Çeşitli Böbrek Hastalığı Fare Modellerinde Polietilenimin Nanopartikülleri Kullanılarak Ekzojen Yapay Olarak Sentezlenmiş MiRNA Mimiklerinin Böbreğe Verilmesi

Özet

Burada, çeşitli böbrek hastalığı fare modellerinde viral olmayan bir vektörün kuyruk damarı enjeksiyonu ve polietilenimin nanopartikülleri yoluyla böbreğe yapay olarak sentezlenmiş dışsal miRNA taklitleri veriyoruz. Bu, böbrekte hedef miRNA'nın önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna yol açtı ve birkaç fare modelinde böbrek hastalığının ilerlemesini engelledi.

Özet

mikroRNA'lar (miRNA'lar), proteinlere çevrilmeyen küçük kodlamayan RNA'lar (21-25 baz), çeşitli böbrek hastalıklarında dengelerini bozarak ve translasyonlarını inhibe ederek birçok hedef mesajcı RNA'yı (mRNA) inhibe eder. Bu nedenle, miRNA ekspresyonunun eksojen yapay olarak sentezlenmiş miRNA taklitleri ile değiştirilmesi, birçok böbrek hastalığının gelişimini inhibe etmek için potansiyel olarak yararlı bir tedavi seçeneğidir. Bununla birlikte, serum RNAaz, sistematik olarak uygulanan eksojen miRNA taklitlerini in vivo olarak derhal bozduğundan, miRNA'nın böbreğe verilmesi bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, eksojen miRNA taklitlerini RNAaz tarafından bozulmaya karşı koruyabilen ve bunları böbreğe önemli ölçüde iletebilen vektörler gereklidir. Birçok çalışma, böbreğe eksojen miRNA taklitleri veya inhibitörleri vermek için viral vektörler kullanmıştır. Bununla birlikte, viral vektörler interferon yanıtına ve / veya genetik instabiliteye neden olabilir. Bu nedenle, viral vektörlerin gelişimi, eksojen miRNA taklitlerinin veya inhibitörlerinin klinik kullanımı için de bir engeldir. Viral vektörlerle ilgili bu endişelerin üstesinden gelmek için, polietilenimin nanopartiküllerinin (PEI-NP'ler) kuyruk damarı enjeksiyonunu kullanarak böbreğe miRNA taklitleri vermek için viral olmayan bir vektör yöntemi geliştirdik, bu da böbrek hastalığının birkaç fare modelinde hedef miRNA'ların önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna yol açtı.

Giriş

miRNA'lar, proteinlere çevrilmeyen küçük kodlamayan RNA'lar (21-25 baz), birçok hedef mesajcı RNA'yı (mRNA'lar) istikrarsızlaştırarak ve çeşitli böbrek hastalıklarında translasyonlarını inhibe ederek inhibe eder ^1,2. Bu nedenle, ekzojen yapay olarak sentezlenmiş miRNA taklitleri veya inhibitörleri kullanan gen tedavisi, birçok böbrek hastalığının gelişimini inhibe etmek için potansiyel yeni bir seçenektir ^3,4,5.

Gen terapisi için miRNA taklitleri veya inhibitörlerinin vaadine rağmen, hedef ....

Protokol

Tüm hayvan deney protokolleri, Jichi Tıp Üniversitesi hayvan etik komitesi tarafından onaylanmış ve Jichi Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Kılavuzu'ndaki Deney Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Burada, böbreğe miRNA taklit iletimini, UUO fareleri kullanılarak aşırı ekspresyonuna neden olduğunu gösterdik. Bu çalışma Jichi Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır [Onay No. 19-12 renal fibroz için, 17-024 akut böbrek enfeksiyonu (AKI) için ve 19-11 diyabetik nefropati için].

1. PEI-NPs-miRNA-mimik kompleksinin hazırlanması

NOT: Bur....

Sonuçlar

Aşağıda tarif edilen renal fibrozis, diyabetik nefropati ve AKI için hedef miRNA'lar, gen terapisi uygulamaları için mikrodizi, qRT-PCR ve / veya veritabanı araştırmasına dayanarak seçildi. Daha fazla ayrıntı için, önceki yayınlara^{bakın 13,14,15}.

Renal fibrozis farelerinde PEI-NP'ler kullanılarak miRNA-146a-5p-mimik verilmesi ve etkileri¹³

Tartışmalar

Bu makalede sunulan protokolü kullanarak, PEI-NP'ler, hedef miRNA'ların aşırı ekspresyonunu indüklemek için böbreğe miRNA taklitleri verebilir ve bu da renal fibroz, diyabetik böbrek hastalığı ve AKI dahil olmak üzere çeşitli böbrek hastalıklarının in vivo fare modellerinde tedavi etkilerine neden olabilir.

PEI-NP kompleksini ve miRNA taklidini hazırlama yöntemi çok basittir. PEI-NP'lerin pozitif yüklü yüzeyi, 13,14,15,16,17 karıştırıldığında miRNA tak.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus	Thermo Fisher Scientific	D-1306
Buffer RPE	Qiagen	79216	Wash buffer 2
Buffer RWT	Qiagen	1067933	Wash buffer 1
Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA)	Thermo Fisher Scientific	Not assigned	5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense)
Cy3-labeled double-strand oligonucleotides	Takara Bio Inc.	MIR7900
Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin	Vector Laboratories Inc	FL-1321
In vivo-jetPEI	Polyplus	101000021
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	Adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA)	Thermo Fisher Scientific	Not assigned	5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense)
miRNA-146a-5p primer	Qiagen	MS00001638	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA)	Gene design	Not assigned	5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’
miRNA-181b-5p primer	Qiagen	MS00006083	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA)	Gene design	Not assigned	5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′
miRNA-5100-primer	Qiagen	MS00042952	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube
miScript II RT kit	Qiagen	218161	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
QIA shredder	Qiagen	79654	Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	Phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	Real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	Real-time PCR instrument software
RNase-free water	Qiagen	129112
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)	Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.	Not assigned