Doppelfärbungsmethode zum Nachweis von Pektin in der Pflanzen-Pilz-Interaktion

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine mikroskopische Methode zum Nachweis von Pektin in der Kaffee-Pilz-Interaktion.

Zusammenfassung

Pflanzenzellen nutzen verschiedene strukturelle Mechanismen, entweder konstitutiv oder induzierbar, um sich vor einer Pilzinfektion zu schützen. Die Verkapselung ist ein effizienter induzierbarer Mechanismus, um die pilzliche Haustoria aus dem pflanzlichen Zell-Protoplasten zu isolieren. Umgekehrt ist Pektin, einer der polymeren Bestandteile der Zellwand, ein Ziel mehrerer pektolytischer Enzyme in nekrotrophen Wechselwirkungen. Hier wird ein Protokoll zum Nachweis von Pektin und Pilzhyphen durch optische Mikroskopie vorgestellt. Untersucht werden die pektinreiche Verkapselung in den Zellen von Kaffeeblättern, die mit dem Rostpilz Hemileia vastatrix infiziert sind, und die durch Cercospora coffeicola induzierte Mesophyll-Zellwandmodifikation . Läsionierte Blattproben wurden mit der Karnovsky-Lösung fixiert, dehydriert und für 2-4 Tage in Glykolmethacrylat eingebettet. Auf alle Schritte folgte ein Vakuumpumpen, um Luft in den Interzellularräumen zu entfernen und den Einbettungsprozess zu verbessern. Die eingebetteten Blöcke wurden in 5-7 μm dicke Abschnitte geschnitten, die auf einem mit Wasser bedeckten Glasobjektträger abgeschieden und anschließend 30 min lang auf 40 °C erhitzt wurden. Als nächstes wurden die Objektträger mit 5% Baumwollblau in Lactophenol doppelt gefärbt, um den Pilz nachzuweisen, und 0,05% Rutheniumrot in Wasser, um Pektin (saure Gruppen von Polyuronsäuren von Pektin) nachzuweisen. Es wurde festgestellt, dass pilzartige Haustorien von Hemileia vastatrix von Pektin eingekapselt sind. Bei der Kaffeezerkosporiose zeigten Mesophyllzellen eine Auflösung der Zellwände, und interzelluläre Hyphen und Konidiophoren wurden beobachtet. Die hier vorgestellte Methode ist effektiv, um eine Pektin-assoziierte Reaktion in der Pflanzen-Pilz-Interaktion nachzuweisen.

Einleitung

Zellwand-Abwehrmechanismen in Pflanzen sind entscheidend, um Pilzinfektionen einzudämmen. Studien haben über Veränderungen der Zellwanddicke und -zusammensetzung seit dem 19^{. Jahrhundert} berichtet ^1,2. Diese Veränderungen können durch einen pilzlichen Krankheitserreger induziert werden, der die Bildung einer Papille stimuliert, die verhindert, dass Pilze in die Zelle eindringen, oder könnte verwendet werden, um die Hyphen zu verkapseln, um den Wirtszellprotoplast von der pilzlichen Haustoria zu isolieren. Die Herstellung einer dynamischen Zellwandbarriere (d.h. Papillen und ein vollständig ummanteltes Haustorium) ist wichtig, um die Pflanzenresistenz zu fördern³. Histopathologische Studien zu pilzbedingten Erkrankungen haben das Auftreten dieser Mechanismen untersucht und die Zellwandpolymere Cellulose, Hemicellulose (Arabinoxylane) und Callose als Resistenzmechanismen gegen Pilzbefall^beschrieben 4,5,6,7.

Die Zellwand ist die erste Barriere gegen mikroorganismische Angriffe und beeinträchtigt die Pflanzen-Pilz-Interaktion. Pektische Polysaccharide bilden die Zellwand und machen etwa 30% der Zellwandzusammensetzung in Primärzellen von Eudicot-Pflanzen aus, in denen Homogalacturonen das am häufigsten vorkommende Polymer sind (etwa 60%)⁸. Der Golgi sezerniert komplexe Pektinverbindungen, die die galakturonischen Säureketten umfassen, die methyliert sein können oder nicht ^8,9. Seit 2012 weist die Literatur darauf hin, dass der Grad der Pektinmethylveresterung entscheidend für die Bestimmung der Verträglichkeit während der Infektion mit mikrobiellen pektischen Enzymen^10,11,12 ist. Daher sind Protokolle erforderlich, um das Vorhandensein und die Verteilung von pektischen Verbindungen in pflanzlich-pilzlichen Pathosystemen zu überprüfen.

Verschiedene Techniken wurden verwendet, um die Verkapselung von Papillen oder Haustorien nachzuweisen. Die verwendeten Referenzmethoden sind die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) von festsitzendem Gewebe und die Lichtmikroskopie von lebendem und fixiertem Gewebe. In Bezug auf TEM haben mehrere Studien die strukturelle Rolle von Zellwandappositionen bei der Pilzresistenz 13,14,15,16 gezeigt und dass die Verwendung von Lektinen und Antikörpern eine komplizierte Methode ist^, um Kohlenhydratpolymere zu lokalisieren ¹⁶. Studien zeigen jedoch, dass die Lichtmikroskopie ein wichtiger Ansatz ist und dass die histochemischen und immunhistochemischen Werkzeuge ein besseres Verständnis der Zusammensetzung von Papillen und Haustoriumhülle^{ermöglichen 6,7}.

Pathogene Pilze zeigen zwei Haupttypen von Lebensstilen: biotrophe und nekrotrophe. Biotrophe Pilze sind für ihre Ernährung auf lebende Zellen angewiesen, während nekrotrophe Pilze die Wirtszellen töten und dann in den toten Geweben leben¹⁷. In Lateinamerika ist Kaffeeblattrost, verursacht durch den Pilz Hemileia vastatrix, eine wichtige Krankheit bei Kaffeepflanzen^18,19. Hemileia vastatrix zeigt ein biotrophes Verhalten, und unter den strukturellen Veränderungen, die bei resistenten Kaffeespezies oder -sorten beobachtet wurden, wurden eine Überempfindlichkeitsreaktion, Ablagerungen von Callose, Cellulose und Lignin an den Zellwänden sowie Zellhypertrophie¹⁴ berichtet. Nach Kenntnis der Autoren berichtet die Literatur nicht über die Bedeutung von Pektin bei der Kaffeerostbeständigkeit. Auf der anderen Seite zielen nekrotrophe Pilze, die Zerkosporiose verursachen, auf Pektin über eine Reihe von Enzymen, die mit dem Zellwandabbau assoziiert sind, wie Pektinas und Polygalacturonase²⁰. Zerkosporiose im Kaffee, verursacht durch den Pilz Cercospora coffeicola ist auch eine große Bedrohung für Kaffeepflanzen^21,22. Dieser Pilz verursacht nekrotische Läsionen sowohl in Blättern als auch in Beeren. Nach der Penetration besiedelt C. coffeicola Pflanzengewebe über intrazelluläre und interzelluläre Wege^23,24,25.

Das vorliegende Protokoll untersucht das Vorhandensein von Pilzstrukturen und Pektin an den Zellwänden. Dieses Protokoll ist nützlich, um die Pflanzenreaktion zu identifizieren, die mit Pektin (mit rutheniumrotem Farbstoff gefärbt, der spezifisch für saure Gruppen von Polyuronsäuren von Pektin ist) verbunden ist, die vom Wirt in einer biotrophen Wechselwirkung mit Pilzen induziert wird. Es hilft auch, die Wirkung von nekrotrophen Pilzen auf den Abbau von pektischen Zellwänden zu überprüfen. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Doppelfärbungsmethode wirksam ist, um Strukturen und die Fortpflanzungsphase von Pilzen zu unterscheiden.

Protokoll

1. Herstellung der Pufferlösung und der Reagenzien

1. Bereiten Sie 2 M Cacodylatpuffer vor, indem Sie 4,28 g Natriumcacodylat zu 100 ml destilliertem Wasser hinzufügen und den pH-Wert mit 0,2 N HCl auf 7,25 einstellen.
2. Bereiten Sie 100 ml der Karnovsky-Fixierlösung vor, indem Sie 10 ml 25% wässriges Glutaraldehyd, 10 ml 10% wässriges Formaldehyd, 25 ml 2 M Cacodylatpuffer und 0,5 ml 0,5 M CaCl_{2 26} mischen. Erhöhen Sie das Volumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml.
   HINWEIS: Die Lösung kann 6 Monate im Kühlschrank aufbewahrt werden.
   ACHTUNG: Die Cacodylat-Pufferlösung ist giftig; Behandeln Sie daher die Fixierlösung in einem Abzug oder an einem offenen Bereich. Vermeiden Sie das Einatmen der Lösungsdämpfe und tragen Sie Handschuhe während der Handhabung.
3. Wässrige Hoagland-Nährlösung durch Mischen von Folgendem herstellen: 3 mM Ca(NO 3)2.4H 2 O, 2 mM NH 4 H₂PO 4, 5 mM KH 2 PO 4, 2 mM_MgSO 4.7H 2 O, 9.07 mM MnSO 4, 0.765 mM ZnSO 4.7H₂O, 46.4 mM H 3 BO 3, 0,09 mM Na₂MoO₄. _H2O, 0,01 mM_CuSO4 und 36 mM FeSO 4.7H2O als Eisen-EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)²⁷.

2. Pflanzenproben und Pilzimpfung

HINWEIS: Für Experimente an Blättern, die von Kaffeerost betroffen sind, fünf 2 Monate alte Sämlinge von Coffee arabica cv. Catuaí wurden in einem Gewächshaus im Zentrum für Kernenergie in der Landwirtschaft (CENA) der Universität von São Paulo, Piracicaba, Bundesstaat São Paulo, Brasilien, angebaut und gehalten.

1. Züchten Sie Kaffeepflanzen in 500 ml Kunststofftöpfen, die mit wässriger Hoagland-Nährlösung (pH-Wert von ~ 5,5) gefüllt sind, 4 Monate lang in einer Wachstumskammer, die bei 27 ± 3 ° C mit einer Photoperiode von 12 h gehalten wird, die von ^LED-Lampen bei einem Photonenfluss von 250 μmol Photonen s-1 ^m-2 erzeugt wird. Ersetzen Sie die Hoagland-Nährlösung 4 Monate lang jede Woche.
2. Beimpfen Sie vier expandierte Blätter von fünf Pflanzen auf ihren abaxialen Oberflächen mit 1 x 10³ H. vastatrix uredospores nach dem in Referenz²⁸ beschriebenen Verfahren. Nach der Impfung die Pflanzen 48 h im Dunkeln aufbewahren, indem Sie sie mit einer schwarzen Plastiktüte abdecken. Ernten Sie die Läsionen 30 Tage nach der Impfung.
3. Charakteristische Läsionen, die durch Cercospora coffeicola verursacht werden, aus Coffea arabica cv. Obatã-Pflanzen (Koordinaten: -22.906506126269942, -47.015075902025266) am Biologischen Institut, Campinas, Bundesstaat São Paulo, Brasilien. Bevor Sie die Probe verarbeiten, analysieren Sie die Läsionen in einem Stereomikroskop, um das Vorhandensein von Kaffee C. coffeicola conidia zu überprüfen. Montieren Sie dann einige Folien mit den Konidien, um die Ätiologie der Krankheit^{zu bestätigen 22}.

3. Probenentnahme, Fixierung und Dehydratisierung

1. Ernten Sie mit einem Skalpell und einer Pinzette eine ~ 10 mm^2-Blattprobe im mittleren Bereich der Läsion (gelbe Flecken; Abbildung 1) und tauchen Sie es in 30 ml Karnovsky-Fixierlösung ein (Abbildung 1 und Abbildung 2A). Der Fixierschritt kann 48 h im Kühlschrank erfolgen.
2. Mindestens viermal wird die Blattprobe mit einer Ölpumpe für jeweils 15 min einem niedrigen Vakuum (500-600 mBar) unterzogen, um die Durchlässigkeit der fixierenden Lösung im Blattgewebe zu erhöhen. Führen Sie diesen Schritt mit der Beispielrotation aus (Abbildung 1).
3. Nach der Fixierung wird die Blattprobe dreimal in 0,5 m Cacodylatpuffer (pH 7,2) gewaschen, der jeweils 5 min in destilliertem Wasser verdünnt ist, und dann in eine abgestufte ethanolische Serie (30%, 50%, 70%, 90% (2x) und 100% (2x)) für 15 min bei jeder Ethanolkonzentration überführt (Abbildung 1 und Abbildung 2B).

4. Historesin-Einbettungsverfahren

1. Übertragen Sie die Proben schrittweise in drei Schritten auf Glykolmethacrylat (GMA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie zunächst Lösung A her, indem Sie das GMA-Pulver (1 g) mit 100 ml Basisharz mischen (Historesin-Kit; Tabelle der Materialien) unter magnetischer Bewegung, und führen Sie dann die folgenden Schritte aus.
   1. Tauchen Sie die Proben in 1:2 Lösung A: 100% Ethanol für 3 h.
   2. Tauchen Sie die Proben in 1:1 Lösung A: 100% Ethanol für 3 h.
   3. Tauchen Sie die Proben für 2-4 Tage in ein reines Basisharz. Setzen Sie die Proben während dieses Schritts mindestens viermal täglich für 15 Minuten einem niedrigen Vakuum aus, gefolgt von einer Rotation.

5. Polymerisation

HINWEIS: Der Polymerisationsprozess erfordert 1,2 ml Kunststoffformen, Grundharz und Härter (siehe Materialtabelle für die Details des kommerziellen Kits).

1. Mischen Sie 15 ml Lösung A (Schritt 4.1) mit 1 ml des Härters in einem Becherglas mit Rotation für 2 Minuten, um die Polymerisationslösung (Lösung B) herzustellen.
2. Geben Sie 1,2 ml der Polymerisationslösung (Lösung B) in Kunststoffformen. Übertragen Sie die Läsionsblattproben mit einem Holzmeißel aus reinem Basisharz in Lösung B (Abbildung 2C). Vermeiden Sie die Verwendung einer Pinzette, da diese zu einer Zerkleinerung des Gewebes führen kann.
3. Stellen Sie sicher, dass die Blattproben schnell senkrecht zu den Kunststoffformen ausgerichtet werden, da Lösung B innerhalb von 5 Minuten schnell viskos wird. Mehr als eine läsionierte Blattprobe kann in eine einzige Form gegeben werden.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, den obigen Schritt mehrmals zu üben, bevor Sie sich für viele Proben bewerben. Wenn es viele Proben gibt, ist die Polymerisationszeit zwischen den Formen unterschiedlich und die senkrechte Ausrichtung der Blattproben kann schwierig zu erreichen sein.
4. Wenn die senkrechte Ausrichtung der Blattproben erreicht ist, warten Sie 30 Minuten und übertragen Sie dann die Kunststoffform in eine Kunststoff- oder Glaskammer, die Kieselgel enthält, um Feuchtigkeit zu vermeiden. Warten Sie 2-3 h auf die Polymerisation.
5. Sobald das Harz und die Blattprobe nach der 2-3 h Periode polymerisiert sind, lösen Sie den resultierenden Block von der Kunststoffform, indem Sie den Blockboden mit einer Schleiffeile schleifen. Kleben Sie dann den Block auf ein Stück Holz (Abbildung 2D).

6. Schneiden

1. Mit einem rotativen Mikrotom, das mit 8 cm langen Stahlklingen (Abbildung 2E) ausgestattet ist, schneiden Sie den Block in 5 μm dicke Abschnitte. Legen Sie die Abschnitte auf Glasobjektträger, die mit destilliertem Wasser bedeckt sind. Übertragen Sie die Objektträger mit den über Wasser schwebenden Abschnitten auf eine heiße Platte bei 40 ° C, um sie zu trocknen und die Haftung der Abschnitte an den Glasobjektträgern zu fördern.
2. Beschriften Sie die Glasobjektträger nach dem Trocknen (Abbildung 2F) mit dem Blockreferenznamen und der Objektträgernummer.

7. Doppelter Färbeprozess

1. Decken Sie die Abschnitte mit 2 ml 5% Baumwollblau in Lactophenol (40% Glycerin, 20% Phenol und 20% Milchsäure in Wasser) ab und erhitzen Sie sie auf einer heißen Platte bei 45 °C für 5 min (Abbildung 3A).
2. Entfernen Sie den überschüssigen Farbstoff, indem Sie den Objektträger dreimal in einem mit destilliertem Wasser gefüllten Becherglas waschen (Abbildung 3B-D).
3. Fleck mit 2 ml 0,01% Rutheniumrot in Wasser für 1 min (Abbildung 3E).
4. Entfernen Sie den überschüssigen Farbstoff, indem Sie den Objektträger dreimal in einem mit destilliertem Wasser gefüllten Becherglas waschen (Abbildung 3F,G).
5. Legen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser über die Abschnitte und bedecken Sie die Abschnitte mit einem 24 mm x 60 mm großen Deckglas für die Durchführung einer Lichtmikroskopie-Analyse.

Ergebnisse

Die baumwollblaue Lactophenolfärbung auf dem GMA-eingebetteten Abschnitt zeigte das Vorhandensein mehrerer Pilzstrukturen zwischen und in Kaffeemesophyllzellen sowohl in biotrophen als auch in nekrotrophen Pilzinteraktionen.

Im biotrophen Pathosystem erscheinen Hemileia vastatrix-Hyphen mit Zellwänden und der dichte Protoplastengehalt bei der Färbung mit der Doppelfärbungsmethode sowohl im schwammigen als auch im Palisadenparenchym dunkelblau (Abbildung

Diskussion

Die vorliegende Arbeit stellt einen alternativen histochemischen Test zur Doppelfärbung vor, um die Pektinzusammensetzung von Zellwänden zu untersuchen, die Haustoria in einem biotrophen Pathosystem verkapseln. Ziel ist es auch, die Wirksamkeit der Methode zum Nachweis von nekrotrophen Pilzen und dadurch induzierten Zellwandveränderungen nachzuweisen. Hier kann Pektin der Kaffeeparenchym-Zellwände sowohl den Hals als auch das Haustorium des Rostpilzes Hemileia vastatrix verkapseln. Silva et al. haben auch di...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blades DB80 HS	Leica	14035838383	Sectioning
Cacodylate buffer	EMS	# 11652	Fixation
Cotton Blue Lactophenol	Metaquímica	70SOLSIG024629	Staining
Formaldehyde	EMS	#15712	Fixation
Glutaraldehyde	EMS	#16216	Fixation
Historesin Kit	Technovit /EMS	#14653	Historesin for embedding
Hot plate	Dubesser	SSCD25X30-110V	Staining
Microscopy	Zeiss	#490040-0030-000	Image capture
Microtome (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Sectioning
Plastic molding cup tray	EMS	10176-30	Staining
Ruthenium red	LABHouse	#006004	Staining
Software Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Image capture
Vaccum pump	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	Fixation