АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает микроскопический метод обнаружения пектина во взаимодействии кофе-гриба.

Аннотация

Растительные клетки используют различные структурные механизмы, конститутивные или индуцируемые, чтобы защитить себя от грибковой инфекции. Инкапсуляция является эффективным индуцируемым механизмом для выделения грибковой хаустории из протопласта растительных клеток. И наоборот, пектин, один из полимерных компонентов клеточной стенки, является мишенью нескольких пектолитических ферментов в некротрофных взаимодействиях. Здесь представлен протокол обнаружения пектина и грибковых гиф с помощью оптической микроскопии. Исследована богатая пектином инкапсуляция в клетках кофейных листьев, зараженных ржавчинным грибом Hemileia vastatrix , и модификация клеточной стенки мезофилла, индуцированная Cercospora coffeicola . Поврежденные образцы листьев фиксировали раствором Карновского, обезвоживали и внедряли в метакрилат гликоля в течение 2-4 дней. Все этапы сопровождались вакуумной накачкой для удаления воздуха в межклеточных пространствах и улучшения процесса встраивания. Встроенные блоки были разделены на участки толщиной 5-7 мкм, которые осаждались на стеклянной горке, покрытой водой, и впоследствии нагревались при 40 °C в течение 30 мин. Затем слайды были дважды окрашены 5% хлопкового синего цвета в лактофеноле для обнаружения грибка и 0,05% рутения красного в воде для обнаружения пектина (кислотные группы полиуроновых кислот пектина). Было обнаружено, что грибы Hemileia vastatrix инкапсулированы пектином. При кофейном церкоспориозе клетки мезофилла проявляли растворение клеточных стенок, наблюдались межклеточные гифы и конидиофоры. Метод, представленный здесь, эффективен для обнаружения пектин-ассоциированного ответа во взаимодействии растений и грибов.

Введение

Защитные механизмы клеточной стенки в растениях имеют решающее значение для сдерживания грибковой инфекции. Исследования сообщали об изменениях в толщине и составе клеточной стенки с19-го века 1,2. Эти изменения могут быть вызваны грибковым патогеном, который стимулирует образование сосочки, который предотвращает попадание грибов в клетку, или может быть использован для инкапсуляции гиф, чтобы изолировать протопласт клетки-хозяина от грибковой хаустории. Производство динамического барьера клеточной стенки (т.е. сосочков и полностью заключенного хаусториума) важно для повышения устойчивости растений3. Гистопатологические исследования грибковых заболеваний исследовали возникновение этих механизмов и описали полимеры клеточной стенки, целлюлозу, гемицеллюлозу (арабиноксиланы) и мозолу как механизмы устойчивости к грибковой атаке 4,5,6,7.

Клеточная стенка является первым барьером против атаки микроорганизмов, ухудшая растительно-грибковое взаимодействие. Пектические полисахариды составляют клеточную стенку и составляют около 30% состава клеточной стенки в первичных клетках растений эвдикот, в которых гомогалактуроны являются наиболее распространенным полимером (примерно 60%)8. Гольджи секретирует сложные пектиновые соединения, которые содержат цепи галактуроновой кислоты, которые могут или не могут быть метилированы 8,9. С 2012 года в литературе отмечается, что степень метилэтерификации пектина имеет решающее значение для определения совместимости при заражении микробными пектическими ферментами 10,11,12. Таким образом, необходимы протоколы для проверки наличия и распределения пектиновых соединений в растительно-грибковых патосистемах.

Различные методы были использованы для обнаружения инкапсуляции сосочков или хаусторий. В качестве эталонных методов используются просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ) неподвижной ткани и световая микроскопия живых и неподвижных тканей. Что касается ТЕА, несколько исследований продемонстрировали структурную роль аппозиций клеточных стенок в грибковой резистентности 13,14,15,16, и что использование лектинов и антител является сложным методом обнаружения углеводных полимеров 16. Тем не менее, исследования показывают, что световая микроскопия является важным подходом и что гистохимические и иммуногистохимические инструменты позволяют лучше понять состав сосочков и хаусторий 6,7.

Патогенные грибы проявляют два основных типа образа жизни: биотрофный и некротрофный. Биотрофные грибы зависят от живых клеток для их питания, тогда как некротрофные грибы убивают клетки-хозяева, а затем живут в мертвых тканях17. В Латинской Америке ржавчина кофейных листьев, вызванная грибком Hemileia vastatrix, является важным заболеванием в кофейных культурах 18,19. Hemileia vastatrix представляет собой биотрофное поведение, и среди структурных изменений, наблюдаемых у устойчивых видов или сортов кофе, сообщалось о реакции гиперчувствительности, отложении каллозы, целлюлозы и лигнина на клеточных стенках, а также о гипертрофии клеток14. Насколько известно авторам, в литературе не сообщается информация о важности пектина в устойчивости кофе к ржавчине. С другой стороны, некротрофные грибы, которые вызывают церкоспориоз, нацелены на пектин через набор ферментов, связанных с деградацией клеточной стенки, таких как пектиназы и полигалактуроназа20. Церкоспориоз в кофе, вызванный грибком Cercospora coffeicola, также представляет серьезную угрозу для кофейных культур21,22. Этот гриб вызывает некротические поражения как в листьях, так и в ягодах. После проникновения C. coffeicola колонизирует растительные ткани по внутриклеточным и межклеточным путям 23,24,25.

Настоящий протокол исследует наличие грибковых структур и пектина на клеточных стенках. Этот протокол полезен для выявления реакции растений, связанной с пектином (окрашенным рутением красным красителем, который специфичен для кислотных групп полиуроновых кислот пектина), индуцированным хозяином при биотрофическом взаимодействии с грибом. Это также помогает проверить влияние некротрофных грибов на деградацию пектических клеточных стенок. Представленные результаты показывают, что метод двойного окрашивания эффективен для различения структур и репродуктивной фазы грибов.

протокол

1. Приготовление буферного раствора и реагентов

  1. Приготовьте 2 М какодилатного буфера, добавив 4,28 г какодилата натрия к 100 мл дистиллированной воды и отрегулируйте рН до 7,25 с 0,2 N HCl.
  2. Готовят 100 мл карновского фиксаторного раствора путем смешивания 10 мл 25% водного глутарового альдегида, 10 мл 10% водного формальдегида, 25 мл 2 М какодилатного буфера и 0,5 мл 0,5 мл 0,5 М CaCl226. Восполнить объем до 100 мл дистиллированной водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор можно хранить в холодильнике в течение 6 месяцев.
    ВНИМАНИЕ: Буферный раствор какодилата токсичен; поэтому обрабатывайте фиксирующий раствор в вытяжке или на открытой площадке. Избегайте вдыхания паров раствора и носите перчатки во время обработки.
  3. Готовят водный питательный раствор Hoagland, смешивая следующее: 3 мМ Ca(NO3)2,4H 2O, 2 мМ NH4H2PO4, 5 мМ KH2PO4, 2 мМ MgSO4,7H 2O, 9,07 мМ MnSO4, 0,765 мМ ZnSO4,7H 2O, 46,4 мМ H3BO3, 0,09 мМ На2МоО 4. H2O, 0,01 мМ CuSO4 и 36 мМ FeSO 4,7H2O в виде железа-ЭДТА (этилендиамин тетрауксусной кислоты)27.

2. Образцы растений и посев грибка

ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов на листьях, пораженных кофейной ржавчиной, пять 2-месячных саженцев Coffee arabica cv. Катуаи выращивали и хранили в теплице в Центре ядерной энергии в сельском хозяйстве (CENA) Университета Сан-Паулу, Пирасикаба, штат Сан-Паулу, Бразилия.

  1. Выращивайте кофейные растения в пластиковых горшках объемом 500 мл, наполненных водным питательным раствором Hoagland (рН ~ 5,5), в течение 4 месяцев в камере роста, поддерживаемой при 27 ± 3 °C с 12-часовым фотопериодом, созданным светодиодными лампами при фотонном потоке фотонов 250 мкмоль s-1 м-2. Заменяйте питательный раствор Hoagland каждую неделю в течение 4 месяцев.
  2. Инокулируют четыре расширенных листа пяти растений на их абаксиальных поверхностях 1 х 103 H. vastatrix uredospores по способу, описанному в ссылке28. После прививки держите растения в течение 48 ч в темноте, накрыв их черным полиэтиленовым пакетом. Собирают урожай поражений через 30 дней после прививки.
  3. Урожай характерных поражений, вызванных Cercospora coffeicola от Coffea arabica cv. Заводы Obatã расположены (координаты: -22.906506126269942, -47.015075902025266) в Биологическом институте, Кампинас, штат Сан-Паулу, Бразилия. Перед обработкой образца проанализируйте повреждения в стереомикроскопе, чтобы убедиться в наличии кофе C. coffeicola conidia. Затем установите несколько слайдов с конидиями, чтобы подтвердить этиологию заболевания22.

3. Сбор проб, фиксация и обезвоживание

  1. Используя скальпель и пинцет, соберите ~10 мм2 образца листа в средней области поражения (желтые пятна; Рисунок 1) и погрузить его в 30 мл фиксаторного раствора Карновского (фиг.1 и фиг.2А). Этап фиксации может проходить в холодильнике в течение 48 ч.
  2. По меньшей мере четыре раза подвергайте образец листа низкому вакууму (500-600 мБар) с помощью масляного насоса в течение 15 мин каждый для повышения проницаемости фиксирующего раствора в ткани листа. Выполните этот шаг с поворотом образца (рисунок 1).
  3. После фиксации промыть образец листа три раза в 0,5 М какодилатного буфера (рН 7,2), разбавленном в дистиллированной воде в течение 5 мин каждый, а затем перенести его в градуированный этанольный ряд (30%, 50%, 70%, 90% (2x) и 100% (2x)) в течение 15 мин при каждой концентрации этанола (Фиг.1 и Фиг.2В).

4. Процедура встраивания гисторезина

  1. Постепенно переводите образцы на метакрилат гликоля (ГМА) в три этапа, следуя инструкциям производителя. Во-первых, делают раствор А, смешивая порошок ГМА (1 г) со 100 мл основной смолы (набор гисторезина; Таблица материалов) при магнитном перемешивании, а затем выполните следующие действия.
    1. Погружайте образцы в 1:2 Раствор А: 100% этанол в течение 3 ч.
    2. Погружайте образцы в 1:1 Раствор А: 100% этанол в течение 3 ч.
    3. Погрузите образцы в чистую основную смолу на 2-4 дня. На этом этапе подвергайте образцы низкому вакууму, по крайней мере, четыре раза в день в течение 15 минут с последующим вращением.

5. Полимеризация

ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс полимеризации требует 1,2 мл пластиковых форм, основной смолы и отвердителя (см. Таблицу материалов для деталей коммерческого комплекта).

  1. Смешайте 15 мл раствора А (стадия 4.1) с 1 мл отвердителя в стакане с вращением в течение 2 мин для получения раствора полимеризации (раствор В).
  2. Поместите 1,2 мл полимеризационного раствора (растворА В) в пластиковые формы. Используя деревянную кирку, перенесите поврежденные образцы листьев из чистой основной смолы в раствор B (рисунок 2C). Избегайте использования пинцета, так как он может вызвать раздавливание тканей.
  3. Обеспечьте быструю ориентацию образцов листьев перпендикулярно пластиковым формам, так как раствор В быстро становится вязким в течение 5 минут. Более одного поврежденного образца листа могут быть помещены в одну форму.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется практиковать вышеуказанный шаг несколько раз, прежде чем подавать заявку на многие образцы. Когда образцов много, время полимеризации отличается среди форм, и перпендикулярная ориентация образцов листьев может быть труднодостижимой.
  4. Когда перпендикулярная ориентация образцов листьев достигнута, подождите 30 минут, а затем перенесите пластиковую форму в пластиковую или стеклянную камеру, содержащую силикагель для предотвращения влажности. Подождите 2-3 ч для полимеризации.
  5. После того, как смола и образец листа полимеризуются после 2-3-часового периода, отделите полученный блок от пластиковой формы, отшлифовав основание блока шлифовальным файлом. Затем приклейте блок к куску дерева (рисунок 2D).

6. Секционирование

  1. Используя вращающийся микротом, оснащенный стальными лезвиями 8 см (рисунок 2E), разрежьте блок на участки толщиной 5 мкм. Поместите секции на стеклянные горки, покрытые дистиллированной водой. Перенесите горки с секциями, плавающими над водой, на конфорку при 40 °C для сушки и улучшения адгезии секций к стеклянным горкам.
  2. После высыхания (рисунок 2F) пометьте стеклянные слайды ссылочным именем блока и номером слайда.

7. Процесс двойного окрашивания

  1. Покрыть участки 2 мл 5% хлопкового синего цвета лактофенолом (40% глицерина, 20% фенола и 20% молочной кислоты в воде) и нагревать их на конфорке при 45 °C в течение 5 мин (рисунок 3A).
  2. Удалите избыток красителя, промыв горку три раза в стакане, наполненном дистиллированной водой (рисунок 3B-D).
  3. Окрашивание с 2 мл 0,01% рутения красного цвета в воде в течение 1 мин (Рисунок 3Е).
  4. Удалите избыток красителя, промыв горку три раза в стакане, наполненном дистиллированной водой (рисунок 3F, G).
  5. Нанесите каплю дистиллированной воды на секции и накройте секции крышкой размером 24 мм x 60 мм для проведения анализа световой микроскопии.

Результаты

Окрашивание лактофенола хлопкового синего цвета на секции, встроенной в GMA, выявило наличие нескольких грибковых структур между клетками кофейного мезофилла и внутри них как в биотрофных, так и в некротрофных грибковых взаимодействиях.

В биотрофической патосистеме при ...

Обсуждение

Настоящая работа вводит альтернативный гистохимический тест двойного окрашивания для исследования пектинового состава клеточных стенок, который инкапсулирует гаусторию в биотрофическую патосистему. Целью также является демонстрация эффективности метода обнаружения некротрофног?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Хадсона В.. де Карвалью за поддержку в разработке этой работы. Авторы также благодарны Лаборатории электронной микроскопии «Профессор Эллиот Ватанабэ Китадзима» за предоставление оборудования для световой микроскопии. Авторы благодарят доктора Флавию Родригеса Алвеса Патрисио за то, что он снабдил растительный материал повреждениями.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Blades DB80 HSLeica14035838383Sectioning
Cacodylate bufferEMS# 11652Fixation
Cotton Blue LactophenolMetaquímica70SOLSIG024629Staining
FormaldehydeEMS#15712Fixation
GlutaraldehydeEMS#16216Fixation
Historesin KitTechnovit /EMS#14653Historesin for embedding
Hot plateDubesserSSCD25X30-110VStaining
MicroscopyZeiss#490040-0030-000Image capture
Microtome (Leica RM 2540)Leica149BIO000C1 14050238005Sectioning
Plastic molding cup trayEMS10176-30Staining
Ruthenium redLABHouse#006004Staining
Software Axion VisionZeiss#410130-0909-000Image capture
Vaccum pumpPrismatec131 TIPO 2 V.C.Fixation

Ссылки

  1. deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).
  2. Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
  3. Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).
  4. Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
  5. Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).
  6. Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).
  7. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).
  8. Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
  9. Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , 45 (2015).
  10. Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).
  11. Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).
  12. Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).
  13. Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
  14. Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).
  15. An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).
  16. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).
  17. Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).
  18. Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
  19. Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
  20. Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555 (2020).
  21. Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).
  22. Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , 810 (2016).
  23. Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
  24. Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).
  25. Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).
  26. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  27. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , 347 (1950).
  28. Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, 171 (1989).
  29. Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).
  30. Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).
  31. Hayat, M. A. . Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , 564 (1981).
  32. Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T., Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. 689, 37-49 (2011).
  33. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).
  34. Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
  35. Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).
  36. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Piracicaba, F. E. A. L. Q. . Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. , 140 (2021).
  37. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
  38. Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).
  39. Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , 68 (1997).
  40. Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12 (30), 24 (1999).
  41. Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).
  42. Chamberlain, C. J. . Methods in Plant Histology. , 349 (1932).
  43. Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
  44. Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).
  45. Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A., Kerbauy, G. B. Cell Wall. Plant Physiology. , 165-181 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены