JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы доставляем экзогенные искусственно синтезированные имитаторы микроРНК в почки посредством инъекции в хвостовую вену невирусного вектора и наночастиц полиэтиленимина в нескольких моделях мышей с заболеваниями почек. Это привело к значительной сверхэкспрессии мишени микроРНК в почках, что привело к ингибированию прогрессирования заболевания почек на нескольких моделях мышей.

Аннотация

микроРНК (миРНК), малые некодирующие РНК (21-25 оснований), которые не транслируются в белки, ингибируют множество целевых матричных РНК (мРНК), дестабилизируя и ингибируя их трансляцию при различных заболеваниях почек. Таким образом, чередование экспрессии микроРНК экзогенными искусственно синтезированными мимиками микроРНК является потенциально полезным вариантом лечения для ингибирования развития многих заболеваний почек. Однако, поскольку сывороточная РНКаза немедленно разлагает систематически вводимые экзогенные имитаторы микроРНК in vivo, доставка микроРНК в почки остается проблемой. Поэтому необходимы векторы, способные защитить экзогенные мимики микроРНК от деградации РНКазой и значительно доставить их в почку. Во многих исследованиях использовались вирусные векторы для доставки экзогенных имитаторов или ингибиторов микроРНК в почки. Однако вирусные векторы могут вызывать интерфероновый ответ и/или генетическую нестабильность. Таким образом, разработка вирусных векторов также является препятствием для клинического использования экзогенных имитаторов или ингибиторов микроРНК. Чтобы преодолеть эти опасения в отношении вирусных векторов, мы разработали метод невирусного вектора для доставки имитаторов микроРНК в почку с использованием инъекции наночастиц полиэтиленимина (PEI-NP) в хвостовую вену, что привело к значительной сверхэкспрессии мишенных микроРНК в нескольких мышиных моделях заболевания почек.

Введение

микроРНК, небольшие некодирующие РНК (21-25 оснований), которые не транслируются в белки, ингибируют множество целевых матричных РНК (мРНК), дестабилизируя их и ингибируя их трансляцию при различных заболеваниях почек 1,2. Таким образом, генная терапия с использованием экзогенных искусственно синтезированных имитаторов или ингибиторов микроРНК является потенциальным новым вариантом ингибирования развития многих заболеваний почек 3,4,5.

Несмотря на перспективность имитаторов или ингибиторов микроРНК для генной терапии, доставка в органы-мишени остается большим препятствием для экспериментов in vivo по развитию их клинического потенциала. Поскольку искусственно синтезированные мимики или ингибиторы микроРНК подвержены немедленной деградации сывороточной РНКазой, их период полувыведения сокращается при системном введении in vivo6. Кроме того, эффективность имитаторов или ингибиторов микроРНК для пересечения плазматической мембраны и трансфекции цитоплазмы, как правило, намного ниже без соответствующих векторов 7,8. Эти линии доказательств свидетельствуют о том, что требуется разработка системы доставки мимиков или ингибиторов микроРНК для почек, чтобы обеспечить их использование в клинических условиях и сделать их новым вариантом лечения пациентов с различными заболеваниями почек.

Вирусные векторы использовались в качестве носителей для доставки экзогенных имитаторов или ингибиторов микроРНК в почки 9,10. Несмотря на то, что они были разработаны для обеспечения биобезопасности и эффективности трансфекции, вирусные векторы все же могут вызывать интерфероновый ответ и/или генетическую нестабильность11,12. Чтобы преодолеть эти опасения, мы разработали систему доставки миРНК, имитирующую почку, с использованием наночастиц полиэтиленимина (PEI-NP), невирусного вектора, на нескольких мышиных моделях заболевания почек13,14,15.

PEI-NP представляют собой линейные НУП на основе полимеров, которые могут эффективно доставлять олигонуклеотиды, включая мимики микроРНК, в почки и считаются предпочтительными для получения невирусных векторов из-за их долгосрочной безопасности и биосовместимости13,16,17.

Это исследование демонстрирует эффекты систематической экзогенной миРНК, имитирующей доставку PEI-NP посредством инъекции в хвостовую вену у мышей модели почечного фиброза, полученной при односторонней обструкции мочеточника (UUO). Кроме того, мы демонстрируем эффекты систематической экзогенной мимической доставки микроРНК с помощью PEI-NP посредством инъекции в хвостовую вену у мышей модели диабетической болезни почек (мышей db / db: C57BLKS / J Iar - + Lepr db / + Leprdb) и модельных мышей с острым повреждением почек, вызванных ишемией-реперфузионным повреждением почек (IRI).

протокол

Все протоколы экспериментов на животных были одобрены комитетом по этике животных Медицинского университета Джичи и выполнены в соответствии с рекомендациями по использованию и уходу за экспериментальными животными из Руководства Медицинского университета Джичи для лабораторных животных. Здесь мы продемонстрировали мимическую доставку микроРНК в почку, что приводит к ее сверхэкспрессии с помощью мышей UUO. Это исследование было одобрено Комитетом по этике Медицинского университета Джичи [Одобрение NoNo 19-12 для фиброза почек, 17-024 для острой почечной инфекции (ОПП) и 19-11 для диабетической нефропатии].

1. Получение ПЭИ-НПс-миРНК-мимического комплекса

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь описан препарат PEI-NPs-miRNA-mimic13,14,15 и PEI-NPs-control-miRNA (в качестве отрицательного контроля) для одной мыши.

  1. Подготовьте следующие предметы:
    1. Приготовьте 10 мкл линейных PEI-NP.
    2. Приготовьте 50 мкл искусственно синтезированных микроРНК, растворенных в безнуклеазной воде в концентрации 100 мкМ (5 нмоль микроРНК, растворенных в 50 мкл безнуклеазной воды).
    3. Готовят 50 мкл искусственно синтезированных контрольных (нецелевых) микроРНК, растворенных в безнуклеазной воде в концентрации 100 мкМ (5 нмоль микроРНК растворяют в 50 мкл безнуклеазной воды).
    4. Готовят 5% и 10% растворы глюкозы. Обеспечьте наличие микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл и вихревого смесителя.
  2. Растворите 10 мкл ПЭИ-НЧ в 90 мкл 5% раствора глюкозы в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Затем осторожно вкрутите трубку и вращайтесь вниз.
  3. Смешайте 50 мкл искусственно синтезированных микроРНК (5 нмоль), растворенных в безнуклеазной воде (концентрация 100 мкМ), с 50 мкМ 10% раствора глюкозы в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл. Затем осторожно вкрутите трубку и вращайтесь вниз. В результате этого процесса получается микроРНК, растворенная в 5% растворе глюкозы.
  4. Смешайте 100 мкл ПЭИ-НЧ в 5% растворе глюкозы и 100 мкл мимической микроРНК (5 нмоль) в 5% растворе глюкозы. Затем осторожно вкрутите трубку и вращайтесь вниз.
  5. Инкубируйте смесь в течение 15 мин при комнатной температуре (RT) для получения стабильного комплекса PEI-NPs-miRNA-имитирующей. Этот раствор содержит ПЭИ-НП и мимическую микроРНК (5 нмоль) при соотношении азота (N) в полимере к фосфату (P) в нуклеиновых кислотах (отношение N/P) = 6 (рис. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Комплекс PEI-NPs-control-miRNA может быть получен с использованием того же процесса, который описан на этапах 1.1-1.5 для всех моделей мышей с заболеваниями почек, описанных в этой рукописи (UUO, диабетическая нефропатия и ОПП). Один объем инъекции PEI-NP-miRNAs-имитирует такие же, как 5 нмоль miRNAs-mimic, конъюгированных с PEI-NPs, при соотношении N / P = 6. Продолжительность инъекции и частота каждого имитатора PEI-NP-miRNA зависит от модели заболевания, в которой он применяется.

2. Подтверждение значимой доставки мимической микроРНК в почку у мышей UUO с помощью PEI-NP путем инъекции в хвостовую вену с использованием флуоресцентной микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь разработан способ доставки искусственно очищенной мимики микроРНК в почку, что свидетельствует о создании терапевтических методов при различных заболеваниях почек. Короче говоря, мышам UUO вводили мимическую микроРНК, меченную цианином3-карбоновой кислотой (Cy3), добавленную к 100 мкл PEI-NP через хвостовую вену. Доставка в почки была подтверждена флуоресцентной микроскопией. Описана ПЭИ-NPs-цианин3 карбоновая кислота (Cy3)-меченная мимическая микроРНК (олигонуклеотиды) для одной мыши. Этот метод может значительно доставить мимическую микроРНК в почки на нескольких моделях мышей, таких как мыши UUO, мыши с диабетической болезнью почек и мыши с ОПП, полученные IRI. Здесь мы использовали модель мыши UUO для демонстрации видео. Индукционный метод UUO был описан ранее в другом месте13. Следуйте этим протоколам в течение шести дней после операции UUO.

  1. Подготовьте следующие предметы:
    1. Приготовьте 2 мкл PEI-NP и 100 мкл меченных Cy3 двухцепочечных олигонуклеотидов [Cy3-меченая миРНК имитирует (1 нмоль; 10 мкМ)].
    2. Готовят 5% и 10% растворы глюкозы. Обеспечьте наличие микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл и вихревого смесителя.
    3. Используйте пластиковую центрифужную пробирку объемом 50 мл с небольшим отверстием в крышке, чтобы изолировать хвостовые вены мышей UUO.
    4. Для флуоресцентной микроскопии подготовьте компаунд оптимальной температуры резки (OCT), криостат, жидкий азот, фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), шприцы объемом 1,0 мл с иглой 27 G и стекло с силановым покрытием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меченный флуоресцеином лектин Lotus tetragonolobus (маркер проксимальных канальцев) и 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) могут быть получены для дополнительного окрашивания проксимальных канальцев и ядер клеток.
  2. Растворите 2 мкл ПЭИ-НЧ в 98 мкл 10% раствора глюкозы в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Затем осторожно вкрутите трубку и вращайтесь вниз.
  3. Добавьте 100 мкл мимической миРНК, меченной Cy3, к 100 мкл PEI-NP в 10% растворе глюкозы (приготовленном на этапе 2.2). Затем осторожно вкрутите трубку и вращайтесь вниз.
  4. Инкубируйте смесь в течение 15 мин при RT для получения стабильного комплекса PEI-NPs-Cy3-меченого-миРНК-мимика.
  5. Поместите мышь UUO головой вперед в центрифужную пробирку объемом 50 мл без анестезии, а затем поместите хвост через подготовленное отверстие в крышке.
  6. Наполните шприц объемом 1,0 мл иглы 27 г 200 мкл имитирующего комплекса PEI-NPs-Cy3-miRNA.
  7. Вводите PEI-NPs-Cy3-miRNA-имитатор (200 мкл) через хвостовую вену мыши с помощью шприца объемом 1,0 мл с иглой 27 г.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протрите хвостовую вену ватой, пропитанной этанолом (70% -80%), чтобы расширить хвостовую вену и продезинфицировать область инъекции.
  8. Через час после инъекции 200 мкл комплекса PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic обезболите мышь изофлураном (4-5%) с помощью соответствующего анестезирующего устройства для мелких животных. Подтверждают глубину анестезии отсутствием рефлекса защемления пальцев ног. Поддерживайте анестезию изофлураном (3%) на протяжении всей операции.
  9. Затем сделайте разрез на коже, мышцах и ребрах хирургическими ножницами и щипцами, чтобы обнажить сердце. Сделав разрез в правом предсердии, введите PBS в левый желудочек, чтобы вытянуть кровь по всему телу, пока цвет почек не изменится на бледно-желтый (что указывает на то, что все тело мыши перфузируется PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сердечная перфузия выполняется для эффективного удаления крови по всему телу.
  10. Прекратите прием изофлурана, удалите почки у мышей и промойте их PBS. После этого извлеките почечные капсулы из почек и дважды промойте почки PBS.
  11. Поместите образцы почечной ткани в соединение OCT и заморозьте в жидком азоте.
  12. Используйте криостат для приготовления срезов (толщиной 5 мкм). Установите секции на предметные стекла с силановым покрытием и закрепите их 4% параформальдегидом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани почек могут быть дополнительно окрашены меченным флуоресцеином лектином Lotus tetragonolobus (2 мг / мл) при RT в течение 2 ч для проксимальных канальцев, а затем DAPI (30 нМ в PBS) при RT в течение 15 мин для клеточных ядер.
  13. Аккуратно промойте предметные стекла дважды с помощью PBS.
  14. Визуализируйте флуоресцентное окрашивание с помощью флуоресцентной микроскопии при 100-кратном и 400-кратном увеличении и соответствующего программного обеспечения для визуализации.

3. Подтверждение целевых изменений микроРНК после доставки имитатора микроРНК в почку с помощью PEI-NP путем инъекции в хвостовую вену

  1. Выполните количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (qRT-PCR), чтобы подтвердить изменение миРНК-мишени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к ранее опубликованной статье для получения подробной информации о qRT-PCR18,19,20. Система qRT-PCR, используемая для получения репрезентативных результатов, приведенных ниже, была изменена производителем. qRT-PCR следует проводить в соответствии с последним протоколом производителя.

Результаты

Мишени для фиброза почек, диабетической нефропатии и ОПП, описанные ниже, были выбраны на основе микрочипов, qRT-ПЦР и/или исследований баз данных для применения в генной терапии. Более подробную информацию см. в предыдущих публикациях13,14,15

Обсуждение

Используя протокол, представленный в этой рукописи, PEI-NP могут доставлять мимики микроРНК в почку, чтобы индуцировать сверхэкспрессию мишенных микроРНК, что приводит к лечебным эффектам на мышиных моделях in vivo нескольких заболеваний почек, включая фиброз почек, диабетическую боле...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана JSPS KAKENHI (грант No 21K08233). Мы благодарим Edanz (https://jp.edanz.com/ac) за редактирование черновиков этой рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleusThermo Fisher ScientificD-1306
Buffer RPEQiagen79216Wash buffer 2
Buffer RWTQiagen1067933Wash buffer 1
Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA)Thermo Fisher ScientificNot assigned5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense)
5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense)
Cy3-labeled double-strand oligonucleotidesTakara Bio Inc.MIR7900
Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectinVector Laboratories IncFL-1321
In vivo-jetPEIPolyplus101000021
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCRThermo Fisher Scientific431681396-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific4311971Adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA)Thermo Fisher ScientificNot assigned5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU
UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense)
miRNA-146a-5p primerQiagenMS00001638Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA)Gene designNot assigned5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG
GUU-3’
miRNA-181b-5p primerQiagenMS00006083Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA)Gene designNot assigned5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′
miRNA-5100-primerQiagenMS00042952Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNeasy Mini kitQiagen217004Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube
miScript II RT kitQiagen218161Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miScript SYBR Green PCR kitQiagen218073Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
QIA shredderQiagen79654Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube
QIAzol Lysis ReagentQiagen79306Phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR systemThermo Fisher Scientific4472380Real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380Real-time PCR instrument software
RNase-free waterQiagen129112
RNU6-2 primerQiagenMS00033740Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.Not assigned

Ссылки

  1. Mohr, A. M., Mott, J. L. Overview of microRNA biology. Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).
  2. Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
  3. Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy. Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).
  4. Yheskel, M., Patel, V. Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).
  5. Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
  6. Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic. Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).
  7. Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
  8. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
  9. Deng, M., et al. Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).
  10. Zhou, Y., et al. Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy. Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).
  11. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).
  12. Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives. Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).
  13. Morishita, Y., et al. Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo. International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).
  14. Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).
  15. Aomatsu, A., et al. MicroRNA expression profiling in acute kidney injury. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).
  16. Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems. European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
  17. Swami, A., et al. A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).
  18. Kaneko, S., et al. Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).
  19. Yanai, K., et al. Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).
  20. Aomatsu, A., et al. A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).
  21. Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).
  22. Xia, Z., et al. Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47. American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).
  23. Tanaka, T., et al. In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy. American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).
  24. Hamar, P., et al. Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).
  25. Ma, D., et al. Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).
  26. Wei, S., et al. Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены