植物-真菌相互作用におけるペクチンを検出する二重染色法

要約

このプロトコルは、コーヒー - 真菌相互作用におけるペクチンを検出するための顕微鏡的方法を記載する。

要約

植物細胞は、真菌感染から身を守るために、構成的または誘導性のいずれかの異なる構造機構を使用する。カプセル化は、植物細胞プロトプラストから真菌ハウストリアを単離するための効率的な誘導可能な機構である。逆に、細胞壁のポリマー成分の1つであるペクチンは、壊死的相互作用におけるいくつかのペプチド分解酵素の標的である。ここでは、光学顕微鏡によってペクチンおよび真菌菌糸を検出するためのプロトコルが提示される。錆病菌 ヘミレイア・バスタトリックス に感染したコーヒー葉の細胞へのペクチンリッチなカプセル化と 、セルコスポラ・コフェイコーラ によって誘導された葉肉細胞壁修飾が調査される。病変葉サンプルをカルノフスキー溶液で固定し、脱水し、グリコールメタクリレートに2〜4日間包埋した。すべてのステップに続いて、細胞間空間内の空気を除去し、包埋プロセスを改善するための真空ポンピングが続いた。埋め込まれたブロックを厚さ5〜7μmのセクションに切断し、これを水で覆われたスライドガラス上に堆積させ、続いて40°Cで30分間加熱した。次に、スライドをラクトフェノール中の5%コットンブルーで二重染色して真菌を検出し、水中の0.05%ルテニウムレッドでペクチン(ペクチンのポリウロン酸の酸性基)を検出した。 ヘミレイア・バスタトリックスの 真菌ハウストリアはペクチンによってカプセル化されていることが判明した。コーヒーセルコスポリオーシスでは、葉肉細胞が細胞壁の溶解を示し、細胞間菌糸および分生子色素が観察された。ここで提示される方法は、植物−真菌相互作用におけるペクチン関連応答を検出するのに有効である。

概要

植物の細胞壁防御機構は、真菌感染を抑制するために重要である。研究は、19^世紀以来の細胞壁の厚さと組成の変化を報告している^1,2。これらの変化は、真菌が細胞に入るのを妨げる乳頭の形成を刺激する真菌病原体によって誘発され得るか、または真菌ハウストリアから宿主細胞プロトプラストを単離するために菌糸を封入するために使用することができる。動的細胞壁障壁(すなわち、乳頭および完全に包まれたハウストリウム)の産生は、植物抵抗性を促進するために重要である³。真菌関連疾患に関する病理組織学的研究は、これらのメカニズムの発生を調査し、細胞壁ポリマー、セルロース、ヘミセルロース(アラビノキシラン)、およびカロースを真菌攻撃に対する耐性メカニズムとして記述している⁴、⁵、^6、7。

細胞壁は微生物の攻撃に対する最初の障壁であり、植物 - 真菌相互作用を損なう。ペクティック多糖類は細胞壁を構成し、ホモガラクツロナンが最も豊富なポリマーである真二子植物の初代細胞におけ....

プロトコル

緩衝溶液及び試薬の調製

1. 100 mLの蒸留水に4.28 gのカコジル酸ナトリウムを加えて2 Mカコジル酸緩衝液を調製し、0.2 N HClでpHを7.25に調整します。
2. 10mLの25%グルタルアルデヒド水溶液、10mLの10%ホルムアルデヒド水溶液、25mLの2Mカコジル酸緩衝液、および0.5mLの0.5M CaCl2₂₆を混合して、100mLのカルノフスキー固定液を調製する。蒸留水で100mLまでの容量を作ります。
   注:溶液は冷蔵庫に6ヶ月間保管することができます。
   警告: カコジル酸緩衝溶液は有毒です。したがって、固定液溶液をヒュームフードまたはオープンエリアで処理してください。溶液蒸気を吸い込まないようにし、取り扱い中は手袋を着用してください。
3. 3 mM Ca(_NO3)2.4H 2 O、2 mM NH 4_{H2 PO4}、5 mM KH 2_PO4、2 mMMgSO 4.7H₂O、9.07 mM MnSO 4、0.765 mM ZnSO_{4.7H 2 O、}46.4 mM_H3BO₃

結果

GMA包埋部のコットンブルーラクトフェノール染色は、生物栄養性および壊死性真菌相互作用の両方において、コーヒー葉肉細胞間および内部にいくつかの真菌構造の存在を明らかにした。

生物栄養病原系において、二重染色法を用いて染色すると、細胞壁および緻密なプロトプラスト含量を含む ヘミレイア・バスタトリクス 菌糸は、海綿状および柵状実質の両方.......

ディスカッション

本研究は、ハウストリアを生物栄養病態系に封入する細胞壁のペクチン組成を調べるための代替二重染色組織化学的試験を導入する。その目的はまた、壊死性真菌およびそれによって誘導される細胞壁変化を検出する方法の有効性を実証することである。ここで、コーヒー実質細胞壁のペクチンは、錆病菌ヘミレイア・バスタトリクスの首とハウスリウムの両方をカプセル化すること?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blades DB80 HS	Leica	14035838383	Sectioning
Cacodylate buffer	EMS	# 11652	Fixation
Cotton Blue Lactophenol	Metaquímica	70SOLSIG024629	Staining
Formaldehyde	EMS	#15712	Fixation
Glutaraldehyde	EMS	#16216	Fixation
Historesin Kit	Technovit /EMS	#14653	Historesin for embedding
Hot plate	Dubesser	SSCD25X30-110V	Staining
Microscopy	Zeiss	#490040-0030-000	Image capture
Microtome (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Sectioning
Plastic molding cup tray	EMS	10176-30	Staining
Ruthenium red	LABHouse	#006004	Staining
Software Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Image capture
Vaccum pump	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	Fixation