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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, forniamo miRNA esogeni sintetizzati artificialmente al rene tramite iniezione di vena della coda di un vettore non virale e nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali. Ciò ha portato a una significativa sovraespressione del miRNA bersaglio nel rene, con conseguente progressione inibita della malattia renale in diversi modelli murini.

Abstract

I microRNA (miRNA), piccoli RNA non codificanti (21-25 basi) che non sono tradotti in proteine, inibiscono molti RNA messaggeri bersaglio (mRNA) destabilizzando e inibendo la loro traduzione in varie malattie renali. Pertanto, l'alternanza dell'espressione di miRNA da parte di miRNA esogeni sintetizzati artificialmente è un'opzione di trattamento potenzialmente utile per inibire lo sviluppo di molte malattie renali. Tuttavia, poiché la RNAasi sierica degrada immediatamente i miRNA esogeni sistematicamente somministrati in vivo, la consegna di miRNA al rene rimane una sfida. Pertanto, sono necessari vettori in grado di proteggere i miRNA esogeni dalla degradazione da parte della RNAasi e consegnarli significativamente al rene. Molti studi hanno utilizzato vettori virali per fornire miRNA esogeni o inibitori al rene. Tuttavia, i vettori virali possono causare una risposta all'interferone e/o instabilità genetica. Pertanto, lo sviluppo di vettori virali è anche un ostacolo per l'uso clinico di miRNA esogeni o inibitori. Per superare queste preoccupazioni riguardanti i vettori virali, abbiamo sviluppato un metodo vettoriale non virale per fornire miRNA imitatori al rene utilizzando l'iniezione di nanoparticelle di polietilenimina (PEI-NP), che ha portato a una significativa sovraespressione dei miRNA bersaglio in diversi modelli murini di malattia renale.

Introduzione

I miRNA, piccoli RNA non codificanti (21-25 basi) che non sono tradotti in proteine, inibiscono molti RNA messaggeri bersaglio (mRNA) destabilizzandoli e inibendo la loro traduzione in varie malattie renali 1,2. Pertanto, la terapia genica che impiega miRNA esogeni sintetizzati artificialmente o inibitori è una potenziale nuova opzione per inibire lo sviluppo di molte malattie renali 3,4,5.

Nonostante la promessa di miRNA imitatori o inibitori per la terapia genica, la consegna agli organi bersaglio rimane un grosso ostacolo per gli esperimenti in vivo per sviluppare il loro potenziale clinico. Poiché i miRNA sintetizzati artificialmente o gli inibitori sono soggetti a degradazione immediata da parte della RNasi sierica, la loro emivita è ridotta dopo somministrazione sistemica in vivo6. Inoltre, l'efficienza dei miRNA imitatori o inibitori di attraversare la membrana plasmatica e trasfettare il citoplasma è generalmente molto più bassa senza vettori appropriati 7,8. Queste linee di evidenza suggeriscono che è necessario lo sviluppo di miRNA imitatori o inibitori del sistema di rilascio per il rene, per consentire il loro uso in contesti clinici e renderli una nuova opzione di trattamento per i pazienti con varie malattie renali.

I vettori virali sono stati utilizzati come vettori per fornire miRNA esogeni o inibitori al rene 9,10. Sebbene siano stati sviluppati per la biosicurezza e l'efficacia della trasfezione, i vettori virali possono ancora causare una risposta all'interferone e/o instabilità genetica11,12. Per superare queste preoccupazioni, abbiamo sviluppato un sistema di rilascio di miRNA che imita il rene utilizzando nanoparticelle di polietilenimina (PEI-NP), un vettore non virale, in diversi modelli murini di malattia renale13,14,15.

Le PEI-NP sono NP lineari a base di polimeri che possono effettivamente rilasciare oligonucleotidi, comprese le imitazioni dei miRNA, al rene e sono considerate preferibili per la preparazione di vettori non virali a causa della loro sicurezza e biocompatibilità a lungo termine13,16,17.

Questo studio dimostra gli effetti dei miRNA esogeni sistematici che imitano la consegna con PEI-NP tramite iniezione di vene caudali in topi modello di fibrosi renale prodotti da ostruzione unilaterale dell'uretere (UUO). Inoltre, dimostriamo gli effetti della somministrazione sistematica di miRNA esogeno con PEI-NPs tramite iniezione di vena caudale in topi modello di malattia renale diabetica (topi db / db: C57BLKS / J Iar -+ Lepr db / + Leprdb) e topi modello di danno renale acuto prodotto da danno da ischemia-riperfusione renale (IRI).

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sugli animali sono stati approvati dal comitato etico animale della Jichi Medical University ed eseguiti in conformità con le linee guida sull'uso e la cura degli animali sperimentali della Guida della Jichi Medical University per gli animali da laboratorio. Qui, abbiamo dimostrato la consegna miRNA mimica al rene con conseguente sovraespressione utilizzando topi UUO. Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico della Jichi Medical University [Approvazione n. 19-12 per la fibrosi renale, 17-024 per l'infezione renale acuta (AKI) e 19-11 per la nefropatia diabetica].

1. Preparazione del complesso PEI-NPs-miRNA-mimic

NOTA: Qui, la preparazione di PEI-NPs-miRNA-mimic13,14,15 e PEI-NPs-control-miRNA (come controllo negativo) sono descritti per un topo.

  1. Preparare i seguenti elementi:
    1. Preparare 10 μL di PEI-NP lineari.
    2. Preparare 50 μL di miRNA sintetizzati artificialmente disciolti in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione di 100 μM (5 nmol di miRNA disciolti in 50 μL di acqua priva di nucleasi).
    3. Preparare 50 μL di miRNA di controllo (non bersaglio) sintetizzati artificialmente disciolti in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione di 100 μM (5 nmol miRNA disciolti in 50 μL di acqua priva di nucleasi).
    4. Preparare soluzioni di glucosio al 5% e al 10%. Garantire la disponibilità di provette per microcentrifuga da 1,5 ml e di un miscelatore a vortice.
  2. Sciogliere 10 μL di PEI-NPs in 90 μL di soluzione di glucosio al 5% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Quindi, vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.
  3. Mescolare 50 μL di miRNA sintetizzati artificialmente (5 nmol) disciolti in acqua priva di nucleasi (concentrazione di 100 μM) con 50 μM di soluzione di glucosio al 10% in provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Quindi, vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso. Questo processo produce miRNA disciolti in soluzione di glucosio al 5%.
  4. Mescolare 100 μL di PEI-NPs in soluzione di glucosio al 5% e 100 μL di miRNA mimic (5 nmol) in soluzione di glucosio al 5%. Quindi, vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.
  5. Incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) per preparare un complesso stabile di PEI-NPs-miRNA-mimic. Questa soluzione contiene PEI-NPs e miRNA mimic (5 nmol) in un rapporto di azoto (N) nel polimero e fosfato (P) negli acidi nucleici (rapporto N/P) = 6 (Figura 1).
    NOTA: Il complesso PEI-NPs-control-miRNA può essere preparato utilizzando lo stesso processo descritto nei passaggi 1.1-1.5 per tutti i modelli di topi con malattia renale descritti in questo manoscritto (UUO, nefropatia diabetica e AKI). Un volume di iniezione di PEI-NP-miRNAs-mimic è uguale a 5 nmol di miRNA-mimic coniugati con PEI-NPs in rapporto N/P = 6. La durata e la frequenza dell'iniezione di ciascun PEI-NP-miRNA-mimic dipendono dal modello di malattia in cui viene applicato.

2. Conferma della consegna significativa di miRNA mimic al rene in topi UUO mediante PEI-NP tramite iniezione di vene caudali mediante microscopia fluorescente

NOTA: Qui, viene elaborato il metodo di consegna del miRNA artificialmente purificato al rene, indicando l'istituzione di metodi terapeutici per varie malattie renali. In breve, ai topi UUO è stato somministrato un miRNA marcato con acido carbossilico cianina3 (Cy3) aggiunto a 100 μL di PEI-NP attraverso la vena caudale. La consegna ai reni è stata confermata con microscopia a fluorescenza. Viene descritto l'acido carbossilico (Cy3) marcato con acido carbossilico (Cy3) PEI-NPs-miRNA (oligonucleotidi) per un topo. Questo metodo può fornire significativamente miRNA mimic al rene in diversi modelli murini, come topi UUO, topi diabetici e topi AKI prodotti da IRI. Qui, abbiamo usato un modello di mouse UUO per la dimostrazione video. Il metodo di induzione di UUO è stato descritto in precedenza altrove13. Seguire questi protocolli entro sei giorni dall'intervento chirurgico UUO.

  1. Preparare i seguenti elementi:
    1. Preparare 2 μL di PEI-NPs e 100 μL di oligonucleotidi a doppio filamento marcati con Cy3 [miRNA miRNA marcati con Cy3 (1 nmol; 10 μM)].
    2. Preparare soluzioni di glucosio al 5% e al 10%. Garantire la disponibilità di provette per microcentrifuga da 1,5 ml e di un miscelatore a vortice.
    3. Utilizzare un tubo da centrifuga in plastica da 50 ml con un piccolo foro nel tappo per isolare le vene caudali dei topi UUO.
    4. Per la microscopia a fluorescenza, preparare un composto con temperatura di taglio ottimale (OCT), un criostato, azoto liquido, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), siringhe da 1,0 ml con un ago da 27 G e vetro rivestito di silano.
      NOTA: La lectina Lotus tetragonolobus marcata con fluoresceina (un marcatore del tubulo prossimale) e il 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) possono essere preparati per la colorazione opzionale dei tubuli prossimali e dei nuclei cellulari.
  2. Sciogliere 2 μL di PEI-NPs in 98 μL di soluzione di glucosio al 10% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Quindi, vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.
  3. Aggiungere 100 μL di miRNA marcato con Cy3 a 100 μL di PEI-NP in soluzione di glucosio al 10% (preparata nella fase 2.2). Quindi, vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.
  4. Incubare la miscela per 15 minuti a RT per preparare un complesso stabile di PEI-NPs-Cy3-marcato-miRNA-mimic.
  5. Posizionare il topo UUO a testa in giù in un tubo da centrifuga da 50 ml senza anestesia, quindi posizionare la coda attraverso il foro preparato nel cappuccio.
  6. Riempire una siringa da 1,0 mL con un ago da 27 G con 200 μL di complesso PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimimico.
  7. Iniettare PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 μL) attraverso la vena caudale del mouse utilizzando la siringa da 1,0 mL con ago da 27 G.
    NOTA: Pulire la vena caudale con cotone idrofilo saturo di etanolo (70% -80%) per dilatare la vena caudale e disinfettare l'area di iniezione.
  8. Un'ora dopo 200 μL di iniezione del complesso PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimimico, anestetizzare il topo con isoflurano (4% -5%) utilizzando un dispositivo anestetico appropriato per piccoli animali. Confermare la profondità dell'anestesia con l'assenza del riflesso del pizzico della punta. Mantenere l'anestesia con isoflurano (3%) durante l'intervento chirurgico.
  9. Successivamente, praticare un'incisione nella pelle, nei muscoli e nelle costole con forbici chirurgiche e pinze per esporre il cuore. Dopo aver praticato un'incisione nell'atrio destro, iniettare PBS nel ventricolo sinistro per estrarre il sangue in tutto il corpo fino a quando il colore del rene diventa giallo pallido (indicando che l'intero corpo del topo è perfuso con PBS).
    NOTA: La perfusione cardiaca viene eseguita per rimuovere efficacemente il sangue in tutto il corpo.
  10. Fermare l'isoflurano e rimuovere i reni dai topi e lavarli con PBS. Successivamente, rimuovere le capsule renali dai reni e lavare i reni due volte con PBS.
  11. Incorporare i campioni di tessuto renale nel composto OCT e congelare in azoto liquido.
  12. Utilizzare un criostato per preparare sezioni (5 μm di spessore). Montare le sezioni su vetrini rivestiti di silano e fissarle con paraformaldeide al 4%.
    NOTA: I tessuti renali possono facoltativamente essere colorati con lectina Lotus tetragonolobus marcata con fluoresceina (2 mg / ml) a RT per 2 ore per i tubuli prossimali, seguita da DAPI (30 nM in PBS) a RT per 15 minuti per i nuclei cellulari.
  13. Lavare delicatamente i vetrini due volte con PBS.
  14. Visualizza la colorazione a fluorescenza mediante microscopia a fluorescenza con ingrandimento 100x e 400x e software di imaging appropriato.

3. Conferma delle alterazioni dei miRNA bersaglio dopo somministrazione di miRNA mimic al rene mediante PEI-NP tramite iniezione di vena caudale

  1. Eseguire la reazione a catena quantitativa della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR) per confermare le alternanze dei miRNA bersaglio.
    NOTA: Fare riferimento all'articolo pubblicato in precedenza per i dettagli di qRT-PCR18,19,20. Il sistema qRT-PCR utilizzato per generare i risultati rappresentativi forniti di seguito è stato modificato dal produttore. qRT-PCR deve essere condotta in conformità con il protocollo del produttore più recente.

Risultati

I miRNA target per la fibrosi renale, la nefropatia diabetica e l'AKI descritti di seguito sono stati selezionati sulla base della ricerca di microarray, qRT-PCR e / o database per applicazioni di terapia genica. Per ulteriori dettagli si rimanda alle precedenti pubblicazioni13,14,15.

Rilascio ed effetti di miRNA-146a-5p-mimic utilizzando PEI-NPs in topi con fibrosi renale

Discussione

Utilizzando il protocollo presentato in questo manoscritto, le PEI-NP possono fornire miRNA imitazioni al rene per indurre la sovraespressione dei miRNA bersaglio, con conseguenti effetti del trattamento in modelli murini in vivo di diverse malattie renali, tra cui la fibrosi renale, la malattia renale diabetica e l'AKI.

Il metodo per preparare il complesso di PEI-NPs e miRNA mimic è molto semplice. La superficie caricata positivamente delle NP PEI intrappola il miRNA mimo quando son...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato parzialmente supportato da JSPS KAKENHI (Grant No. 21K08233). Ringraziamo Edanz (https://jp.edanz.com/ac) per aver curato le bozze di questo manoscritto.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleusThermo Fisher ScientificD-1306
Buffer RPEQiagen79216Wash buffer 2
Buffer RWTQiagen1067933Wash buffer 1
Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA)Thermo Fisher ScientificNot assigned5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense)
5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense)
Cy3-labeled double-strand oligonucleotidesTakara Bio Inc.MIR7900
Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectinVector Laboratories IncFL-1321
In vivo-jetPEIPolyplus101000021
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCRThermo Fisher Scientific431681396-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific4311971Adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA)Thermo Fisher ScientificNot assigned5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU
UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense)
miRNA-146a-5p primerQiagenMS00001638Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA)Gene designNot assigned5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG
GUU-3’
miRNA-181b-5p primerQiagenMS00006083Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA)Gene designNot assigned5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′
miRNA-5100-primerQiagenMS00042952Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNeasy Mini kitQiagen217004Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube
miScript II RT kitQiagen218161Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miScript SYBR Green PCR kitQiagen218073Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
QIA shredderQiagen79654Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube
QIAzol Lysis ReagentQiagen79306Phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR systemThermo Fisher Scientific4472380Real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380Real-time PCR instrument software
RNase-free waterQiagen129112
RNU6-2 primerQiagenMS00033740Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.Not assigned

Riferimenti

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