Metodo a doppia colorazione per rilevare la pectina nell'interazione pianta-fungo

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo microscopico per rilevare la pectina nell'interazione caffè-fungo.

Abstract

Le cellule vegetali utilizzano diversi meccanismi strutturali, sia costitutivi che inducibili, per difendersi dalle infezioni fungine. L'incapsulamento è un meccanismo inducibile efficiente per isolare la haustoria fungina dal protoplasto cellulare vegetale. Al contrario, la pectina, uno dei componenti polimerici della parete cellulare, è un bersaglio di diversi enzimi pectolitici nelle interazioni necrotrofiche. Qui viene presentato un protocollo per rilevare la pectina e le ife fungine attraverso la microscopia ottica. Vengono studiati l'incapsulamento ricco di pectina nelle cellule delle foglie di caffè infettate dal fungo ruggine Hemileia vastatrix e la modificazione della parete cellulare mesofilla indotta da Cercospora coffeicola . I campioni di foglie lesionate sono stati fissati con la soluzione di Karnovsky, disidratati e incorporati nel glicole metacrilato per 2-4 giorni. Tutte le fasi sono state seguite dal pompaggio del vuoto per rimuovere l'aria negli spazi intercellulari e migliorare il processo di incorporamento. I blocchi incorporati sono stati sezionati in sezioni spesse 5-7 μm, che sono state depositate su un vetrino coperto d'acqua e successivamente riscaldate a 40 °C per 30 min. Successivamente, i vetrini sono stati doppiamente colorati con il 5% di blu di cotone in lattofenolo per rilevare il fungo e lo 0,05% di rosso rutenio in acqua per rilevare la pectina (gruppi acidi di acidi poliuronici della pectina). Le haustoria fungine di Hemileia vastatrix sono risultate incapsulate dalla pectina. Nella cercosporiosi del caffè, le cellule mesofille hanno mostrato la dissoluzione delle pareti cellulari e sono state osservate ife e conidiofori intercellulari. Il metodo qui presentato è efficace per rilevare una risposta associata alla pectina nell'interazione pianta-funghi.

Introduzione

I meccanismi di difesa della parete cellulare nelle piante sono cruciali per frenare l'infezione fungina. Gli studi hanno riportato cambiamenti nello spessore e nella composizione della parete cellulare dal 19^° secolo ^1,2. Questi cambiamenti possono essere indotti da un agente patogeno fungino che stimola la formazione di una papilla, che impedisce ai funghi di entrare nella cellula o potrebbe essere utilizzato per incapsulare le ife per isolare il protoplasto della cellula ospite dalla haustoria fungina. La produzione di una barriera dinamica della parete cellulare (cioè papille e un haustorio completamente incassato) è importante per promuovere la resistenza delle piante³. Studi istopatologici sulle malattie fungine hanno indagato l'insorgenza di questi meccanismi e hanno descritto i polimeri della parete cellulare, la cellulosa, l'emicellulosa (arabinoxilani) e la callosio come meccanismi di resistenza all'attacco fungino 4,5,6,7.

La parete cellulare è la prima barriera contro l'attacco di microrganismi, compromettendo l'interazione pianta-fungo. I polisaccaridi pectici compongono la parete cellulare e rappresentano circa il 30% della composizione della parete cellulare nelle cellule primarie delle piante di eudico in cui gli omogalacturonani sono il polimero più abbondante (circa il 60%)⁸. Il Golgi secerne composti complessi di pectina che compongono le catene di acido galatturonico, che possono o meno essere metilate ^8,9. Dal 2012, la letteratura ha sottolineato che il grado di esterificazione della pectina metile è fondamentale per determinare la compatibilità durante l'infezione da enzimi pectici microbici 10,11,12. Pertanto, sono necessari protocolli per verificare la presenza e la distribuzione di composti pectici nei patosistemi pianta-fungina.

Varie tecniche sono state utilizzate per rilevare l'incapsulamento di papille o haustoria. I metodi di riferimento utilizzati sono la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di tessuti fissi e la microscopia ottica di tessuti viventi e fissi. Per quanto riguarda il TEM, diversi studi hanno dimostrato il ruolo strutturale delle apposizioni della parete cellulare nella resistenza fungina 13,14,15,16 e che l'uso di lectine e anticorpi è un metodo complesso per localizzare i polimeri di carboidrati¹⁶. Tuttavia, gli studi dimostrano che la microscopia ottica è un approccio importante e che gli strumenti istochimici e immunoistochimici consentono una migliore comprensione della composizione delle papille e dell'involucro dell'haustorium ^6,7.

I funghi patogeni mostrano due tipi principali di stili di vita: biotrofico e necrotrofico. I funghi biotrofici dipendono dalle cellule viventi per la loro nutrizione, mentre i funghi necrotrofici uccidono le cellule ospiti e quindi vivono nei tessuti morti¹⁷. In America Latina, la ruggine delle foglie di caffè, causata dal fungo Hemileia vastatrix, è una malattia importante nelle colture di caffè^18,19. Hemileia vastatrix presenta un comportamento biotrofico e, tra i cambiamenti strutturali osservati in specie o cultivar di caffè resistenti, sono stati riportati una risposta di ipersensibilità, deposizione di callosio, cellulosa e lignina sulle pareti cellulari, nonché ipertrofia cellulare¹⁴. Per quanto a conoscenza degli autori, la letteratura non riporta informazioni sull'importanza della pectina nella resistenza alla ruggine del caffè. D'altra parte, i funghi necrotrofici che causano la cercosporiosi prendono di mira la pectina attraverso una serie di enzimi associati alla degradazione della parete cellulare, come le pectinasi e la poligalatturonasi²⁰. La cercosporiosi nel caffè, causata dal fungo Cercospora coffeicola è anche una grave minaccia per le colture di caffè^21,22. Questo fungo provoca lesioni necrotiche sia nelle foglie che nelle bacche. Dopo la penetrazione, C. coffeicola colonizza i tessuti vegetali attraverso percorsi intracellulari e intercellulari 23,24,25.

Il presente protocollo indaga la presenza di strutture fungine e pectina sulle pareti cellulari. Questo protocollo è utile per identificare la risposta vegetale associata alla pectina (colorata con colorante rosso rutenio, che è specifico per i gruppi acidi degli acidi poliuronici della pectina), indotta dall'ospite in un'interazione biotrofica con il fungo. Aiuta anche a verificare l'effetto dei funghi necrotrofici sulla degradazione delle pareti cellulari pectiche. I risultati attuali indicano che il metodo della doppia colorazione è efficace per discriminare le strutture e la fase riproduttiva dei funghi.

Protocollo

1. Preparazione della soluzione tampone e dei reagenti

1. Preparare il tampone di cacodilato da 2 M aggiungendo 4,28 g di cacodilato di sodio a 100 ml di acqua distillata e regolare il pH a 7,25 con 0,2 N HCl.
2. Preparare 100 mL della soluzione fissativa Karnovsky mescolando 10 mL di glutaraldeide acquosa al 25%, 10 mL di formaldeide acquosa al 10%, 25 mL di tampone cacodilato 2 M e 0,5 mL di CaCl_{2 26}. Portare il volume a 100 ml con acqua distillata.
   NOTA: La soluzione può essere conservata in frigorifero per 6 mesi.
   ATTENZIONE: La soluzione tampone di cacodilato è tossica; pertanto, maneggiare la soluzione fissativa in una cappa aspirante o in un'area aperta. Evitare di inalare i vapori della soluzione e indossare guanti durante la manipolazione.
3. Preparare la soluzione nutritiva acquosa di Hoagland mescolando quanto segue: 3 mM Ca(NO₃)_{2.4H 2}O, 2 mM NH₄H₂PO₄, 5 mM KH₂PO₄, 2 mM MgSO_{4.7H 2}O, 9.07 mM MnSO₄, 0.765 mM ZnSO_{4.7H 2}O, 46.4 mM H₃BO₃, 0,09 mM Na₂MoO₄. H₂O, 0,01 mM CuSO₄ e 36 mM FeSO 4,7H₂O come ferro-EDTA (acido tetraacetico etilendiammina)²⁷.

2. Campioni di piante e inoculazione di funghi

NOTA: Per esperimenti su foglie affette da ruggine di caffè, cinque piantine di caffè arabica cv di 2 mesi. I Catuaí sono stati coltivati e tenuti in una serra presso il Centro di Energia Nucleare in Agricoltura (CENA) dell'Università di San Paolo, Piracicaba, Stato di San Paolo, Brasile.

1. Coltiva piante di caffè in vasi di plastica da 500 ml riempiti con soluzione nutritiva acquosa di Hoagland (pH di ~ 5,5) per 4 mesi in una camera di crescita mantenuta a 27 ± 3 ° C con un fotoperiodo di 12 ore creato da lampade a LED al flusso fotonico di 250 μmol fotoni ^{s-1 m-2}. Sostituire la soluzione nutritiva Hoagland ogni settimana per 4 mesi.
2. Inoculare quattro foglie espanse di cinque piante sulle loro superfici abassiali con 1 x 10³ H. vastatrix uredospore seguendo il metodo descritto al riferimento²⁸. Dopo l'inoculazione, tenere le piante per 48 ore al buio coprendole con un sacchetto di plastica nero. Raccogli le lesioni 30 giorni dopo l'inoculazione.
3. Lesioni caratteristiche della raccolta causate da Cercospora coffeicola da Coffea arabica cv. Impianti di Obatã situati (coordinate: -22.906506126269942, -47.015075902025266) presso l'Istituto Biologico, Campinas, Stato di San Paolo, Brasile. Prima di elaborare il campione, analizzare le lesioni in uno stereomicroscopio per verificare la presenza di caffè C. coffeicola conidia. Quindi, montare alcuni vetrini con i conidi per confermare l'eziologia della malattia²².

3. Raccolta, fissazione e disidratazione del campione

1. Usando un bisturi e una pinzetta, raccogliere un campione di foglie ~ 10 mm² nella regione centrale della lesione (macchie gialle; Figura 1) e immergerlo in 30 ml di soluzione fissativa di Karnovsky (Figura 1 e Figura 2A). La fase di fissaggio può avvenire in frigorifero per 48 ore.
2. Per almeno quattro volte, sottoporre il campione fogliare a un basso vuoto (500-600 mBar) utilizzando una pompa dell'olio per 15 minuti ciascuna per aumentare la permeabilità della soluzione fissativa nel tessuto fogliare. Eseguire questo passaggio con la rotazione del campione (Figura 1).
3. Dopo la fissazione, lavare il campione di foglie tre volte in un tampone cacodilato da 0,5 M (pH 7,2) diluito in acqua distillata per 5 minuti ciascuno e quindi trasferirlo in una serie etanolica graduata (30%, 50%, 70%, 90% (2x) e 100% (2x)) per 15 minuti a ciascuna concentrazione di etanolo (Figura 1 e Figura 2B).

4. Procedura di incorporamento dell'istoresina

1. Trasferire gradualmente i campioni al glicole metacrilato (GMA) in tre passaggi, seguendo le istruzioni del produttore. Per prima cosa, preparare la Soluzione A mescolando la polvere GMA (1 g) con 100 ml di resina basica (kit istoresina; Tabella dei materiali) sotto agitazione magnetica, quindi seguire i passaggi seguenti.
   1. Immergere i campioni in Soluzione A: 100% etanolo per 3 ore.
   2. Immergere i campioni in Soluzione A: 100% etanolo per 3 ore.
   3. Immergere i campioni in una resina basica pura per 2-4 giorni. Durante questa fase, sottoporre i campioni a un basso vuoto almeno quattro volte al giorno per 15 minuti seguiti dalla rotazione.

5. Polimerizzazione

NOTA: Il processo di polimerizzazione richiede stampi in plastica da 1,2 ml, resina di base e indurente (vedere Tabella dei materiali per i dettagli del kit commerciale).

1. Miscelare 15 mL di soluzione A (fase 4.1) con 1 mL di indurente in un becher con rotazione per 2 minuti per produrre la soluzione di polimerizzazione (soluzione B).
2. Mettere 1,2 ml della soluzione di polimerizzazione (soluzione B) in stampi di plastica. Utilizzando un plettro di legno, trasferire i campioni di foglie lesionate dalla resina basica pura alla soluzione B (Figura 2C). Evitare l'uso di pinzette in quanto possono causare lo schiacciamento dei tessuti.
3. Assicurarsi di orientare rapidamente i campioni di foglie perpendicolari agli stampi in plastica poiché la soluzione B diventa rapidamente viscosa entro 5 minuti. Più di un campione di foglie lesionate può essere collocato in un singolo stampo.
   NOTA: Si consiglia di praticare il passaggio precedente più volte prima di applicare molti campioni. Quando ci sono molti campioni, il tempo di polimerizzazione è diverso tra gli stampi e l'orientamento perpendicolare dei campioni fogliari può essere difficile da raggiungere.
4. Quando si ottiene l'orientamento perpendicolare dei campioni di foglie, attendere 30 minuti, quindi trasferire lo stampo di plastica in una camera di plastica o vetro contenente gel di silice per evitare l'umidità. Attendere 2-3 ore per la polimerizzazione.
5. Una volta che la resina e il campione di foglie sono polimerizzati dopo il periodo di 2-3 ore, staccare il blocco risultante dallo stampo di plastica levigando la base del blocco con una lima di levigatura. Quindi, incollare il blocco su un pezzo di legno (Figura 2D).

6. Sezionamento

1. Utilizzando un microtomo rotativo dotato di lame in acciaio da 8 cm (Figura 2E), tagliare il blocco in sezioni spesse 5 μm. Posizionare le sezioni su vetrini ricoperti di acqua distillata. Trasferire i vetrini con le sezioni galleggianti sull'acqua su una piastra calda a 40 °C per asciugare e favorire l'adesione delle sezioni alle guide di vetro.
2. Dopo l'essiccazione (Figura 2F), etichettare i vetrini con il nome di riferimento del blocco e il numero della diapositiva.

7. Doppio processo di colorazione

1. Coprire le sezioni con 2 mL di blu cotone al 5% in lattofenolo (40% glicerolo, 20% fenolo e 20% acido lattico in acqua) e riscaldarle su una piastra calda a 45 °C per 5 minuti (Figura 3A).
2. Rimuovere il colorante in eccesso lavando il vetrino tre volte in un becher riempito con acqua distillata (Figura 3B-D).
3. Macchiare con 2 mL di rosso rutenio allo 0,01% in acqua per 1 minuto (Figura 3E).
4. Rimuovere il colorante in eccesso lavando il vetrino tre volte in un becher riempito con acqua distillata (Figura 3F,G).
5. Mettere una goccia di acqua distillata sopra le sezioni e coprire le sezioni con un coverslip di 24 mm x 60 mm per eseguire l'analisi al microscopio ottico.

Risultati

La colorazione di lattofenolo blu cotone sulla sezione incorporata in GMA ha rivelato la presenza di diverse strutture fungine tra e all'interno delle cellule mesofille del caffè in entrambe le interazioni fungine biotrofiche e necrotrofiche.

Nel patosistema biotrofico, quando colorato con il metodo della doppia colorazione, Hemileia vastatrix hyphae contenente pareti cellulari e il denso contenuto di protoplasti appaiono in blu scuro sia nel parenchima spugnoso che in quello palizza...

Discussione

Il presente lavoro introduce un test istochimico alternativo a doppia colorazione per studiare la composizione della pectina delle pareti cellulari che incapsula haustoria in un patosistema biotrofico. L'obiettivo è anche quello di dimostrare l'efficacia del metodo per rilevare i funghi necrotrofici e i cambiamenti della parete cellulare da esso indotti. Qui, la pectina delle pareti cellulari del parenchima del caffè può incapsulare sia il collo che l'haustorium del fungo ruggine Hemileia vastatrix. Silva et ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blades DB80 HS	Leica	14035838383	Sectioning
Cacodylate buffer	EMS	# 11652	Fixation
Cotton Blue Lactophenol	Metaquímica	70SOLSIG024629	Staining
Formaldehyde	EMS	#15712	Fixation
Glutaraldehyde	EMS	#16216	Fixation
Historesin Kit	Technovit /EMS	#14653	Historesin for embedding
Hot plate	Dubesser	SSCD25X30-110V	Staining
Microscopy	Zeiss	#490040-0030-000	Image capture
Microtome (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Sectioning
Plastic molding cup tray	EMS	10176-30	Staining
Ruthenium red	LABHouse	#006004	Staining
Software Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Image capture
Vaccum pump	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	Fixation