Método de coloração dupla para detectar pectina na interação planta-fungo

Resumo

Este protocolo descreve um método microscopical para detectar pectina na interação café-fungo.

Resumo

As células vegetais utilizam diferentes mecanismos estruturais, constitutivos ou induíveis, para se defenderem da infecção fúngica. Encapsulamento é um mecanismo indutível eficiente para isolar a haustoria fúngica do protoplasto celular vegetal. Por outro lado, a pectina, um dos componentes poliméricos da parede celular, é alvo de várias enzimas pecotólicas em interações necrotróficas. Aqui, é apresentado um protocolo para detectar pectina e hifas fúngicas através de microscopia óptica. O encapsulamento rico em pectina nas células das folhas de café infectadas pelo fungo ferrugem Hemileia vastatrix e a modificação da parede celular mesófila induzida pelo Cercospora coffeicola são investigados . As amostras de folhas lesionadas foram fixadas com a solução Karnovsky, desidratadas e embutidas em metacrilato glicol por 2-4 dias. Todas as etapas foram seguidas pelo bombeamento a vácuo para remover o ar nos espaços intercelulares e melhorar o processo de incorporação. Os blocos incorporados foram seccionados em seções de 5-7 μm de espessura, que foram depositados em um toboágua de vidro coberto com água e, posteriormente, aquecidos a 40 °C por 30 minutos. Em seguida, os slides foram duplamente manchados com 5% de algodão azul em lactofenol para detectar o fungo e 0,05% vermelho rutênio na água para detectar pectina (grupos ácidos de ácidos poliurônicos de pectina). Haustoria fúngica de Hemileia vastatrix foram encontrados encapsulados por pectina. Na cercosporiose do café, foram observadas células de mesofílico exibindo dissolução de paredes celulares, e hifas intercelulares e conidioforos. O método aqui apresentado é eficaz para detectar uma resposta associada à pectina na interação planta-fungo.

Introdução

Mecanismos de defesa de parede celular nas plantas são cruciais para conter a infecção fúngica. Estudos têm relatado mudanças na espessura e composição da parede celular desde o século^{XIX 1,2}. Essas alterações podem ser induzidas por um patógeno fúngico que estimula a formação de uma papila, que impede que fungos entrem na célula ou possam ser usados para encapsular a hifa para isolar o protoplasto celular hospedeiro da haustoria fúngica. A produção de uma barreira dinâmica de parede celular (ou seja, papila e um haustorium totalmente envolto) é importante para promover a resistência à planta³. Estudos histopatológicos sobre doenças relacionadas ao fungo têm investigado a ocorrência desses mecanismos e descreveram os polímeros de parede celular, celulose, hemicellulose (arabinoxilans), e callose como mecanismos de resistência ao ataque fúngico 4,5,6,7.

A parede celular é a primeira barreira contra o ataque microorganismal, prejudicando a interação planta-fúngica. Polissacarídeos pecéticos compõem a parede celular e respondem por cerca de 30% da composição da parede celular em células primárias de plantas eudicot, nas quais os homogalacturonans são o polímero mais abundante (cerca de 60%)⁸. Os Golgi secretam compostos complexos de pectina que compõem as cadeias de ácido galacturônico, que podem ou não ser metilados ^8,9. Desde 2012, a literatura aponta que o grau de esterificação de metila pectina é fundamental para determinar a compatibilidade durante a infecção por enzimas pecíticas microbianas 10,11,12. Assim, são necessários protocolos para verificar a presença e distribuição de compostos pecticos em sistemas de pathos vegetais-fúngicos.

Várias técnicas têm sido usadas para detectar o encapsulamento de papilas ou haustoria. Os métodos de referência utilizados são a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de tecido fixo e microscopia leve de tecidos vivos e fixos. Em relação ao TEM, diversos estudos têm demonstrado o papel estrutural das apposições de parede celular na resistência fúngica 13,14,15,16, e que o uso de lectinas e anticorpos é um método intrincado para localizar polímeros de carboidratos 16. No entanto, estudos mostram que a microscopia leve é uma abordagem importante e que as ferramentas histoquímicas e imunohistoquímicas permitem uma melhor compreensão da composição da papila e do haustorium^{encasement 6,7}.

Os fungos patogênicos apresentam dois tipos principais de estilos de vida: biotrófico e necrotrófico. Fungos biotróficos dependem de células vivas para sua nutrição, enquanto fungos necrotróficos matam as células hospedeiras, e depois vivem nos tecidos mortos¹⁷. Na América Latina, a ferrugem da folha de café, causada pelo fungo Hemileia vastatrix, é uma doença importante nas culturas de café^18,19. A hemileia vastatrix apresenta um comportamento biotrófico e, entre as alterações estruturais observadas em espécies ou cultivares de café resistentes, foi relatada uma resposta de hipersensibilidade, deposição de calose, celulose e lignina nas paredes celulares, bem como hipertrofia^{celular 14}. Para o conhecimento dos autores, a literatura não informa informações sobre a importância da pectina na resistência à ferrugem do café. Por outro lado, fungos necrotróficos que causam a cercosporiose visam a pectina através de um conjunto de enzimas associadas à degradação da parede celular, como pectinases e poligalacturonase²⁰. A cercosporiose no café, causada pelo fungo Cercospora coffeicola, também é uma grande ameaça às culturas de café^21,22. Este fungo causa lesões necróticas em folhas e frutos. Após a penetração, C. coffeicola coloniza tecidos vegetais através de vias intracelulares e intercelulares 23,24,25.

O presente protocolo investiga a presença de estruturas fúngicas e pectina nas paredes celulares. Este protocolo é útil para identificar a resposta vegetal associada à pectina (manchada com corante vermelho rutênio, que é específica para grupos ácidos de ácidos poliurônicos de pectina), induzida pelo hospedeiro em uma interação biotrófica com fungo. Também ajuda a verificar o efeito de fungos necrotróficos na degradação das paredes das células pecíticas. Os resultados atuais indicam que o método de dupla coloração é eficaz para discriminar estruturas e a fase reprodutiva dos fungos.

Protocolo

1. Preparação da solução de tamponamento e reagentes

1. Prepare 2 M tampão de cacodilato adicionando 4,28 g de cacodilato de sódio a 100 mL de água destilada e ajuste o pH para 7,25 com 0,2 N HCl.
2. Prepare 100 mL da solução fixada Karnovsky misturando 10 mL de glutaraldeído aquoso de 25%, 10 mL de formaldeído aquoso de 10%, 25 mL de tampão de cacodilato de 2 M e 0,5 mL de 0,5 M CaCl₂²⁶. Coma o volume até 100 mL com água destilada.
   NOTA: A solução pode ser mantida em uma geladeira por 6 meses.
   ATENÇÃO: A solução de tamponamento de cacodilato é tóxica; portanto, manuseie a solução fixativa em um capô de fumaça ou em uma área aberta. Evite inalar os vapores da solução e use luvas durante o manuseio.
3. Prepare a solução de nutrientes hoagland aquosa misturando o seguinte: 3 mM Ca(NO₃)_{2.4H 2}O, 2 mM NH₄H₂PO₄, 5 mM KH₂PO₄, 2 mM MgSO 4.7H₂O, 9,07 mM MNSO₄, 0,765 mM ZnSO_{4.7H 2}O, 46,4 mM H₃BO₃, 0,09 mM Na₂MoO₄. H₂O, 0,01 mM CuSO₄, e 36 mM FeSO_{4.7H 2}O como ferro-EDTA (ácido tetraacético de etilenodiamina)²⁷.

2. Amostras de plantas e inoculação de fungos

NOTA: Para experimentos em folhas afetadas pela ferrugem do café, cinco mudas de café arábica de 2 meses de idade. Catuaí foi cultivada e mantida em uma estufa no Centro de Energia Nuclear da Agricultura (CENA) da Universidade de São Paulo, Piracicaba, Estado de São Paulo, Brasil.

1. Cultivar plantas de café em potes de plástico de 500 mL recheados com solução aquosa de nutrientes Hoagland (pH de ~5,5) por 4 meses em uma câmara de crescimento mantida a 27 ± 3 °C com um fotoperíodo de 12 h criado por lâmpadas LED no fluxo de fótons de 250 μmol fótons ^{s-1 m-2}. Substitua a solução de nutrientes Hoagland toda semana por 4 meses.
2. Inocular quatro folhas expandidas de cinco plantas em suas superfícies abaxial com 1 x 10³ H. vastatrix uredospores seguindo o método descrito na referência²⁸. Após a inoculação, mantenha as plantas por 48 h no escuro, cobrindo-as com um saco plástico preto. Colher as lesões 30 dias após a inoculação.
3. Lesões características da colheita causadas pelo Cercospora coffeicola da Coffea arabica cv. Plantas obatã localizadas (coordenadas: -22.9065061269942, -47.015075902025266) no Instituto Biológico, Campinas, Estado de São Paulo, Brasil. Antes de processar a amostra, analise as lesões em um estereómico para verificar a presença do café C. coffeicola conidia. Em seguida, monte alguns slides com a conidia para confirmar a etiologia da doença²².

3. Colheita de amostras, fixação e desidratação

1. Utilizando um bisturi e uma pinça, colhe uma amostra de ~10 mm² folhas na região média da lesão (manchas amarelas; Figura 1) e imergi-lo em 30 mL de solução fixativa Karnovsky (Figura 1 e Figura 2A). A etapa de fixação pode ocorrer em uma geladeira por 48 horas.
2. Por pelo menos quatro vezes, submia a amostra da folha a um vácuo baixo (500-600 mBar) usando uma bomba de óleo por 15 minutos cada para aumentar a permeabilidade da solução fixativa no tecido da folha. Execute esta etapa com rotação amostral (Figura 1).
3. Após a fixação, lave a amostra da folha três vezes em tampão de cacodilato de 0,5 M (pH 7,2) diluído em água destilada por 5 min cada e depois transfira para uma série etanolilicada (30%, 50%, 70%, 90% (2x) e 100% (2x)) para 15 min a cada concentração de etanol (Figura 1 e 2B).

4. Procedimento de incorporação de historesin

1. Transfira gradualmente as amostras para o methacrilato glicol (GMA) em três etapas, seguindo as instruções do fabricante. Primeiro, faça a Solução A misturando o pó GMA (1 g) com 100 mL de resina básica (kit de historesina; Tabela de Materiais) sob agitação magnética, e, em seguida, seguir os passos abaixo.
   1. Mergulhe as amostras em 1:2 Solução A: 100% etanol por 3 h.
   2. Mergulhe as amostras em 1:1 Solução A: 100% etanol por 3 h.
   3. Mergulhe as amostras em uma resina básica pura por 2-4 dias. Durante esta etapa, sujeitar as amostras a um vácuo baixo pelo menos quatro vezes por dia durante 15 minutos seguido de rotação.

5. Polimerização

NOTA: O processo de polimerização requer moldes plásticos de 1,2 mL, resina básica e endurecedor (ver Tabela de Materiais para os detalhes do kit comercial).

1. Misture 15 mL de Solução A (etapa 4.1) com 1 mL do endurecedor em um béquer com rotação por 2 minutos para produzir a solução de polimerização (Solução B).
2. Coloque 1,2 mL da solução de polimerização (Solução B) em moldes plásticos. Utilizando uma picareta de madeira, transfira as amostras de folhas lesionadas de resina básica pura para a solução B (Figura 2C). Evite usar pinças, pois elas podem causar esmagamento de tecidos.
3. Certifique-se de orientar rapidamente amostras de folhas perpendiculares aos moldes plásticos à medida que a solução B rapidamente se torna viscosa dentro de 5 minutos. Mais de uma amostra de folha lesionada pode ser colocada em um único molde.
   NOTA: Recomenda-se praticar o passo acima várias vezes antes de aplicar muitas amostras. Quando há muitas amostras, o tempo de polimerização é diferente entre os moldes e a orientação perpendicular das amostras de folhas pode ser difícil de alcançar.
4. Quando a orientação perpendicular das amostras da folha for alcançada, espere por 30 minutos e, em seguida, transfira o molde plástico para uma câmara de plástico ou vidro contendo gel de sílica para evitar a umidade. Aguarde 2-3 h para polimerização.
5. Uma vez que a resina e a amostra da folha sejam polimerizadas após o período de 2-3 h, retire o bloco resultante do molde de plástico lixando a base do bloco com um arquivo de lixamento. Em seguida, cole o bloco a um pedaço de madeira (Figura 2D).

6. Secção

1. Utilizando um microtómeo rotativo equipado com lâminas de aço de 8 cm (Figura 2E), corte o bloco em seções de 5 μm de espessura. Coloque as seções em lâminas de vidro cobertas com água destilada. Transfira os slides com as seções flutuando sobre a água para uma placa quente a 40 °C para secar e promover a adesão das seções aos slides de vidro.
2. Após a secagem (Figura 2F), rotule os slides de vidro com o nome de referência do bloco e o número do slide.

7. Processo de coloração dupla

1. Cubra as seções com 2 mL de 5% de algodão azul em lactofenol (40% glicerol, 20% fenol e 20% ácido láctico na água) e aqueça-as em uma placa quente a 45 °C por 5 min (Figura 3A).
2. Remova o excesso de corante lavando o slide três vezes em um béquer cheio de água destilada (Figura 3B-D).
3. Mancha com 2 mL de 0,01% vermelho rutênio em água por 1 min (Figura 3E).
4. Remova o excesso de corante lavando o slide três vezes em um béquer cheio de água destilada (Figura 3F,G).
5. Coloque uma gota de água destilada sobre as seções e cubra as seções com um deslizamento de cobertura de 24 mm x 60 mm para realizar a análise de microscopia leve.

Resultados

A coloração de lactofenol azul de algodão na seção incorporada pela GMA revelou a presença de várias estruturas fúngicas entre e dentro de células de mesófilo de café em interações fúnequias biotróficas e nefróficas.

No pathosystem biotrófico, quando manchado usando o método de coloração dupla, hemileia vastatrix hiphae contendo paredes celulares e o denso teor de protoplasto aparecem em azul escuro em parenchyma esponjoso e palisade (Figura 4A...

Discussão

O presente trabalho introduz um teste histoquímico alternativo de dupla coloração para investigar a composição da pectina das paredes celulares que encapsula a haustoria em um pathosystem biotrófico. O objetivo também é demonstrar a eficácia do método para detectar fungos necrotróficos e alterações na parede celular induzidas por ele. Aqui, a pectina das paredes celulares do café parenchyma pode encapsular tanto o pescoço quanto o haustorium do fungo ferrugem Hemileia vastatrix. Silva et al. tamb?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blades DB80 HS	Leica	14035838383	Sectioning
Cacodylate buffer	EMS	# 11652	Fixation
Cotton Blue Lactophenol	Metaquímica	70SOLSIG024629	Staining
Formaldehyde	EMS	#15712	Fixation
Glutaraldehyde	EMS	#16216	Fixation
Historesin Kit	Technovit /EMS	#14653	Historesin for embedding
Hot plate	Dubesser	SSCD25X30-110V	Staining
Microscopy	Zeiss	#490040-0030-000	Image capture
Microtome (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Sectioning
Plastic molding cup tray	EMS	10176-30	Staining
Ruthenium red	LABHouse	#006004	Staining
Software Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Image capture
Vaccum pump	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	Fixation