Entrega de miRNA sintetizado artificialmente exógeno imitador al riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal

Resumen

Aquí, entregamos imitaciones exógenas de miARN sintetizadas artificialmente al riñón a través de la inyección de venas de cola de un vector no viral y nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal. Esto condujo a una sobreexpresión significativa de miARN objetivo en el riñón, lo que resultó en una progresión inhibida de la enfermedad renal en varios modelos de ratón.

Resumen

Los microARN (miARN), pequeños ARN no codificantes (21-25 bases) que no se traducen en proteínas, inhiben muchos ARN mensajeros diana (ARNm) al desestabilizar e inhibir su traducción en diversas enfermedades renales. Por lo tanto, la alternancia de la expresión de miARN por imitadores de miARN sintetizados artificialmente exógenos es una opción de tratamiento potencialmente útil para inhibir el desarrollo de muchas enfermedades renales. Sin embargo, debido a que la ARNasa sérica degrada inmediatamente los miARN exógenos administrados sistemáticamente imita in vivo, la entrega de miARN al riñón sigue siendo un desafío. Por lo tanto, son necesarios vectores que puedan proteger a los imitadores de miARN exógenos de la degradación por la ARNasa y entregarlos significativamente al riñón. Muchos estudios han utilizado vectores virales para administrar imitadores o inhibidores exógenos de miARN al riñón. Sin embargo, los vectores virales pueden causar una respuesta de interferón y/o inestabilidad genética. Por lo tanto, el desarrollo de vectores virales también es un obstáculo para el uso clínico de imitadores o inhibidores exógenos de miARN. Para superar estas preocupaciones con respecto a los vectores virales, desarrollamos un método de vector no viral para administrar imitadores de miARN al riñón utilizando la inyección en la vena de la cola de nanopartículas de polietilenimina (PEI-NP), lo que condujo a una sobreexpresión significativa de miARN objetivo en varios modelos de ratón de enfermedad renal.

Introducción

Los miRNAs, pequeños ARN no codificantes (21-25 bases) que no se traducen en proteínas, inhiben muchos ARN mensajeros diana (ARNm) desestabilizándolos e inhibiendo su traducción en diversas enfermedades renales ^1,2. Por lo tanto, la terapia génica que emplea imitadores o inhibidores exógenos de miARN sintetizados artificialmente es una nueva opción potencial para inhibir el desarrollo de muchas enfermedades renales ^3,4,5.

A pesar de la promesa de imitadores o inhibidores de miARN para la terapia génica, la administración a órganos diana sigue siendo un gran obstáculo para que los experimentos in vivo desarrollen su potencial clínico. Debido a que los imitadores o inhibidores de miARN sintetizados artificialmente están sujetos a degradación inmediata por la RNasa sérica, su vida media se acorta con la administración sistémica in vivo⁶. Además, la eficiencia de los imitadores o inhibidores de miARN para atravesar la membrana plasmática y el citoplasma transfecto es generalmente mucho menor sin vectores apropiados ^7,8. Estas líneas de evidencia sugieren que se requiere el desarrollo del sistema de administración de miRNA imitadores o inhibidores para el riñón, para permitir su uso en entornos clínicos y convertirlos en una nueva opción de tratamiento para pacientes con diversas enfermedades renales.

Los vectores virales se han utilizado como portadores para administrar imitadores o inhibidores exógenos de miARN al riñón ^9,10. A pesar de haber sido desarrollados para la bioseguridad y la eficacia de la transfección, los vectores virales aún pueden causar una respuesta de interferón y/o inestabilidad genética^11,12. Para superar estas preocupaciones, desarrollamos un sistema de administración de miRNA imita el riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina (PEI-NPs), un vector no viral, en varios modelos de ratón de enfermedad renal^13,14,15.

Los PEI-NP son NP lineales basados en polímeros que pueden entregar oligonucleótidos de manera efectiva, incluidos los imitadores de miARN, al riñón, y se consideran preferibles para preparar vectores no virales debido a su seguridad y biocompatibilidad a largo plazo^13,16,17.

Este estudio demuestra los efectos de la administración sistemática de miARN exógeno con PEI-NP a través de la inyección de venas de cola en ratones modelo de fibrosis renal producidos por obstrucción unilateral del uréter (UUO). Además, demostramos los efectos de la administración sistemática de miRNA exógeno con PEI-NPs a través de la inyección de venas de la cola en ratones modelo de enfermedad renal diabética (ratones db / db: C57BLKS / J Iar -+Lepr db ^/ +Lepr^db) y ratones modelo de lesión renal aguda producidos por lesión renal por isquemia-reperfusión (IRI).

Protocolo

Todos los protocolos experimentales con animales fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad Médica de Jichi y se realizaron de acuerdo con las pautas de uso y cuidado de animales experimentales de la Guía para animales de laboratorio de la Universidad Médica de Jichi. Aquí, demostramos la entrega de miRNA imita al riñón, lo que resulta en su sobreexpresión utilizando ratones UUO. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Jichi [Aprobación Nos. 19-12 para fibrosis renal, 17-024 para infección renal aguda (LRA) y 19-11 para nefropatía diabética].

1. Preparación del complejo PEI-NPs-miRNA-imitador

NOTA: Aquí, la preparación de PEI-NPs-miRNA-imita^13,14,15 y PEI-NPs-control-miRNA (como control negativo) se describen para un ratón.

1. Prepare los siguientes elementos:
   1. Preparar 10 μL de PEI-NPs lineales.
   2. Preparar 50 μL de miRNAs sintetizados artificialmente disueltos en agua libre de nucleasas a una concentración de 100 μM (5 nmol miRNA disueltos en 50 μL de agua libre de nucleasa).
   3. Preparar 50 μL de miRNAs control sintetizados artificialmente (no objetivo) disueltos en agua libre de nucleasas a una concentración de 100 μM (5 nmol miRNA disueltos en 50 μL de agua libre de nucleasas).
   4. Preparar soluciones de glucosa al 5% y 10%. Asegurar la disponibilidad de tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y un mezclador de vórtice.
2. Disolver 10 μL de PEI-NPs en 90 μL de solución de glucosa al 5% en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Luego, vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.
3. Mezclar 50 μL de miRNAs sintetizados artificialmente (5 nmol) disueltos en agua libre de nucleasas (concentración de 100 μM) con 50 μM de solución de glucosa al 10% en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Luego, vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo. Este proceso produce miARN disuelto en solución de glucosa al 5%.
4. Mezclar 100 μL de PEI-NPs en solución de glucosa al 5% y 100 μL de miRNA imitador (5 nmol) en solución de glucosa al 5%. Luego, vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.
5. Incubar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente (RT) para preparar un complejo estable de PEI-NPs-miRNA-imitador. Esta solución contiene PEI-NPs y miRNA imitador (5 nmol) en una proporción de nitrógenos (N) en el polímero a fosfato (P) en ácidos nucleicos (relación N/P) = 6 (Figura 1).
   NOTA: El complejo PEI-NPs-control-miRNA se puede preparar utilizando el mismo proceso descrito en los pasos 1.1-1.5 para todos los modelos de ratones con enfermedad renal descritos en este manuscrito (UUO, nefropatía diabética y LRA). Un volumen de inyección de PEI-NP-miRNAs-mimic es el mismo que 5 nmol de miRNAs-imitan conjugado con PEI-NPs en relación N/P = 6. La duración y frecuencia de inyección de cada imitación de PEI-NP-miRNAs depende del modelo de enfermedad en el que se aplica.

2. Confirmación de la entrega significativa de miRNA imitador al riñón en ratones UUO por PEI-NP a través de la inyección de venas de la cola utilizando microscopía fluorescente

NOTA: Aquí, se elabora el método de administración de miRNA purificado artificialmente imitador al riñón, lo que indica el establecimiento de métodos terapéuticos para diversas enfermedades renales. En resumen, a los ratones UUO se les administró miARN marcado con ácido carboxílico cianina3 (Cy3) agregado a 100 μL de PEI-NP a través de la vena de la cola. El suministro a los riñones se confirmó con microscopía de fluorescencia. Se describe el imitador de miARN marcado con ácido carboxílico (Cy3) PEI-NPs-cianina3 (oligonucleótidos) para un ratón. Este método puede administrar significativamente miRNA imitador al riñón en varios modelos de ratón, como ratones UUO, ratones con enfermedad renal diabética y ratones AKI producidos por IRI. Aquí, utilizamos un modelo de ratón UUO para la demostración de video. El método de inducción de UUO fue descrito previamente en otra parte¹³. Siga estos protocolos dentro de los seis días posteriores a la cirugía UUO.

1. Prepare los siguientes elementos:
   1. Preparar 2 μL de PEI-NPs y 100 μL de oligonucleótidos de doble cadena marcados con Cy3 [imitador de miARN marcado con Cy3 (1 nmol; 10 μM)].
   2. Preparar soluciones de glucosa al 5% y 10%. Asegurar la disponibilidad de tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y un mezclador de vórtice.
   3. Use un tubo de centrífuga de plástico de 50 ml con un pequeño orificio en la tapa para aislar las venas de la cola de los ratones UUO.
   4. Para la microscopía de fluorescencia, prepare un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT), un criostato, nitrógeno líquido, solución salina tamponada con fosfato (PBS), jeringas de 1.0 ml con una aguja de 27 G y vidrio recubierto de silano.
      NOTA: Se puede preparar lectina Lotus tetragonolobus marcada con fluoresceína (un marcador de túbulo proximal) y 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la tinción opcional de túbulos proximales y núcleos celulares.
2. Disolver 2 μL de PEI-NPs en 98 μL de solución de glucosa al 10% en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Luego, vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.
3. Añadir 100 μL de miARN marcado con Cy3 imitador a 100 μL de PEI-NPs en solución de glucosa al 10% (preparada en el paso 2.2). Luego, vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.
4. Incubar la mezcla durante 15 min en RT para preparar un complejo estable de imitador de miARN marcado con PEI-NPs-Cy3.
5. Coloque el ratón UUO de cabeza en un tubo de centrífuga de 50 ml sin anestesia, y luego coloque la cola a través del orificio preparado en la tapa.
6. Llene una jeringa de 1,0 ml con una aguja de 27 G con 200 μL del complejo imitador de PEI-NPs-Cy3-miRNA.
7. Inyecte PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 μL) a través de la vena de la cola del ratón utilizando la jeringa de 1,0 ml con aguja de 27 G.
   NOTA: Limpie la vena de la cola con algodón saturado en etanol (70% -80%) para dilatar la vena de la cola y desinfectar el área de inyección.
8. Una hora después de 200 μL de inyección del complejo imitador de PEI-NPs-Cy3-miRNA, anestesiar al ratón con isoflurano (4% -5%) utilizando un dispositivo anestésico apropiado para animales pequeños. Confirme la profundidad de la anestesia con una ausencia de reflejo de pellizco del dedo del pie. Mantener la anestesia con isoflurano (3%) durante toda la cirugía.
9. Luego, haga una incisión en la piel, los músculos y las costillas con tijeras quirúrgicas y fórceps para exponer el corazón. Después de hacer una incisión en la aurícula derecha, inyecte PBS en el ventrículo izquierdo para extraer sangre por todo el cuerpo hasta que el color del riñón cambie a amarillo pálido (lo que indica que todo el cuerpo del ratón está perfundido con PBS).
   NOTA: La perfusión cardíaca se realiza para eliminar eficientemente la sangre en todo el cuerpo.
10. Deje de tomar isoflurano y retire los riñones de los ratones y lávelos con PBS. Después de eso, retire las cápsulas renales de los riñones y lave los riñones dos veces con PBS.
11. Incrustar las muestras de tejido renal en OCT compuesto y congelar en nitrógeno líquido.
12. Utilice un criostato para preparar secciones (5 μm de espesor). Monte las secciones en portaobjetos de vidrio recubiertos de silano y fíjelos con paraformaldehído al 4%.
    NOTA: Los tejidos renales pueden teñirse opcionalmente con lectina Lotus tetragonolobus marcada con fluoresceína (2 mg/ml) a RT durante 2 h para los túbulos proximales, seguido de DAPI (30 nM en PBS) a RT durante 15 min para los núcleos celulares.
13. Lave suavemente las diapositivas dos veces con PBS.
14. Visualice la tinción de fluorescencia mediante microscopía de fluorescencia con un aumento de 100x y 400x y el software de imágenes adecuado.

3. Confirmación de alteraciones del miARN diana después de la administración de miARN imitador al riñón por PEI-NP mediante inyección en la vena de la cola

1. Realizar una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) para confirmar las alteraciones del miARN objetivo.
   NOTA: Consulte el artículo publicado anteriormente para obtener detalles de qRT-PCR^18,19,20. El sistema qRT-PCR utilizado para generar los resultados representativos que se proporcionan a continuación fue cambiado por el fabricante. La qRT-PCR debe realizarse de acuerdo con el protocolo más reciente del fabricante.

Resultados

Los miRNAs diana para fibrosis renal, nefropatía diabética y LRA descritos a continuación se seleccionaron en función de la investigación de microarrays, qRT-PCR y / o base de datos para aplicaciones de terapia génica. Para más detalles, consulte las publicaciones anteriores^13,14,15.

Entrega y efectos del miRNA-146a-5p-imitador usando PEI-NPs en ratones con fibrosis renal

Discusión

Usando el protocolo presentado en este manuscrito, los PEI-NP pueden administrar imitadores de miARN al riñón para inducir la sobreexpresión de miARN objetivo, lo que resulta en efectos del tratamiento en modelos de ratón in vivo de varias enfermedades renales, incluida la fibrosis renal, la enfermedad renal diabética y la LRA.

El método para preparar el complejo de PEI-NPs y miRNA imitan es muy simple. La superficie cargada positivamente de los PEI-NPs atrapa la imitación de m...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus	Thermo Fisher Scientific	D-1306
Buffer RPE	Qiagen	79216	Wash buffer 2
Buffer RWT	Qiagen	1067933	Wash buffer 1
Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA)	Thermo Fisher Scientific	Not assigned	5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense)
Cy3-labeled double-strand oligonucleotides	Takara Bio Inc.	MIR7900
Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin	Vector Laboratories Inc	FL-1321
In vivo-jetPEI	Polyplus	101000021
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	Adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA)	Thermo Fisher Scientific	Not assigned	5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense)
miRNA-146a-5p primer	Qiagen	MS00001638	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA)	Gene design	Not assigned	5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’
miRNA-181b-5p primer	Qiagen	MS00006083	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA)	Gene design	Not assigned	5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′
miRNA-5100-primer	Qiagen	MS00042952	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube
miScript II RT kit	Qiagen	218161	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
QIA shredder	Qiagen	79654	Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	Phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	Real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	Real-time PCR instrument software
RNase-free water	Qiagen	129112
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)	Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.	Not assigned