שיטת צביעה כפולה לזיהוי פקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה מיקרוסקופית לזיהוי פקטין באינטראקציה בין פטריית קפה.

Abstract

תאי הצמח משתמשים במנגנונים מבניים שונים, מכוננים או בלתי ניתנים להשראה, כדי להגן על עצמם מפני זיהום פטרייתי. אנקפסולציה היא מנגנון אינדוקטיבי יעיל לבודד את האוסטוריה הפטרייתית מהפרוטופלסט של תאי הצמח. לעומת זאת, פקטין, אחד המרכיבים הפולימריים של דופן התא, הוא מטרה של מספר אנזימים פקטוליטיים באינטראקציות נקרוטרופיות. כאן מוצג פרוטוקול לאיתור פקטין ופטריות באמצעות מיקרוסקופיה אופטית. נחקרים האנקפסולציה העשירה בפקטין בתאי עלי הקפה הנגועים בפטריית החלודה Hemileia vastatrix ובשינוי דופן תא המזופיל המושרה על ידי Cercospora coffeicola . דגימות העלים הנגעים תוקנו בתמיסת קרנובסקי, התייבשו והוטמעו בגליקון מתקרילט למשך 2-4 ימים. כל השלבים בוצעו על ידי שאיבת ואקום כדי להסיר אוויר בחללים הבין-תאיים ולשפר את תהליך ההטבעה. הבלוקים המשובצים חולקו למקטעים בעובי 5-7 מיקרומטר, שהופקדו על מגלשת זכוכית מכוסה במים ולאחר מכן חוממו בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, המגלשות הוכתמו פעמיים עם 5% כותנה כחולה בלקטופנול כדי לזהות את הפטרייה ו-0.05% רותניום אדום במים כדי לזהות פקטין (קבוצות חומציות של חומצות פוליאוריות של פקטין). האוסטוריה פטרייתית של Hemileia vastatrix נמצאה עטופה בפקטין. בקפה סרקוספוריוזיס, תאי מזופיל הפגינו התמוססות של דפנות התא, ונצפו הרפיות וקונידיופורים בין-תאיים. השיטה המוצגת כאן יעילה לזיהוי תגובה הקשורה לפקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות.

Introduction

מנגנוני ההגנה על דופן התא בצמחים חיוניים לריסון זיהום פטרייתי. מחקרים דיווחו על שינויים בעובי ובהרכב דופן התא מאז המאה^{ה-19, 1,2}. שינויים אלה יכולים להיות מושרים על ידי פתוגן פטרייתי המעורר את היווצרותה של פפילה, אשר מונעת מפטריות להיכנס לתא או יכול לשמש כדי לתמצת את hyphae כדי לבודד את התא המארח protoplast מן haustoria פטרייתי. ייצור מחסום דופן תא דינמי (כלומר, פפילה והאוסטוריום עטוף במלואו) חשוב כדי לקדם את עמידות הצמח³. מחקרים היסטופתולוגיים על מחלות הקשורות לפטריות חקרו את התרחשותם של מנגנונים אלה ותיארו את הפולימרים של דופן התא, תאית, המיצלולוז (ארבינוקסילנים) ויבלות כמנגנוני התנגדות להתקפה פטרייתית 4,5,6,7.

דופן התא היא המחסום הראשון מפני התקפה מיקרואורגניזמית, הפוגעת באינטראקציה בין צמחים לפטריות. פוליסכרידים פקטיים מרכיבים את דופן התא ומהווים כ-30% מהרכב דופן התא בתאים ראשוניים של צמחי אאודיקוט שבהם הומוגלקטורונאנים הם הפולימר הנפוץ ביותר (בערך 60%)⁸. הגולגי מפריש תרכובות פקטין מורכבות המרכיבות את שרשראות החומצה הגלקטורונית, אשר עשויות או לא יכולות להיות מתילציה ^8,9. מאז 2012, הספרות הצביעה על כך שמידת הפקטין מתיל אסטריפיקציה היא קריטית לקביעת התאימות במהלך ההדבקה על ידי אנזימים פקטיים מיקרוביאליים 10,11,12. לפיכך, פרוטוקולים נדרשים כדי לאמת את נוכחותם והפצתם של תרכובות פקטיות במערכות פאתוסיסטמיות פטרייתיות צמחיות.

טכניקות שונות שימשו כדי לזהות את האנקפסולציה של papillae או haustoria. שיטות הייחוס בהן נעשה שימוש הן מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) של רקמות קבועות ומיקרוסקופיה קלה של רקמות חיות וקבועות. בנוגע ל-TEM, מספר מחקרים הדגימו את התפקיד המבני של ניצני דופן התא בהתנגדות פטרייתית 13,14,15,16, וכי השימוש בלקטינים ונוגדנים הוא שיטה מורכבת לאיתור פולימרים של פחמימות 16. עם זאת, מחקרים מראים כי מיקרוסקופיית אור היא גישה חשובה וכי הכלים ההיסטוכימיים והאימונוהיסטוכימיים מאפשרים הבנה טובה יותר של הרכב מעטפת הפפילה וההאוזטוריום ^6,7.

פטריות פתוגניות מראות שני סוגים עיקריים של אורחות חיים: ביוטרופיים ונקרוטרופיים. פטריות ביוטרופיות תלויות בתאים חיים לצורך תזונתן ואילו פטריות נקרוטרופיות הורגות את התאים המארחים, ואז חיות ברקמות המתות¹⁷. באמריקה הלטינית, חלודה של עלי קפה, הנגרמת על ידי הפטרייה Hemileia vastatrix, היא מחלה חשובה בגידולי קפה^18,19. Hemileia vastatrix מציגה התנהגות ביוטרופית, ובין השינויים המבניים שנצפו במיני קפה עמידים או בתרבויות, דווח על תגובת רגישות יתר, תצהיר של קאלוז, תאית וליגנין על דפנות התא, כמו גם היפרטרופיה של תאים¹⁴. למיטב ידיעת המחברים, הספרות אינה מדווחת על מידע על חשיבותו של פקטין בעמידות לחלודה בקפה. מצד שני, פטריות נקרוטרופיות הגורמות לצרקוספוריוזיס מכוונות לפקטין באמצעות קבוצה של אנזימים הקשורים לפירוק דופן התא, כגון פקטינזות ופוליגלקטורונאז²⁰. סרקוספוריוזיס בקפה, הנגרמת על ידי הפטרייה Cercospora coffeicola הוא גם איום גדול על גידולי קפה^21,22. פטרייה זו גורמת לנגעים נמקיים הן בעלים והן בפירות יער. לאחר החדירה, C. coffeicola מיישב רקמות צמחים דרך מסלולים תוך תאיים ובין תאיים 23,24,25.

הפרוטוקול הנוכחי חוקר את הימצאותם של מבנים פטרייתיים ופקטין על דפנות התא. פרוטוקול זה שימושי כדי לזהות את התגובה הצמחית הקשורה לפקטין (מוכתם בצבע אדום רותניום, שהוא ספציפי לקבוצות חומציות של חומצות פוליאוריוניות של פקטין), המושרה על ידי המארח באינטראקציה ביוטרופית עם פטרייה. זה גם עוזר לאמת את ההשפעה של פטריות necrotrophic על התדרדרות של דפנות התאים pectic. התוצאות הנוכחיות מצביעות על כך ששיטת ההכתמה הכפולה יעילה להבחנה בין מבנים ולשלב הרבייה של פטריות.

Protocol

1. הכנת תמיסת האגירה והריאגנטים

1. הכן 2 M cacodylate buffer על ידי הוספת 4.28 גרם של נתרן cacodylate ל 100 מ"ל של מים מזוקקים ולהתאים את ה- pH ל 7.25 עם 0.2 N HCl.
2. הכן 100 מ"ל של תמיסת התיקון של קרנובסקי על ידי ערבוב של 10 מ"ל של 25% גלוטארלדהיד מימי, 10 מ"ל של 10% פורמלדהיד מימי, 25 מ"ל של 2 M cacodylate buffer, ו 0.5 מ"ל של 0.5 M CaCl₂²⁶. להמציא את הנפח ל 100 מ"ל עם מים מזוקקים.
   הערה: ניתן לשמור את הפתרון במקרר למשך 6 חודשים.
   אזהרה: תמיסת האגירה של קקודילאט רעילה; לכן, טפל בתמיסה המקבעת במכסה אדים או בשטח פתוח. הימנעו משאיפת אדי התמיסה וללבוש כפפות בזמן הטיפול.
3. הכן תמיסת הזנה מימית של Hoagland על ידי ערבוב הדברים הבאים: 3 mM Ca(NO₃)_{2.4H 2}O, 2 mM NH₄H₂PO₄, 5 mM KH₂PO₄, 2 mM MgSO_{4.7H 2}O, 9.07 mM MNSO₄, 0.765 mM ZnSO_{4.7H 2}O, 46.4 mM H₃BO₃, 0.09 mM Na₂MoO₄. H₂O, 0.01 mM CuSO₄, ו-36 mM FeSO_{4.7H 2}O כ-iron-EDTA (חומצה טטראצטית אתילנדיאמין)²⁷.

2. דגימות צמחים וחיסון פטריות

הערה: לניסויים בעלים המושפעים מחלודה של קפה, חמישה שתילים בני חודשיים של קפה ערביקה cv. Catuaí גודלו ונשמרו בחממה במרכז לאנרגיה גרעינית בחקלאות (CENA) של אוניברסיטת סאו פאולו, פירצ'יקאבה, מדינת סאו פאולו, ברזיל.

1. לגדל צמחי קפה בעציצים מפלסטיק של 500 מ"ל מלאים בתמיסת מזון מימית של Hoagland (pH של כ-5.5) למשך 4 חודשים בתא גדילה שנשמר בטמפרטורה של 27 ± 3 מעלות צלזיוס עם פוטופריוד של 12 שעות שנוצר על ידי מנורות LED בשטף הפוטונים של 250 מיקרומול פוטונים ^{s-1 m-2}. החלף את תמיסת החומרים המזינים Hoagland מדי שבוע במשך 4 חודשים.
2. חסן ארבעה עלים מורחבים מחמישה צמחים על המשטחים האבקסיאליים שלהם עם 1 x 10³ H. vastatrix uredospores בעקבות השיטה המתוארת בהתייחסות²⁸. לאחר החיסון, יש לשמור את הצמחים במשך 48 שעות בחושך על ידי כיסוים בשקית ניילון שחורה. לקצור את הנגעים 30 יום לאחר החיסון.
3. קציר נגעים אופייניים הנגרמים על ידי Cercospora coffeicola מ Coffea ערביקה cv. צמחי Obatã הממוקמים (קואורדינטות: -22.906506126269942, -47.015075902025266) במכון הביולוגי, קמפינאס, מדינת סאו פאולו, ברזיל. לפני עיבוד הדגימה, לנתח את הנגעים בסטריאומיקרוסקופ כדי לאמת את נוכחותו של קפה C. coffeicola conidia. לאחר מכן, הר כמה שקופיות עם conidia כדי לאשר את המחלה etiology²².

3. קציר דגימות, קיבוע והתייבשות

1. באמצעות אזמל ופינצטה, לקטוף דגימת עלים של כ-10 מ"מ² באזור האמצעי של הנגע (כתמים צהובים; איור 1) ולטבול אותו ב-30 מ"ל של תמיסה מקבעת קרנובסקי (איור 1 ואיור 2A). שלב הקיבוע יכול להתרחש במקרר במשך 48 שעות.
2. במשך ארבע פעמים לפחות, העבירו את דגימת העלה לוואקום נמוך (500-600 mBar) באמצעות משאבת שמן למשך 15 דקות כל אחת כדי להגביר את החדירות של התמיסה המקבעת ברקמת העלה. בצע שלב זה באמצעות סיבוב מדגם (איור 1).
3. לאחר הקיבוע, שטפו את דגימת העלים שלוש פעמים ב-0.5 M של חיץ קקודילט (pH 7.2) מדולל במים מזוקקים במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן העבירו אותה לסדרה אתנולית מדורגת (30%, 50%, 70%, 90%, 90% (2x) ו-100% (2x)) למשך 15 דקות בכל ריכוז אתנול (איור 1 ואיור 2B).

4. הליך הטמעת היסטוריסין

1. העבר בהדרגה את הדגימות לגליקול מתקרילט (GMA) בשלושה שלבים, בהתאם להוראות היצרן. ראשית, הפוך את פתרון A על ידי ערבוב אבקת GMA (1 גרם) עם 100 מ"ל של שרף בסיסי (ערכת historesin; טבלת חומרים) תחת תסיסה מגנטית, ולאחר מכן בצע את השלבים הבאים.
   1. לטבול את הדגימות 1:2 פתרון A: 100% אתנול במשך 3 שעות.
   2. טבלו את הדגימות בפתרון 1:1 A: 100% אתנול למשך 3 שעות.
   3. לטבול את הדגימות בשרף בסיסי טהור למשך 2-4 ימים. במהלך שלב זה, העמידו את הדגימות בפני ואקום נמוך לפחות ארבע פעמים ביום למשך 15 דקות ולאחר מכן סיבוב.

5. פילמור

הערה: תהליך הפילמור דורש תבניות פלסטיק של 1.2 מ"ל, שרף בסיסי והקשחה (ראו טבלת חומרים לפרטי הערכה המסחרית).

1. ערבבו 15 מ"ל של פתרון A (שלב 4.1) עם 1 מ"ל של הקשחה בכוס עם סיבוב למשך 2 דקות כדי לייצר את פתרון הפילמור (פתרון B).
2. שים 1.2 מ"ל של תמיסת הפילמור (פתרון B) בתבניות פלסטיק. באמצעות פיק עץ, העבירו את דגימות העלים הנגעים משרף בסיסי טהור לתמיסה B (איור 2C). הימנע משימוש בפינצטה מכיוון שהם עלולים לגרום לריסוק רקמות.
3. הקפידו לכוון במהירות דגימות עלים בניצב לתבניות הפלסטיק, שכן פתרון B הופך במהירות לצמיג תוך 5 דקות. ניתן למקם יותר מדגימת עלה נגע אחת בתבנית אחת.
   הערה: מומלץ לתרגל את השלב הנ"ל מספר פעמים לפני הגשת בקשה לדוגמאות רבות. כאשר יש דגימות רבות, זמן הפילמור שונה בין התבניות והכיוון הניצב של דגימות העלים עשוי להיות קשה להשגה.
4. כאשר הכיוון הניצב של דגימות העלים מושג, המתן 30 דקות, ולאחר מכן העבר את תבנית הפלסטיק לתא פלסטיק או זכוכית המכיל ג'ל סיליקה כדי למנוע לחות. המתן 2-3 שעות לפילול.
5. לאחר שהשרף ודגימת העלים עוברים פולימר לאחר התקופה של 2-3 שעות, נתקו את הגוש שנוצר מתבנית הפלסטיק על ידי שיוף בסיס הבלוק עם קובץ שיוף. לאחר מכן, הדביקו את הבלוק לחתיכת עץ (איור 2D).

6. חתך

1. באמצעות מיקרוטום סיבובי המצויד בלהבי פלדה בקוטר 8 ס"מ (איור 2E), חתכו את הבלוק למקטעים בעובי 5 מיקרומטר. הניחו את החלקים על מגלשות זכוכית מכוסות במים מזוקקים. העבר את המגלשות עם החלקים הצפים מעל המים לצלחת חמה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס כדי לייבש ולקדם את ההדבקה של החלקים למגלשות הזכוכית.
2. לאחר הייבוש (איור 2F), סמן את שקופיות הזכוכית בשם ההפניה לבלוק ובמספר השקופית.

7. תהליך צביעה כפול

1. כסו את החלקים עם 2 מ"ל של 5% כותנה כחולה בלקטופנול (40% גליצרול, 20% פנול ו-20% חומצה לקטית במים) וחממו אותם על צלחת חמה ב-45 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (איור 3A).
2. הסירו את הצבע העודף על ידי שטיפת המגלשה שלוש פעמים בכוס מלאה במים מזוקקים (איור 3B-D).
3. כתם עם 2 מ"ל של 0.01% רותניום אדום במים למשך דקה אחת (איור 3E).
4. הסירו את הצבע העודף על ידי שטיפת המגלשה שלוש פעמים בכוס מלאה במים מזוקקים (איור 3F,G).
5. שים טיפה של מים מזוקקים על החלקים וכסה את החלקים עם כיסוי 24 מ"מ x 60 מ"מ לביצוע ניתוח מיקרוסקופיה קלה.

תוצאות

צביעת הלקטופנול הכחולה מכותנה על החלק המשובץ ב-GMA חשפה את נוכחותם של מספר מבנים פטרייתיים בין תאי מזופיל קפה ובתוךיהם באינטראקציות פטרייתיות ביוטרופיות ונקרוטרופיות.

במערכת הפתוסית הביוטרופית, כאשר היא מוכתמת בשיטת ההכתמה הכפולה, Hemileia vastatrix hyphae המכילה את דפנות התא וא?...

Discussion

העבודה הנוכחית מציגה בדיקה היסטוכימית חלופית עם כתמים כפולים כדי לחקור את הרכב הפקטין של דפנות התאים, המתמצת את האוסטוריה במערכת פאתוסיסטית ביוטרופית. המטרה היא גם להדגים את היעילות של השיטה לאיתור פטרייה נקרוטרופית ושינויים בדופן התא המושרים על ידה. כאן, פקטין של דפנות תא פרנכימה קפה יכ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blades DB80 HS	Leica	14035838383	Sectioning
Cacodylate buffer	EMS	# 11652	Fixation
Cotton Blue Lactophenol	Metaquímica	70SOLSIG024629	Staining
Formaldehyde	EMS	#15712	Fixation
Glutaraldehyde	EMS	#16216	Fixation
Historesin Kit	Technovit /EMS	#14653	Historesin for embedding
Hot plate	Dubesser	SSCD25X30-110V	Staining
Microscopy	Zeiss	#490040-0030-000	Image capture
Microtome (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Sectioning
Plastic molding cup tray	EMS	10176-30	Staining
Ruthenium red	LABHouse	#006004	Staining
Software Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Image capture
Vaccum pump	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	Fixation