检测植物-真菌相互作用中果胶的双重染色方法

摘要

该协议描述了一种检测咖啡 - 真菌相互作用中的果胶的显微镜方法。

摘要

植物细胞使用不同的结构机制，无论是组成性的还是诱导性的，来保护自己免受真菌感染。包封是一种有效的诱导机制，用于从植物细胞原生质体中分离出真菌。相反，果胶是细胞壁的聚合组分之一，是坏死性相互作用中几种果胶溶解酶的靶标。在这里，提出了通过光学显微镜检测果胶和真菌菌丝的方案。研究了锈菌 Hemileia vastatrix 感染的咖啡叶细胞中富含果胶的包封和 由Cercospora coffeicola 诱导的叶肉细胞壁修饰。用Karnovsky溶液固定病变的叶样品，脱水，并嵌入乙二醇甲基丙烯酸酯中2-4天。所有步骤之后进行真空泵送，以去除细胞间空间中的空气并改善包埋过程。将嵌入的块切成5-7μm厚的部分，将其沉积在覆盖有水的载玻片上，随后在40°C下加热30分钟。接下来，将载玻片在乳酚中用5%棉蓝色双染色以检测真菌，并在水中用0.05%钌红检测果胶（果胶的多尿酸性基团）。 发现Hemileia vastatrix 的真菌haustoria被果胶封装。在咖啡脑孢子虫病中，叶肉细胞表现出细胞壁的溶解，并观察到细胞间菌丝和分生孢子。这里介绍的方法有效地检测植物 - 真菌相互作用中的果胶相关反应。

引言

植物中的细胞壁防御机制对于抑制真菌感染至关重要。研究报告了自19^世纪 以来细胞壁厚度和组成的变化^1，2。这些变化可以由真菌病原体诱导，其刺激的形成，从而阻止真菌进入细胞或可用于封装菌丝以从真菌 haustoria 中分离宿主细胞原生质体。动态细胞壁屏障（即和完全包裹的锄）的产生对于促进植物抗性很重要 ³ 。真菌相关疾病的组织病理学研究已经研究了这些机制的发生，并描述了细胞壁聚合物，纤维素，半纤维素（阿拉伯木聚糖）和胼胝糖作为真菌攻击的抗性机制^{4，5，6，7}。

细胞壁是抵御微生物攻击的第一道屏障，损害了植物与真菌的相互作用。荔枝多糖构成细胞壁，约占真双子草植物原代细胞细胞壁组成的30%，其中同型半乳糖素是最丰富的聚合物（约60%）⁸。高尔基体分泌复杂的果胶化合物，这些化合物组成半乳糖醛酸链，其可能甲基化，也可能不甲基化^8，9。自2012年以来，文献指出，果胶甲基酯化的程度对于确定微生物果胶酶^10，11，12感染期间的相容性至关重要。因此，需要协议来验证植物 - 真菌病理系统中果酸化合物的存在和分布。

已经使用了各种技术来检测或的包封。使用的参比方法是固定组织的透射电子显微镜（TEM）和活组织和固定组织的光学显微镜。关于TEM，一些研究已经证明了细胞壁介合在真菌抗性^{13，14，15，16}中的结构作用，并且使用凝集素和抗体是定位碳水化合物聚合物¹⁶的复杂方法。然而，研究表明，光学显微镜是一种重要的方法，组织化学和免疫组织化学工具可以更好地了解和铽包裹的组成 ^{6 ， 7} 。

致病真菌表现出两种主要类型的生活方式:生物养性和坏死性。生物养真菌依靠活细胞作为营养，而坏死养真菌杀死宿主细胞，然后生活在死亡组织中¹⁷。在拉丁美洲，咖啡叶锈病是由真菌 Hemileia vastatrix引起的，是咖啡作物中的重要疾病^18，19。 Hemileia vastatrix 呈现生物营养行为，并且在抗性咖啡物种或品种中观察到的结构变化中，已经报道了超敏反应，胼胝糖，纤维素和木质素在细胞壁上的沉积以及细胞肥大¹⁴。据作者所知，文献中没有报道果胶在咖啡防锈性中的重要性。另一方面，引起脑孢子虫病的坏死性真菌 通过 一组与细胞壁降解相关的酶（例如果胶酶和聚半乳糖苷酶²⁰）靶向果胶。咖啡中的Cercosporiosis，由真菌 Cercospora coffeicola 引起，也是对咖啡作物^{的主要威胁21，22}。这种真菌在叶子和浆果中引起坏死性病变。渗透后， C. coffeicola 通过细胞内和细胞间途径^23，24，25定植植物组织。

本方案研究细胞壁上真菌结构和果胶的存在。该方案可用于鉴定与果胶（用钌红染料染色，其特异性于果胶的多尿酸酸性基团）相关的植物反应，由宿主在与真菌的生物营养相互作用中诱导。它还有助于验证坏死菌养真菌对乳酸细胞壁降解的影响。结果表明，双染色法对鉴别真菌的结构和生殖阶段是有效的。

研究方案

1. 缓冲液和试剂的制备

1. 通过将4.28g二甲苯酸钠加入100mL蒸馏水中制备2M二甲肱酸盐缓冲液，并用0.2 N HCl将pH调节至7.25。
2. 通过混合10 mL 25%戊二醛水溶液，10mL 10%甲醛水溶液，25 mL 2M二甲苯磺酸盐缓冲液和0.5mL 0.5 M CaCl_{2 26}，制备100 mL Karnovsky固定液。用蒸馏水将体积增至100 mL。
   注意:溶液可以在冰箱中保存6个月。
   注意:二甲肱酯缓冲液有毒;因此，在通风橱或开放区域处理固定溶液。避免吸入溶液蒸气，并在处理时戴上手套。
3. 通过混合以下方法制备Hoagland水溶液:3 mM Ca（NO₃）_{2.4H 2} O，2 mM NH₄H₂PO₄，5 mM KH₂PO₄，2 mM MgSO_{4.7H 2}O，9.07 mM MnSO₄，0.765 mM ZnSO_{4.7H 2}O，46.4 mM H₃BO₃， 0.09 mM Na₂MoO₄.H₂O、0.01 mM CuSO₄ 和 36 mM FeSO 4.7H₂O 作为铁-EDTA（乙二胺四乙酸）²⁷。

2. 植物样品和真菌接种

注意:对于受咖啡锈病影响的叶子的实验，五个2个月大的 阿拉比卡咖啡 幼苗cv。Catuaí在巴西圣保罗州皮拉西卡巴圣保罗大学核能农业中心（CENA）的温室中种植和饲养。

1. 在装有Hoagland营养液水溶液（pH值〜5.5）的500mL塑料盆中生长咖啡植物，在保持在27±3°C的生长室中生长4个月，由LED灯在光子通量为250μmol光子^{s-1 m-2} 下产生¹²小时的光周期。每周更换Hoagland营养液，持续4个月。
2. 按照参考文献²⁸中描述的方法，在其逆轴表面上用1 x 10³H. vastatrix uredospores接种来自五种植物的四片膨胀的叶子。接种后，用黑色塑料袋覆盖植物，在黑暗中保持植物48小时。接种后30天收获病变。 
3. 从阿拉比卡咖啡cv中收获由Cercospora coffeicola引起的特征性病变。奥巴塔工厂位于巴西圣保罗州坎皮纳斯生物研究所（坐标:-22.906506126269942，-47.015075902025266）。在处理样品之前，在立体显微镜中分析病变以验证咖啡分生孢子C.然后，用分生孢子安装一些载玻片以确认疾病病因²²。

3. 样品采集、固定和脱水

1. 使用手术刀和镊子，在病变的中间区域（黄色斑点;图1）并将其浸入30 mL Karnovsky固定剂溶液中（图1和图2A）。固定步骤可以在冰箱中进行48小时。
2. 至少四次，使用油泵将叶样品置于低真空（500-600mBar）下15分钟，以增加固定溶液在叶组织中的渗透性。使用样品旋转执行此步骤（图1）。
3. 固定后，在0.5M二甲肟缓冲液（pH 7.2）中洗涤叶样品三次，每次在蒸馏水中稀释5分钟，然后将其转移到分级乙醇系列（30%，50%，70%，90%（2x）和100%（2x））中15分钟，每种乙醇浓度（图1 和 图2B）。

4. 组蛋白包埋程序

1. 按照制造商的说明，通过三个步骤将样品逐渐转移到甲基丙烯酸乙二醇酯（GMA）中。首先，通过将GMA粉末（1g）与100mL碱性树脂（组蛋白试剂盒; 材料表）在磁激越下，然后按照以下步骤操作。
   1. 将样品浸入1:2溶液A:100%乙醇中3小时。
   2. 将样品浸入1:1溶液A:100%乙醇中3小时。
   3. 将样品浸入纯碱性树脂中2-4天。在此步骤中，将样品置于低真空下，每天至少四次，持续15分钟，然后旋转。

5. 聚合

注:聚合工艺需要 1.2 mL 塑料模具、碱性树脂和固化剂（有关商用试剂盒的详细信息，请参见 材料表 ）。

1. 将15 mL溶液A（步骤4.1）与1mL固化剂在烧杯中旋转2分钟混合，以产生聚合溶液（溶液B）。
2. 将1.2 mL聚合溶液（溶液B）放入塑料模具中。使用木镐，将病变的叶样品从纯碱性树脂转移到溶液B中（图2C）。避免使用镊子，因为它们会导致组织破碎。
3. 确保快速定位垂直于塑料模具的叶片样品，因为溶液B在5分钟内迅速变得粘稠。可以将多个病变的叶子样品放置在单个模具中。
   注意:建议在申请许多样品之前多次练习上述步骤。当样品很多时，模具之间的聚合时间不同，并且叶片样品的垂直取向可能难以实现。
4. 当叶片样品的垂直取向达到时，等待30分钟，然后将塑料模具转移到含有硅胶的塑料或玻璃室中以防止潮湿。等待2-3小时聚合。
5. 一旦树脂和叶样品在2-3小时后聚合，通过用打磨锉刀打磨块基，将产生的块从塑料模具中分离出来。然后，将块粘在一块木头上（图2D）。

6. 切片

1. 使用配备8厘米钢刀片的旋转切片机（图2E），将块切成5μm厚的部分。将切片放在覆盖有蒸馏水的载玻片上。将切片漂浮在水面上的载玻片转移到40°C的热板上干燥并促进切片与载玻片的粘附。
2. 干燥后（图2F），用块参考名称和载玻片编号标记载玻片。

7. 双重染色工艺

1. 用2mL乳酚（40%甘油，20%苯酚和20%乳酸）覆盖切片，并在45°C的热板上加热5分钟（图3A）。
2. 通过在装有蒸馏水的烧杯中洗涤载玻片三次来除去多余的染料（图3B-D）。
3. 用2mL0.01%钌红在水中染色1分钟（图3E）。
4. 通过在装有蒸馏水的烧杯中洗涤载玻片三次来除去多余的染料（图3F，G）。
5. 在切片上滴一滴蒸馏水，并用24 mm x 60 mm盖玻片覆盖切片，以进行光学显微镜分析。

结果

GMA包埋部分的棉蓝色乳酚染色揭示了在生物营养和坏死营养真菌相互作用中咖啡叶肉细胞之间和内部存在几种真菌结构。

在生物营养病理系统中，当使用双染色方法染色时，含有细胞壁和致密原生质体含量的 Hhemileia vastatrix 菌丝在海绵状和栅栏实质中均以深蓝色出现（图4A，B）。茴雌雄母细胞（Hmc）和茴香母细胞也表现出强烈的深蓝...

讨论

本工作引入了一种替代的双染色组织化学测试，以研究细胞壁的果胶组成，该细胞壁在生物营养病理系统中封装了haustoria。目的还在于证明该方法检测其诱导的坏死性真菌和细胞壁变化的功效。在这里，咖啡实质细胞壁的果胶可以封装锈菌 Hemileia vastatrix的颈部和haustorium。Silva等人还描述了纤维素和胼胝糖在咖啡H. vastatrix 病理系统^14，29中?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blades DB80 HS	Leica	14035838383	Sectioning
Cacodylate buffer	EMS	# 11652	Fixation
Cotton Blue Lactophenol	Metaquímica	70SOLSIG024629	Staining
Formaldehyde	EMS	#15712	Fixation
Glutaraldehyde	EMS	#16216	Fixation
Historesin Kit	Technovit /EMS	#14653	Historesin for embedding
Hot plate	Dubesser	SSCD25X30-110V	Staining
Microscopy	Zeiss	#490040-0030-000	Image capture
Microtome (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Sectioning
Plastic molding cup tray	EMS	10176-30	Staining
Ruthenium red	LABHouse	#006004	Staining
Software Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Image capture
Vaccum pump	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	Fixation