorescência em aumentos de 100x e 400x e software de imagem apropriado.

3. Confirmação de alterações de miRNA alvo após a entrega de miRNA mimico ao rim por PEI-NP via injeção na veia caudal

1. Realizar reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) para confirmar as alterações de miRNA alvo.
   NOTA: Consulte o artigo publicado anteriormente para obter os detalhes do qRT-PCR^18,19,20. O sistema qRT-PCR usado para gerar os resultados representativos fornecidos abaixo foi alterado pelo fabricante. qRT-PCR deve ser realizado de acordo com o protocolo mais recente do fabricante.

Resultados

Os miRNAs alvo para fibrose renal, nefropatia diabética e LRA descritos abaixo foram selecionados com base no microarray, qRT-PCR e/ou pesquisa em banco de dados para aplicações em terapia gênica. Para mais detalhes, consultar as publicações anteriores^13,14,15.

Liberação e efeitos do miRNA-146a-5p-mimetismo usando PEI-NPs em camundongos com fibrose renal

Discussão

Usando o protocolo apresentado neste manuscrito, PEI-NPs podem entregar miRNA imita ao rim para induzir a superexpressão de miRNAs alvo, resultando em efeitos de tratamento em modelos de camundongos in vivo de várias doenças renais, incluindo fibrose renal, doença renal diabética e IRA.

O método para preparar o complexo de PEI-NPs e miRNA mimic é muito simples. A superfície carregada positivamente dos NP-PEI aprisiona os miRNAs quando eles são apenas misturados13,14,15,16,17 ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus	Thermo Fisher Scientific	D-1306
Buffer RPE	Qiagen	79216	Wash buffer 2
Buffer RWT	Qiagen	1067933	Wash buffer 1
Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA)	Thermo Fisher Scientific	Not assigned	5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense)
Cy3-labeled double-strand oligonucleotides	Takara Bio Inc.	MIR7900
Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin	Vector Laboratories Inc	FL-1321
In vivo-jetPEI	Polyplus	101000021
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	Adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA)	Thermo Fisher Scientific	Not assigned	5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense)
miRNA-146a-5p primer	Qiagen	MS00001638	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA)	Gene design	Not assigned	5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’
miRNA-181b-5p primer	Qiagen	MS00006083	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA)	Gene design	Not assigned	5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′
miRNA-5100-primer	Qiagen	MS00042952	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube
miScript II RT kit	Qiagen	218161	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
QIA shredder	Qiagen	79654	Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	Phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	Real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	Real-time PCR instrument software
RNase-free water	Qiagen	129112
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)	Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.	Not assigned