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요약

이 프로토콜은 커피-곰팡이 상호작용에서 펙틴을 검출하는 현미경 방법을 기술한다.

초록

식물 세포는 곰팡이 감염으로부터 자신을 방어하기 위해 구성 적 또는 유도성 인 다른 구조적 메커니즘을 사용합니다. 캡슐화는 식물 세포 원형질체로부터 진균성 하우스토리아를 분리하는 효율적인 유도성 메카니즘이다. 반대로, 세포벽의 고분자 성분 중 하나 인 펙틴은 괴사 성 상호 작용에서 여러 펙톨리아 효소의 표적입니다. 여기에서, 광학 현미경을 통해 펙틴 및 진균 균사를 검출하는 프로토콜이 제시된다. 녹균인 헤밀리아 바스타트릭 스에 의해 감염된 커피 잎의 세포에서 펙틴이 풍부한 캡슐화와 세르코스포라 코페이콜라 에 의해 유도된 중엽 세포벽 변형이 조사된다. Lesioned 잎 샘플을 Karnovsky 용액으로 고정시키고, 탈수시키고, 2-4일 동안 글리콜 메타크릴레이트에 포매하였다. 모든 단계는 세포간 공간에서 공기를 제거하고 매립 과정을 개선하기 위해 진공 펌핑으로 이어졌다. 매립된 블록을 5-7 μm 두께의 섹션으로 절편화하고, 물로 덮인 유리 슬라이드 상에 증착시키고, 이어서 40°C에서 30분 동안 가열하였다. 다음으로, 슬라이드를 락토페놀 중의 5% 코튼 블루로 이중 염색하여 곰팡이를 검출하고, 물에서 0.05% 루테늄 레드로 염색하여 펙틴(펙틴의 폴리우론산의 산성기)을 검출하였다. Hemileia vastatrix 의 곰팡이 haustoria는 펙틴에 의해 캡슐화 된 것으로 밝혀졌습니다. 커피 자궁 경부증에서 중엽 세포는 세포벽의 용해를 나타 냈으며 세포 간 균사와 conidiophores가 관찰되었습니다. 여기에 제시된 방법은 식물-진균 상호작용에서 펙틴-관련 반응을 검출하는데 효과적이다.

서문

식물의 세포벽 방어 메커니즘은 곰팡이 감염을 억제하는 데 중요합니다. 연구에 따르면 19세기 1,2 이후 세포벽 두께와 조성의 변화가보고되었습니다. 이러한 변화는 유두의 형성을 자극하는 곰팡이 병원체에 의해 유도 될 수 있으며, 이는 곰팡이가 세포에 들어가는 것을 방지하거나 진균 성 하우스토리아에서 숙주 세포 원형질체를 분리하기 위해 균사를 캡슐화하는 데 사용될 수 있습니다. 동적 세포벽 장벽 (즉, 유두와 완전히 둘러싸인 haustorium)의 생산은 식물 저항을 촉진시키는 데 중요합니다3. 곰팡이 관련 질환에 대한 조직병리학적 연구는 이러한 메카니즘의 발생을 조사하였고, 진균 공격에 대한 내성 메카니즘으로서 세포벽 중합체, 셀룰로스, 헤미셀룰로오스(arabinoxylans) 및 칼로스를기술하였다 4,5,6,7.

세포벽은 미생물 공격에 대한 첫 번째 장벽으로, 식물과 곰팡이 상호 작용을 손상시킵니다. 펙틱 다당류는 세포벽을 구성하며 호모갈락투로난이 가장 풍부한 폴리머인 유디코트 식물의 일차 세포에서 세포벽 조성물의 약 30%를 차지한다(대략 60%)8. 골지는 갈락투론산 사슬을 포함하는 복합 펙틴 화합물을 분비하며, 이는메틸화 8,9일 수도 있고 아닐 수도 있다. 2012 이후, 문헌은 펙틴 메틸 에스테르 화의 정도가 미생물 펙틱 효소10,11,12에 의한 감염시 상용성을 결정하는 데 중요하다고 지적했다. 따라서, 식물-진균 병리계에서 펙틱 화합물의 존재 및 분포를 검증하기 위한 프로토콜이 요구된다.

유두나 하우스토리아의 캡슐화를 검출하기 위해 다양한 기술들이 사용되어 왔다. 사용 된 참조 방법은 고정 조직의 투과 전자 현미경 (TEM)과 살아있는 및 고정 조직의 광 현미경입니다. TEM과 관련하여, 몇몇 연구는 곰팡이 저항성 13,14,15,16에서 세포벽 임명의 구조적 역할을 입증했으며, 렉틴과 항체의 사용은 탄수화물 중합체16을 위치시키는 복잡한 방법이라는 것을 입증했다. 그러나 연구에 따르면 광 현미경 검사는 중요한 접근법이며 조직 화학 및 면역 조직 화학 도구는 유두와 haustorium encasement 6,7의 구성을 더 잘 이해할 수 있습니다.

병원성 곰팡이는 두 가지 주요 유형의 생활 방식을 보여줍니다 : 생물 영양 및 괴사. 생물 영양 진균은 영양을 위해 살아있는 세포에 의존하는 반면, 괴사 성 곰팡이는 숙주 세포를 죽인 다음 죽은 조직에 산다17. 라틴 아메리카에서는 곰팡이 헤밀리아 vastatrix에 의해 야기 된 커피 잎 녹이 커피 작물에서 중요한 질병입니다18,19. 헤밀리아 바스타트릭스는 생물영양 거동을 나타내고, 내성 커피 종 또는 품종에서 관찰된 구조적 변화 중에서도, 과민성 반응, 세포벽 상에 칼로스, 셀룰로스 및 리그닌의 침착, 뿐만 아니라 세포 비대(14)가 보고되었다. 저자의 지식에 따르면, 문헌은 커피 녹 저항에서 펙틴의 중요성에 대한 정보를보고하지 않습니다. 한편, 자궁경부정맥증을 유발하는 괴사성 진균은 펙티나제 및 폴리갈락투로나제20과 같은 세포벽 분해와 관련된 일련의 효소를 통해 펙틴을 표적으로 한다. 곰팡이 Cercospora coffeicola에 의해 야기 된 커피의 Cercosporiosis는 또한 커피 작물21,22에 대한 주요 위협입니다. 이 곰팡이는 잎과 열매 모두에서 괴사 성 병변을 일으 킵니다. 침투 후, C. coffeicola는 세포 내 및 세포 간 경로23,24,25를 통해 식물 조직을 식민지화합니다.

본 프로토콜은 세포벽에 곰팡이 구조 및 펙틴의 존재를 조사한다. 이 프로토콜은 곰팡이와의 생체 영양 상호 작용에서 숙주에 의해 유도되는 펙틴 (펙틴의 폴리 우론 산의 산성 그룹에 특이적인 루테늄 레드 염료로 염색)과 관련된 식물 반응을 확인하는 데 유용합니다. 또한 괴사 성 곰팡이가 펙트 세포벽의 분해에 미치는 영향을 확인하는 데 도움이됩니다. 본 결과는 이중 염색 방법이 곰팡이의 구조와 생식 단계를 구별하는 데 효과적이라는 것을 나타냅니다.

프로토콜

1. 완충용액 및 시약의 제조

  1. 증류수 100 mL에 카코딜레이트 나트륨 4.28 g을 첨가하여 2 M 카코딜레이트 완충액을 제조하고 0.2 N HCl로 pH를 7.25로 조정하였다.
  2. 100 mL의 25% 수성 글루타르알데히드, 10% 수성 포름알데히드 10 mL, 25 mL의 2 M 카코딜레이트 완충액, 및 0.5 mL의 0.5 MCaCl2 26을 혼합하여 카르노프스키 고정제 용액 100 mL를 제조하였다. 증류수로 부피를 100 mL까지 구성하십시오.
    참고 : 솔루션은 6 개월 동안 냉장고에 보관할 수 있습니다.
    주의: 카코딜레이트 완충 용액은 독성이 있습니다. 따라서 흄 후드 또는 열린 영역에서 고정 솔루션을 처리하십시오. 취급하는 동안 용액 증기를 흡입하지 말고 장갑을 착용하십시오.
  3. 다음을 혼합하여 Hoagland 수성 영양액을 제조하였다: 3 mM Ca(NO3)2.4H2O, 2 mM NH4H2PO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 9.07 mM MnSO4, 0.765 mM ZnSO4.7H2O, 46.4 mM H3BO3, 0.09 mMNa2MoO4. H2O, 0.01 mM CuSO4, 및 36 mM FeSO4.7H2O로서철-EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)27.

2. 식물 샘플 및 곰팡이 접종

참고 : 커피 녹에 의해 영향을받는 잎에 대한 실험의 경우, 커피 아라비카 cv의 다섯 2 개월 된 묘목. Catuaí는 브라질 상파울루 주 피라시카바 상파울루 대학의 농업 원자력 에너지 센터 (CENA)의 온실에서 재배되고 보관되었습니다.

  1. Hoagland 수용액(pH∼5.5)으로 채워진 500 mL 플라스틱 냄비에 커피 식물을 재배하고, 27 ± 3°C로 유지된 성장 챔버에서 250 μmol 광자 s-1 m-2 의 광자 플럭스에서 LED 램프에 의해 생성된 12시간 광주기로 4개월 동안 성장시킨다. Hoagland 영양 용액을 4 개월 동안 매주 교체하십시오.
  2. 다섯 개의 식물로부터 네 개의 확장된 잎을 그들의 비축 표면에 1 x 103H. vastatrix 우레도포자로 접종하고, 참고문헌28에 기재된 방법에 따른다. 예방 접종 후, 검은 비닐 봉지로 식물을 덮어서 어둠 속에서 48 시간 동안 보관하십시오. 접종 후 30 일 후에 병변을 수확하십시오. 
  3. Coffea arabica cv의 Cercospora coffeicola에 의한 수확 특징적인 병변. Obatã 식물은 브라질 상파울루 주 캄피나스 생물 연구소에 위치하고 있습니다 (좌표 : -22.906506126269942, -47.015075902025266). 샘플을 처리하기 전에 입체 현미경으로 병변을 분석하여 커피 C. coffeicola conidia의 존재를 확인합니다. 이어서, 질병 병인학(22)을 확인하기 위해 코니디아와 함께 일부 슬라이드를 장착한다.

3. 샘플 수확, 고정 및 탈수

  1. 메스와 트위저를 사용하여, 병변의 중간 부위에서 ∼10mm2 잎 샘플을 수확한다(황색 반점; 그림 1) 30mL의 Karnovsky 고정 용액에 담그십시오(그림 1 및 그림 2A). 고정 단계는 냉장고에서 48 시간 동안 수행 할 수 있습니다.
  2. 적어도 4회 동안, 잎 샘플을 저진공(500-600 mBar)으로 하여 각각 15분 동안 오일 펌프를 사용하여 잎 조직 내의 고정 용액의 투과성을 증가시켰다. 샘플 회전을 사용하여 이 단계를 수행합니다(그림 1).
  3. 고정 후, 잎 샘플을 증류수에 희석한 0.5 M 카코딜레이트 완충액(pH 7.2)에서 각각 5분 동안 3회 세척한 다음, 이를 등급별 에탄올 계열(30%, 50%, 70%, 90%(2x) 및 100%(2x))로 옮겨 각 에탄올 농도에서 15분 동안 처리하였다(도 1 및 도 2B).

4. 고용인 임베딩 절차

  1. 점차적으로 샘플을 글리콜 메타 크릴 레이트 (GMA)로 세 단계로 옮기고 제조업체의 지시에 따라 수행하십시오. 먼저, GMA 분말(1 g)을 100 mL의 염기성 수지(historesin kit; 물자 표) 자기 교반하에 아래 단계를 따르십시오.
    1. 샘플을 1:2 용액 A:100% 에탄올에 3시간 동안 담그십시오.
    2. 샘플을 1:1 용액 A:100% 에탄올에 3시간 동안 침지시킨다.
    3. 샘플을 2-4 일 동안 순수한 염기성 수지에 담그십시오. 이 단계 동안, 샘플을 15분 동안 하루에 적어도 네 번 저진공으로 가하고, 이어서 회전시킨다.

5. 중합

참고: 중합 공정에는 1.2mL 플라스틱 몰드, 기본 수지 및 경화제가 필요합니다(상업용 키트의 자세한 내용은 재료 표 참조).

  1. 용액 A 15 mL(단계 4.1)를 비이커에서 경화제 1 mL와 섞어 2분 동안 회전시켜 중합 용액(용액 B)을 생성한다.
  2. 중합 용액 (용액 B) 1.2 mL를 플라스틱 몰드에 넣는다. 나무 픽을 사용하여 병변 잎 샘플을 순수한 기본 수지에서 용액 B로 옮깁니다 (그림 2C). 핀셋은 조직 분쇄를 일으킬 수 있으므로 사용하지 마십시오.
  3. 용액 B가 5분 이내에 빠르게 점성이 되므로 잎 샘플을 플라스틱 몰드에 수직으로 신속하게 방향을 정하십시오. 하나 이상의 병변 잎 샘플을 단일 주형에 배치할 수 있다.
    참고 : 많은 샘플을 신청하기 전에 위의 단계를 여러 번 연습하는 것이 좋습니다. 많은 샘플이 존재하는 경우, 주형들 사이에서 중합 시간이 상이하고, 잎 샘플의 수직 배향은 달성하기 어려울 수 있다.
  4. 잎 샘플의 수직 방향이 달성되면 30 분 동안 기다린 다음 플라스틱 몰드를 실리카 겔이 들어있는 플라스틱 또는 유리 챔버로 옮겨 습도를 방지하십시오. 중합을 위해 2-3 시간 동안 기다리십시오.
  5. 일단 수지와 잎 샘플이 2-3 h 기간 후에 중합되면, 블록 베이스를 샌딩 파일로 샌딩하여 생성된 블록을 플라스틱 몰드로부터 분리한다. 그런 다음 블록을 나무 조각에 붙입니다(그림 2D).

6. 단면화

  1. 8cm 강철 블레이드가 장착된 회전식 마이크로톰(그림 2E)을 사용하여 블록을 5μm 두께의 섹션으로 자릅니다. 섹션을 증류수로 덮인 유리 슬라이드 위에 놓습니다. 물 위에 떠 있는 섹션과 함께 슬라이드를 40°C의 핫플레이트로 옮겨 건조시키고 유리 슬라이드에 대한 섹션의 접착을 촉진한다.
  2. 건조 후(그림 2F), 유리 슬라이드에 블록 참조 이름과 슬라이드 번호로 레이블을 붙입니다.

7. 이중 염색 과정

  1. 섹션을 락토페놀(물 중 40% 글리세롤, 20% 페놀 및 20% 젖산)의 5% 코튼 블루 2mL로 덮고 45°C에서 5분 동안 핫플레이트에서 가열합니다(그림 3A).
  2. 슬라이드를 증류수로 채워진 비이커에서 3회 세척하여 과량의 염료를 제거하였다(도 3B-D).
  3. 2 mL의 0.01% 루테늄 레드를 물에 1분 동안 얼룩지게 한다(그림 3E).
  4. 증류수가 채워진 비이커에서 슬라이드를 3회 세척하여 과량의 염료를 제거하였다(도 3F, G).
  5. 섹션 위에 증류수 한 방울을 넣고 가벼운 현미경 분석을 수행하기 위해 24mm x 60mm 커버슬립으로 섹션을 덮습니다.

결과

GMA 임베디드 섹션의 코튼 블루 락토페놀 염색은 생영양 및 괴사성 진균 상호작용 모두에서 커피 메소필 세포 사이와 내부 사이에 여러 곰팡이 구조의 존재를 밝혀냈다.

생물영양 병리계에서, 이중 염색 방법을 사용하여 염색할 때, 세포벽 및 치밀한 원형질체 함량을 함유하는 헤밀리아 vastatrix hyphae는 해면질과 팰리세이드 실질종 모두에서 진한 파란색으로 나타난다(

토론

본 연구는 생물영양 병리계에서 하우스토리아를 캡슐화하는 세포벽의 펙틴 조성을 조사하기 위해 대안적인 이중 염색 조직화학 시험을 도입한다. 그 목적은 또한 그것에 의해 유도된 괴사성 균류 및 세포벽 변화를 검출하는 방법의 효능을 입증하는 것이다. 여기서, 커피 실질마 세포벽의 펙틴은 녹균인 헤밀리아 혈관염의 목과 하우스토리움을 모두 캡슐화할 수 있다. 실바 등은 또한 커피-...

공개

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 말

저자들은 허드슨 W. P. 드 카르발호 박사에게 이 작품을 개발하기 위한 지원에 감사를 표하고 싶다. 저자들은 또한 광 현미경 검사 시설을 제공 한 전자 현미경 연구소 ''엘리엇 와타나베 키타 지마 교수''에 감사드립니다. 저자들은 식물 재료에 병변을 공급해 준 Flávia Rodrigues Alves Patrício 박사에게 감사드립니다.

자료

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Blades DB80 HSLeica14035838383Sectioning
Cacodylate bufferEMS# 11652Fixation
Cotton Blue LactophenolMetaquímica70SOLSIG024629Staining
FormaldehydeEMS#15712Fixation
GlutaraldehydeEMS#16216Fixation
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Microtome (Leica RM 2540)Leica149BIO000C1 14050238005Sectioning
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Ruthenium redLABHouse#006004Staining
Software Axion VisionZeiss#410130-0909-000Image capture
Vaccum pumpPrismatec131 TIPO 2 V.C.Fixation

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